基于礦物元素指紋圖譜鑒定陳皮產地的方法研究

賴曉娜，羅輝泰，張春華，黃錦沛，陳怡珊，李 樂，周 熙，黃 芳，吳惠勤*

（1.廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學測量與應急檢測技術重點實驗室，廣東省中藥質量安全工程技術研究中心，廣東 廣州 510070；2.江門市新會區動物防疫監督所（江門市新會區農產品質量安全監督檢驗測試中心），廣東 江門 529199）

陳皮（Citrus reticulata blanco），又名橘皮，由蕓香科植物橘成熟后的果皮干燥制得，有開氣行痰、止嘔止咳、健脾和胃的功效。主要產地為廣東、四川、湖南等。陳皮分為新會陳皮及其他陳皮，其中以新會陳皮質量最優，價格最高，是第一批被列入《廣東省嶺南中藥材保護條例》的嶺南中藥材。目前市場上存在不良商家以其他陳皮冒充新會陳皮、以假亂真的現象。因此，建立一種快速鑒別陳皮產地的方法十分必要。

陳皮的產地鑒別目前主要使用高效液相色譜指紋圖譜［1］、氣相色譜-質譜聯用［2］、成分含量差異研究［3］、紅外光譜［4］、次生代謝產物研究［5］等方法。這些方法大多僅能篩選得到少數幾個有效差異指標，無法全面反映不同產地差異。同時有機成分在加工、貯藏中極易變化、損失，造成溯源效果不佳。

植物生長過程中通過根莖吸取土壤中的礦物元素，某一產區植物中的礦物元素與其產地的土壤礦物元素存在極強的相關性［6］，因此帶有地域特征的礦物元素含量和種類是植物產地溯源的重要指標。礦物元素作為常用的溯源指標之一，已廣泛應用于松江大米［7］、黑龍江黃豆［8］、銀耳［9］、生姜［10］的產地鑒別中。李富榮等［11］利用陳皮礦物元素含量結合多元統計分析構建了陳皮產地的判別模型，彭政等［12］構建了基于礦物元素的神經網絡模型進行陳皮產地判定。以上兩種方法均采用了數據深度分析的化學計量法，不利于推廣使用。礦物元素指紋圖譜通過將數字轉化為圖形，簡化了分析步驟，實現了數據的可視化，已用于西洋參［13］、茶葉［14］的產地研究。

本研究以新會、廣西、湖南3個不同產地的陳皮樣品為對象，對陳皮中的51種礦物元素進行分析，采用電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）測定陳皮中的礦物元素含量，并通過元素分類和縮放系數計算，建立了不同產地陳皮中礦物元素的指紋圖譜。通過構建標準指紋圖譜并進行相似度分析，建立了陳皮產地的鑒別模型。所建立的模型可對新會陳皮和其他陳皮進行鑒別，為陳皮產地溯源提供了技術支撐，并為政府部門、市場監督提供了有效方法。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

42批陳皮樣品，其中包括新會陳皮24批（XH-1~XH-18用于訓練集，XH-19~XH-24用于驗證集），湖南陳皮9 批（HN-1~HN-9），廣西陳皮9 批（GX-1~GX-9）。所有陳皮樣品均于60 ℃烘干2 h，粉碎過篩后裝入密封袋于干燥塔中保存。

P 單元素標準溶液（1 000 μg/mL），Ca、K、Mg、Na 元素標準溶液（1 000 μg/mL）（北京壇墨質檢科技有限公司）；Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、Tl、V、Zn 元素標準溶液（100 μg/mL），La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Y 元素標準溶液（100 μg/mL）（國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；Ag、Al、As、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Se、Sr、Tl、U、V、Zn 元素標準溶液（100 μg/mL，安捷倫科技有限公司）；Sc、Mo、Hg、Rh、Re 元素標準溶液（1 000 μg/mL，國家鋼鐵材料測試中心）；UP級HNO3（68%，蘇州晶瑞化學股份有限公司）。

