雙重介導腦靶向脂質體增強荷載阿霉素的體外血-腦脊液屏障滲透率

黑 玉 梅 子 陳 陽 滕彬宏

血-腦脊液屏障(blood brain barrier, BBB),是由腦微血管內皮細胞(brain microvascular endothelial cells, BMVEC)及其細胞間緊密連接(tight junction, TJ)、毛細血管基膜以及嵌入其中的周細胞、星形膠質細胞和狹小的細胞外間隙共同組成的一個嚴密結構[1]。BBB作為一個生理性屏障,對物質的進入具有選擇性,能夠阻止大部分有害物質進入腦部,維持腦部內環境的穩定。但是同時BBB也限制了藥物進入腦部發揮對于腦部疾病的治療作用[2]。如何提高藥物的BBB滲透率是腦部疾病治療中有待于解決的關鍵問題。設計研發具有高BBB滲透率的新的藥物分子十分困難。而高效的腦靶向藥物遞送系統,為提高現有治療藥物的BBB滲透率提供了可能[3]。

阿霉素(doxorubicin, DOX)是一種廣譜的抗腫瘤治療藥物,目前在多種腫瘤的治療中使用,包括乳腺癌、肺癌、急性粒細胞性白血病、前列腺癌等[4]。但是由于DOX的BBB滲透率較低,難以進入腦部,極大的限制了其在腦部腫瘤例如腦膠質瘤等治療中發揮作用[5]。如何提高DOX的BBB滲透率,是其在腦部腫瘤治療中所需要解決的重要問題。前期筆者利用腦靶向多肽RVGP以及細胞穿透肽(G2R9, R9)修飾空間穩定脂質體(sterically stabilized liposome, SSL),構建了雙重介導(配體介導與吸附介導)的腦靶向脂質體(RVGPR9-SSL)[6～9]。RVGPR9-SSL有望通過雙重介導作用,顯著增強所荷載的藥物的BBB滲透率,是非常有前景的腦部藥物遞送載體。為了探究RVGPR9-SSL對于DOX的遞送能力,本研究將DOX包載在RVGPR9-SSL中(DOX@RVGPR9-SSL),在體外水平,初步考察了DOX@RVGPR9-SSL的BBB滲透率。此外,本研究創新性地采用熒光共振能量轉移(fluorescence a resonance energy transfer, FRET)實驗評價了跨越BBB后RVGPR9-SSL的完整性,并且對比研究了給藥前后BBB的完整性,通過這兩方面的研究對RVGPR9-SSL的安全性進行了充分考察。本研究通過體外BBB滲透率的考察以及安全性評價,為RVGPR9-SSL在腦靶向藥物遞送方面的應用提供了有力的數據支持,有望為腦部疾病的治療提供創新性的策略。

材料與方法

1.試劑與儀器:高糖DMEM培養基與0.25%胰酶-EDTA均購自中科邁晨(北京)科技有限公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;激光共聚焦小皿(35mm/20mm)購自北京華力德科技有限公司;Hoechst33342、DiO、DiI均購自北京中科科奧生物科技有限公司;BMVEC細胞由中日友好醫院友情提供;Millicell-ERS EVOM2細胞電阻儀購自美國Millipore公司;熒光分光光度計購自美國瓦里安公司;細胞培養箱購自上海力申科技有限公司;渦旋振蕩器購自海門其林貝爾儀器有限公司;超聲波細胞破碎儀購自寧波新芝生物科技有限公司;流式細胞儀購自美國BD公司;SW-CJ-1B超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術有限公司;TD4-WS離心機購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司;激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司。

2.DOX@RVGPR9-SSL制備:精密稱取適量的 SPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-RVGPR9, 按照一定比例加入茄形瓶中(SPC∶Chol∶DSPE-PEG2000∶DSPE-PEG2000-RVGPR9=100∶50∶6∶2,mol/mol),用氯仿溶解,渦旋混勻,置于旋轉蒸發儀上,于37℃水浴下旋干有機溶劑,直至在茄形瓶底部形成均勻的脂質薄膜,再持續抽真空30min,除去殘存的有機溶劑。然后向茄形瓶中加入2ml pH 4.0的檸檬酸緩沖液(300mmol/L),置于渦旋振蕩器上渦旋震蕩,后置37℃的水浴中超聲30min直至水化完全,獲得載體RVGPR9-SSL脂質體。隨后用0.5mol/L碳酸鈉溶液調節脂質體pH至7.5～7.8。在50℃水浴預熱下,加入DOX水溶液(DOX/SPC=1/20, w/w)攪拌30min,使脂質體充分包載DOX,即得到DOX@RVGPR9-SSL。之后柱分離法檢測其包封率。