1.2 儀器與設備

Agilent 7700x ICP-MS 電感耦合等離子體質譜儀（美國安捷倫公司），G-160微波消解儀，WX-8000趕酸器（上海屹堯儀器科技發展有限公司），TP-214丹佛電子天平（美國丹佛儀器公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品消解陳皮樣品經粉碎后精密稱量約0.5 g于聚四氟乙烯消解管中，準確加入濃硝酸5 mL并靜置30 min，隨后于200 ℃微波消解儀中消解25 min，冷卻后取出消解管，于120 ℃趕酸約20 min，定量轉移消解液至25 mL具塞比色管中，超純水定容。取消解液5 mL至100 mL具塞比色管中，用超純水定容，用于常量元素的含量測定。按上述步驟制作試劑空白。

1.3.2 ICP-MS 工作條件射頻功率：1 550 W；采樣深度：8 mm；霧化器：MicroMist；霧化室溫度：2 ℃；等離子體氣（氬氣）：15.0 L/min，輔助氣（氬氣）：0.8 L/min，載氣（氬氣）：1.03 L/min，碰撞氣（氦氣）：4.3 mL/min（碰撞模式）。內標元素Rh和Re通過T型三通管在線引入等離子體，蠕動泵轉速為0.1 r/s。

1.3.3 元素指紋圖譜建立采用ICP-MS 測定陳皮元素含量，并使用SIMCA 進行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），以SPSS20.0 進行方差分析，篩選有明顯差異的元素作為溯源指標，同時對不同數量級含量進行系數縮放。使用origin 2019b軟件作圖，將元素按VIP值（Variable important for the projection）由大到小排序，以測定元素為橫坐標，相對含量為縱坐標，構建各樣品的礦物元素-含量關系圖，并以各元素含量的均值建立各地陳皮的標準指紋圖譜。

1.3.4 相似度評價利用SPSS 22.0軟件分析指紋圖譜的相似度，選擇夾角余弦距離進行分析。計算原理如下：

式中，x為法向量，|x| 為向量的模，cosθ表示向量x與向量y之間的夾角，其值越接近1 說明兩個向量越相似。

1.3.5 產地鑒別相似度閾值設定為某地指紋圖譜與標準指紋圖譜相似度的最小值，鑒別未知產地陳皮時，計算其與礦物元素標準指紋圖譜的相似度，相似度高于閾值，則判定屬于某地。

2 結果與討論

2.1 不同產地陳皮的礦物元素含量差異分析

土壤中礦物元素的種類和含量具有特征性，植物中的礦物元素需要通過外界吸收并在生長過程中不斷積累［15］。土壤是植物吸收、積累、轉移元素的最直接來源，“基巖-土壤-植物系統”為特色農產品的元素遷聚規律提供了科學支撐，元素在系統內的遷移特征也揭示了特色農產品與地球化學特征的內在聯系，探尋植物內元素的地域特征以溯源道地藥材或農產品的方法被證明具有廣泛應用價值［16］。新會地處沖積平原帶，匯聚西江、潭江，處于咸淡水交界，有研究指出，新會匯聚了大量隨沉積物遷徙的重金屬元素和營養元素，有大量元素高背景的特征［17］。

新會、湖南和廣西3個產地陳皮中礦物元素的平均含量及標準偏差（SD）結果見表1。除少數微量元素如Sn、Hg、Bi在新會樣品中未檢出外，其余元素在3 地陳皮中均被檢測到，實際納入統計的礦物元素共48種。

表1 不同產地陳皮樣品中礦物元素的含量Table 1 Mineral element content in citrus reticulata blanco samples from different regions

生命必需元素有29種，按體內含量的高低又分為常量元素和微量元素。常量元素有C、H、O、N、P、S、Cl、K、Ca、Na、Mg 11種由表1可知，實驗測定的5種常量元素（P、K、Ca、Na、Mg）中，K含量最高，為9.5~13.7 g/kg。其中，新會陳皮中K 含量最高，廣西和湖南次之，且三地陳皮中的K 含量差異顯著。

微量元素指占生物體總質量小于0.01%的元素共有18種。但由于實驗購置的標準溶液不全，僅測定15 種微量元素，微量元素（Fe、Cu、Zn、Co、Mn、Cr、Se、Ni、Mo、V、Sn、Sr、B、Rb、As）的含量測定結果顯示，Fe 元素含量占第一位，為52.1~90.3 mg/kg，Mn、Cu、Zn 元素的含量也達到 mg/kg級，且新會陳皮中Cu的含量遠高于其他兩地，但新會陳皮中Se、Mo的含量僅為30 μg/kg。

稀土元素（Ce、La、Nd、Y、Pr、Gd、Sc、Sm、Dy、Er、Eu、Yb、Tb、Ho、Tm、Lu）的含量測定結果顯示，各地陳皮中稀土元素的含量均低于mg/kg 級別，其中，Ce、La、Nd 元素的含量依次降低。雖然新會陳皮中這3種元素的含量均高于其他兩地，但其間不具有顯著差異。

重金屬及有害元素（Cu、Pb、As、Cd、Hg）的含量測定結果顯示，新會陳皮中Cd 元素含量高達20.71 μg/kg，與廣西及湖南陳皮（含量＜10 μg/kg）間呈顯著差異，其余重金屬元素含量則差別不大。

對于其他元素，3 地陳皮中Ba、Ga 的含量均較高，達到 mg/kg 級別，且具有顯著性差異。新會陳皮中的Ba、Ga元素含量遠低于廣西和湖南陳皮。

上述結果表明，新會陳皮的礦物元素分布特征與新會土壤部分重金屬及有益元素呈強度富集的土壤元素分布特征基本協同［17］。

各產地陳皮對土壤中礦物元素的吸收富集程度不同，其礦物元素含量及組成具有區域性特征。為進一步分析各產地特征在陳皮產地判別中的意義與價值，通過SIMCA軟件建立了不同產地陳皮的PLSDA 分類模型，對產地差異進行可視化趨勢分析。如圖1 所示，該模型將陳皮明顯分為3 類，不同產地表現出各自的分布趨勢，且擬合程度良好（R2Y=0.88，Q2=0.756），說明各產地陳皮樣品間差異明顯，可進行區分。通常使用VIP 值來說明變量與分類的重要性，VIP 值越大，該元素在產地間的差異越顯著，各變量的VIP 值如表2所示。為篩選導致地區差異的重要影響因素，以VIP 值大于1為指標，得到可區分產地的重要礦物元素為：Na、Mg、Al、K、Ca、Sc、Ti、V、Mn、Fe、Co、Cu、Ga、Sr、Y、Cd、Sb、Ba、Tb、Dy、U。

圖1 不同產地陳皮的PLS-DA散點圖Fig.1 Scatter plot of citrus reticulata blanco in different origins

表2 PLS-DA模型中不同礦物元素的VIP值Table 2 VIP values of mineral elements in PLS-DA model

2.2 礦物元素指紋圖譜的建立

礦物元素含量是一組獨立的離散數據，無法直接得到指紋圖譜。將礦物元素按VIP 值大小進行排序，以礦物元素為橫坐標，礦物元素含量為縱坐標，構建得到礦物元素-含量關系圖。從圖2可知，新會陳皮中礦物元素的含量差別大，其中鉀元素含量高達107μg/kg，在含量關系圖中占主導地位。但單一的峰形導致礦物元素指紋圖譜無法反映陳皮不同產地間的差別。鑒于此，本文對不同礦物元素含量進行系數縮放。