3.體外BBB模型構建與評價:體外培養BMVEC細胞,將培養瓶中融合至90%的BMVEC細胞,用專用培養基消化后,將BMVEC細胞以1×105個/孔的密度接種到Transwell上室中,之后將Transwell培養板轉移到5% CO2、37℃孵箱中培養3～7天,直至BBB模型建立。培養過程中每兩天更換1次培養基。通過掃描透射電鏡(scanning transmission electron microscope, SEM)觀察細胞間是否形成緊密連接,利用EVOM電阻測定儀檢測Transwell上下室間的電阻值即TEER,并通過4h滲漏試驗共同判斷BBB模型是否建立成功。

4.RVGPR9-SSL完整性考察:為了方便考察跨越BBB后RVGPR9-SSL的完整性,在RVGPR9-SSL中包載了FRET對(DiO+DiI),分別制備了3種熒光脂質體DiO@RVGPR9-SSL、DiI@RVGPR9-SSL、(DiO+DiI)@RVGPR9-SSL。向已經成功構建體外BBB模型的Transwell培養板中各孔中加入這3種熒光脂質體,然后將Transwell培養板放于5% CO2、37℃孵箱中孵育4h。孵育結束后收集Transwell下室中的液體,利用激光共聚焦顯微鏡與熒光分光光度計進行檢測。

5.DOX@RVGPR9-SSL給藥后BBB完整性考察:在DOX@RVGPR9-SSL給藥后,再次測量各孔跨膜電阻(transmembrane resistance value, TEER)值,觀察孵育4h后藥液的滲漏情況,并利用SEM觀察細胞間的緊密連接,確定孵育4h后BBB的完整性。

結 果

1.DOX@RVGPR9-SSL的包封率:通過柱分離法檢測DOX@RVGPR9-SSL(97.25%±0.60%)以及對照組DOX@SSL(96.79%±0.53%)的包封率。結果表明,脂質體的包封率均>95%,說明通過上述方法DOX可以成功地包載在脂質體中。

2.體外BBB模型評價:4h滲漏實驗表明Transwell中液面差可維持0.5cm;利用EVOM電阻測定儀測定的TEER值>200Ω·cm2。通過SEM觀察細胞狀態(圖1)可見BMVEC細胞排列致密,細胞間存在著明顯的緊密連接。說明本研究中體外BBB模型成功建立,可用于后續研究考察。

3.RVGPR9-SSL完整性:為了方便檢測RVGPR9-SSL跨越BBB后的完整性,筆者在RVGPR9-SSL中包載了FRET對(熒光探針DiO與DiI)。包載熒光探針的RVGPR9-SSL稀釋至合適濃度后,與BMVEC細胞共孵育。BMVEC細胞對RVGPR-SSL的攝取的結果,如圖2所示,DiO@RVGPR9-SSL攝取進入BMVEC細胞后呈現清晰的綠色熒光,DiI@RVGPR9-SSL攝取進入BMVEC細胞后呈現紅色熒光,而混合包載兩種熒光探針的脂質體(DiO+DiI)@RVGPR9-SSL攝取進入BMVEC細胞后呈現紅色熒光增強,而綠色熒光幾乎消失的現象,即FRET效應,這說明兩種熒光探針共包載在RVGPR9-SSL中時距離<10nm[10]。將包載熒光探針的3種脂質體分別與構建的BBB模型進行孵育,孵育4h后,收集Transwell下室液體與BMVEC細胞共孵育,BMVEC細胞的攝取結果如圖2所示,混合包載兩種熒光探針的RVGPR9-SSL,仍然存在FRET現象,兩種熒光探針的距離<10nm,說明脂質體在跨越BBB后仍然保持著較好的完整性。因此,以RVGPR9-SSL作為載體包載DOX,可以有效避免跨越BBB時因載體破裂而造成的DOX泄露,從而降低毒性不良反應。

在3種包載熒光探針的脂質體與BBB共孵育4h后,收集Transwell下室液體,用熒光分光光度計在相應的激發波長下進行熒光光譜掃描,結果如圖3所示:共包載DiO與DiI的RVGPR9-SSL,存在著FRET效應,即供體DiO的熒光幾乎消失,受體DiI的熒光增強,與激光共聚焦顯微鏡結果一致,說明兩種雙重介導脂質體跨BBB模型轉運過程中,脂質體結構保持完整,未發生熒光探針的泄露。