為消除微量元素與高含量元素的含量差異引起的誤差，將礦物元素根據平均含量大小分為6 類，不同類別的縮放系數不同，具體分類及縮放系數見表3。同時，為了使地區差異更為明顯，選取VIP值大于1（表2），方差分析p值小于0.05（表1）的元素進行分析（共9 種，分別為Sr、Mg、Cu、K、Ga、Mn、Ba、Na、Cd），構建指紋圖譜，基于18 批新會陳皮繪制的礦物元素指紋圖譜見圖3。整體而言，各樣本之間存在含量差異，但指紋圖譜曲線趨勢大致相同，礦物元素分布特征相似，因此可基于該趨勢特征進行產地溯源。

圖3 新會陳皮指紋圖譜Fig.3 Element fingerprint of Xinhui citrus reticulata blanco

表3 礦物元素分類和縮放系數Table 3 Mineral element classification and scale factors

為消除個例樣品的影響，以18批新會產陳皮中礦物元素的平均含量作為該地陳皮中礦物元素的標準含量，構建新會陳皮的礦物元素標準指紋圖譜，見圖4。

圖4 不同產地陳皮中礦物元素的標準指紋圖譜Fig.4 The standard fingerprint of mineral elements from different producing areas

2.3 陳皮產地鑒別模型的建立

將指紋圖譜向量化，通過計算余弦相似性對陳皮礦物元素指紋圖譜進行相似度評價?；谛聲惼さV物元素標準指紋圖譜，采用向量相似法計算18批新會陳皮礦物元素指紋圖譜與標準指紋圖譜的余弦相似度，結果見表4，相似度為0.941~0.998。定義相似度閾值為某樣品指紋圖譜與標準圖譜相似度的最小值，得到新會陳皮礦物元素指紋圖譜的相似度閾值為0.941。通過構建不同產地礦物元素指紋圖譜并計算其與新會陳皮標準指紋圖譜的相似度進行產地判別，相似度高于閾值0.941，可判定屬于新會陳皮，反之不屬于。

表4 18批新會陳皮礦物元素指紋圖譜與標準指紋圖譜的相似度Table 4 Similarity between 18 batches of Xinhui samples with the Xinhui standard fingerprints

2.4 以元素指紋圖譜鑒定陳皮產地

為了驗證所建鑒別模型的準確性，選取新會陳皮6 批、廣西陳皮9 批、湖南陳皮9 批作為驗證樣品，建立各驗證樣品的礦物元素指紋圖譜，并計算其與新會陳皮標準指紋圖譜的相似度，結果見表5。其中，22批樣品判斷正確，編號XH-22的樣品誤判為非新會陳皮，編號GX-6的樣品誤判為新會陳皮，產地判別正確率為91.6%。

表5 實際樣品驗證結果Table 5 Validation results of actual samples

雖然新會陳皮納入模型組的批次較少，導致相似度閾值存在偏差，但在相同的測量條件下，建立的礦物元素指紋圖譜仍能有效判別陳皮產地。采用相同方法建立了廣西和湖南產地陳皮的標準指紋圖譜，結果顯示，廣西陳皮與新會陳皮標準指紋圖譜的相似度較高。3地陳皮的標準指紋圖譜見圖4。

3 結 論

通過分析新會、廣西、湖南3 地陳皮中的51 種礦物元素含量及其組成特征，選用不同產地陳皮中存在顯著性差異的9 種元素建立了各產地陳皮礦物元素指紋圖譜和新會陳皮標準指紋圖譜。通過計算各產地陳皮礦物元素指紋圖譜與新會陳皮標準指紋圖譜之間的相似度，進行樣品產地溯源。對24批未知產地陳皮進行產地判別，正確率為91.6%，方法可用于陳皮的產地溯源。但該研究建立的新會陳皮標準指紋圖譜僅能用于判斷未知產地陳皮樣品是否來自新會，具體產地判別及陳皮生長儲存年限對元素含量及標準指紋圖譜的影響有待進一步研究。