圖3 3種包載熒光探針的脂質體跨BBB后Transwell下室液體的熒光圖譜

4.DOX@RVGPR9-SSL給藥后BBB完整性:給藥前BBB的形態如圖1所示,BMVEC細胞間存在著明顯的緊密連接。DOX@RVGPR9-SSL與BBB共孵育4h后,BBB的形態如圖4所示。結果表明,在DOX@RVGPR9-SSL與BBB共孵育4h后,體外BBB模型仍然保持著較好的完整性,細胞間仍然存在著明顯的緊密連接。4h滲漏實驗表明,DOX@RVGPR9-SSL給藥后,Transwell上下室可以維持0.5cm的液面差,同時TEER值>200Ω·cm2,也表明DOX@RVGPR9-SSL與BBB共孵育后,并未破壞BBB的結構,體外BBB模型在孵育過程中始終保持著較好的完整結構。這些結果說明DOX@RVGPR9-SSL具有較好的安全性,給藥后不會影響BBB的完整性。

圖4 DOX@RVGPR9-SSL孵育4h后BBB的形態圖(×1500)

5. DOX@RVGPR9-SSL的 BBB滲透率:給藥后0、1、2、3、4h分別取Transwell下室液體,按照上述實驗方法測定DOX@RVGPR9-SSL的 BBB滲透率。以游離DOX以及普通脂質體組(DOX@SSL)作為對照組,結果如圖5所示。游離DOX的4h累積BBB通透率僅為2.7%,DOX@SSL的4h累積BBB通透率僅為5.9%,而DOX@RVGPR9-SSL的4h累積BBB通透率為10.3%,較DOX組提高了3.8倍,DOX@SSL提高了1.7倍,表明該雙重介導的脂質體作為載體,可以顯著提高所包載DOX的BBB滲透率,并且DOX@RVGPR9-SSL的BBB滲透率顯著高于DOX@SSL,說明雙重介導的配體修飾可以顯著增強脂質體跨BBB效率。綜合上述結果,RVGPR9-SSL作為載體能夠顯著增強所包載藥物的BBB滲透率,是極具前景的腦部藥物遞送載體。

圖5 脂質體跨體外BBB模型的累積滲透率

討 論

目前世界人口老齡化問題日趨嚴重,中樞神經系統的退行性病變、腦部腫瘤以及腦部炎癥等疾病嚴重威脅著人類的健康[11]。DOX是一種廣譜的抗腫瘤治療藥物,但是由于其BBB滲透率較低,難以進入腦部,極大限制了其在腦部腫瘤例如腦膠質瘤等治療中發揮作用[5]。如何提高DOX的BBB滲透率,是其在腦部腫瘤治療中所需要解決的重要問題。研究發現,普通長循環脂質體雖然可以增加DOX的BBB滲透率,但是效果并不理想[8]。針對這一問題,前期筆者利用腦靶向多肽RVGP以及細胞穿透肽(R9)修飾脂質體,構建了雙重介導(配體介導與吸附介導)的腦靶向脂質體(RVGPR9-SSL)[6～8]。為了考察RVGPR9-SSL能否有效向腦部遞送DOX,本研究在體外水平,初步對DOX@RVGPR9-SSL的BBB滲透率進行了考察。

在體外成功分離培養BMVEC的基礎上,研究者構建了體外BBB模型,并不斷發展和完善,為研究中樞神經系統疾病的發生、發展過程以及藥物治療提供了有力工具[12]。目前BBB模型包括BMVEC單層細胞模型、BMVEC與星形膠質細胞共培養模型、BMVEC、星形膠質細胞與周細胞共培養模型以及原代培養BMVEC細胞與周細胞共培養模型[13～16]。其中,BMVEC細胞單獨培養模型,基本具備BBB的屏障功能,并且該模型構建方法比較簡單,需要時間短,操作過程可重復,目前得到了廣泛應用[17]。本研究構建了由BMVEC細胞單獨培養而構建的BBB模型,并通過4h滲漏實驗、SEM觀察細胞間的緊密連接以及TEER的檢測,確證了體外BBB模型成功構建,可以用于DOX@RVGPR9-SSL的BBB滲透率考察。

本研究發現,DOX@RVGPR9-SSL的BBB累積滲透率是游離DOX的3.8倍,是DOX@SSL的1.7倍,表明RVGPR9-SSL可以顯著提高所包載DOX的BBB滲透率,是非常具有研究前景的腦靶向藥物遞送載體,并且通過FRET實驗的結果,發現該腦靶向脂質體RVGPR9-SSL在跨越BBB后,可以保持較好的完整性,不會產生藥物的泄露,具有較好的安全性。在DOX@RVGPR9-SSL跨越BBB后,BBB模型仍然可以保持較好的完整性,表明DOX@RVGPR9-SSL給藥后不會破壞BBB的結構,也預示著其具有較好的安全性。

綜上所述,本研究表明,前期構建的RVGPR9-SSL可以顯著提高DOX的BBB滲透率,并且具有較好安全性,是非常具有前景的腦靶向藥物遞送載體,為DOX的腦部遞送提供了新的策略。今后可以在體內水平上進一步研究其BBB滲透率以及腦內病灶部位的藥物濃度,從而廣泛應用于臨床中。