水稻花粉小肽鋅指蛋白基因OsFLZ13 功能研究

張麗潔 周海宇 MUHAMMAD Zeshan MUNSIF Ali Shad 楊明沖李 波 韓世健 張翠翠,3 胡利華,3,* 王令強,*

1 廣西大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室, 廣西南寧 530004; 2 廣西大學農學院, 廣西南寧 530004; 3 廣西大學生命科學技術學院, 廣西南寧 530004

鋅指蛋白是一種重要且結構多樣、功能廣泛的蛋白質, 鋅指蛋白中的鋅離子由半胱氨酸和組氨酸殘基結合[1]。根據含有的半胱氨酸和組氨酸殘基的位置和數量, 鋅指蛋白可分為C2H2、C2HC、C2HC5、C2C2、CCCH、C3HC4、C4、C4HC3、C6 和C8 等類型[2], 它們與轉錄調控、DNA修復、細胞增殖和組織發生等生物學過程相關。

FCS序列基序(zf-FCS)是一類高度差異化的C2C2型鋅指, 存在于動物、植物、原核生物和病毒中。未知功能581 結構域(DUF581)是zf-FCS型鋅指中的一種植物特異性結構域, 對植物的生長發育和應對逆境脅迫起著重要的作用[3]。研究人員在衰老相關的增強子捕獲實驗中鑒定出第一個含有該結構域的蛋白,將該結構域命名為FCS樣鋅指(FLZ)或未知功能581結構域(DUF581)[4]。該結構域大約含有70 個氨基酸殘基, 由相同的CX2CX17-19FCSX2C基序組成。隨后的研究表明, 大多數FLZ家族基因的表達受細胞能級的調節, 含在能量不足下的正向調控基因和在能量充裕下的負向調控基因。SnRK1-FLZ蛋白相互作用與糖和能量信號以及應激反應的生物過程密切相關[5]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中, DUF581 蛋白與擬南芥的SnRK1α亞基(AKIN10/11)相互作用, 形成不同的同工酶復合物[6]。擬南芥FCS樣鋅指(FLZ)蛋白家族的2 個成員FLZ6 和FLZ10 蛋白, 是SnRK1 的抑制因子, 調控擬南芥的生長和對脫落酸(ABA)的響應[7]。進一步的研究指出, FLZ6 和FLZ10 蛋白抑制SnRK1信號傳導, 從而參與雷帕霉素靶標(TOR)信號傳導的激活, 這種調節對植物生長和抵御逆境環境具有廣泛的影響[8]。此外, 小麥中FLZ家族基因TaSRHP的異位過表達增強了擬南芥對鹽和干旱脅迫的耐受性[9]。敲除擬南芥FLZ家族基因MARD1的突變體, 能夠抵抗ABA, 調控種子休眠。與野生型種子相比, 突變體種子在添加外源ABA培養基中的萌發速度更快[10]。最新的研究通過計算機分析, 預測FLZ蛋白具有保守的固有無序區域(IDR), FLZ 結構域對于介導與SnRK1α亞基的相互作用至關重要, 而N末端的IDR促進了與SnRK1 的β和βγ亞基的相互作用[11]。

目前關于FLZ基因家族的研究主要集中在擬南芥上, 在水稻中FLZ家族基因特征特別是功能研究還較少。最近研究表明OsFLZ18與SnRK1A相互作用, 調節水稻耐澇性正調節因子αAmy3的表達[12]。還有研究發現,OsFLZ18調控水稻抽穗開花, 超量表達導致水稻抽穗期延遲, 抑制了植株中Ehd1、Hd3a和RFT1等基因的表達, 在水稻生長發育和逆境應對過程中具有重要的作用[13]。OsZFP6參與水稻干旱和鹽脅迫逆境應答的調節, 過表達可顯著提高水稻對干旱和鹽脅迫的耐受能力[14]。此外, 鋅指蛋白OsBBX24正調控水稻響應熱脅迫, 提高對熱脅迫的耐受性[15]。這些研究表明, 鋅指蛋白可用于遺傳改良, 調控水稻生長發育, 提高水稻逆境適應能力。在水稻中發現的FLZ基因家族的一些基因主要調控抗逆性(如干旱、鹽脅迫、熱脅迫等), 但調控雄性發育的研究還鮮見報道。

本研究分析了水稻FLZ鋅指蛋白家族的蛋白質理化性質、保守結構域、基因結構、順式作用元件以及家族成員在各生長發育時期組織的表達模式。對OsFLZ13基因進行了表型分析和功能研究, 發現osflz13突變體花粉育性異常, 結實率顯著降低, GUS染色表明OsFLZ13基因在花藥發育后期表達, 亞細胞定位結果顯示OsFLZ13蛋白在質膜和細胞核表達。研究結果可為鋅指蛋白基因家族的功能研究提供參考, 為研究OsFLZ13功能建立基礎, 對水稻的雜交育種有重要意義。

1 材料與方法

1.1 水稻FLZ 家族基因成員的鑒定及其蛋白質理化性質分析

利用Rice Genome Annotation Project (RGAP)(http://rice.uga.edu/index.shtml)網站下載水稻的蛋白質文件, 版本為version_7.0。以擬南芥(Arabidopsis thaliana) 18個、大豆(Glycinemax) 37個、短柄草(Brachypodiumdistachyon) 26個、玉米(Zeamays)29個、大麥(Hordeumvulgare) 16個FLZ蛋白為參考序列[16], 使用TBtools[17]的Blast功能對下載的水稻蛋白質文件進行檢索, 鑒定獲得水稻FLZ家族基因成員。再通過NCBI-CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)、PFAM (http://pfam.xfam.org/)和SMART (http://smart.embl.de/)這3個在線工具進行結構域分析, 篩選出包含FLZ結構域的基因作為水稻FLZ基因家族成員。使用RGAP查找水稻FLZ家族基因所在的染色體、核酸長度、蛋白質長度、蛋白質分子量, 使用Expasy (https://www.expasy.org/)分析蛋白質一級結構的不穩定系數、脂肪族指數、平均疏水性。水稻FLZ基因家族成員命名參考The Rice Annotation Project (RAP-DB) (https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)中的命名標準。

1.2 水稻FLZ 蛋白保守基序、保守結構域和基因結構分析

通過在線網站MEME[18](http://meme-suite.org/)分析水稻FLZ 蛋白的保守基序, 設置查找20 個寬度為6～50 個氨基酸的基序, 最大E-value 為10。通過NCBI-CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)下載水稻FLZ 結構域分析結果。根據 RGAP 下載的水稻基因組注釋文件, 版本為version_7.0, 分析水稻 FLZ 家族基因結構。使用TBtools 中的Gene Structure View (Advanced)工具對保守基序、保守結構域和基因結構可視化。

1.3 水稻FLZ 家族基因啟動子的順式作用元件預測

根據RGAP 下載的水稻基因組注釋文件, 版本為version_7.0, 提取29 個水稻FLZ 家族基因起始密碼子(ATG)上游2000 bp 的啟動子序列, 提交至Plant CARE[19]網站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/), 預測順式作用元件及其潛在的功能, 并通過TBtools 可視化。

1.4 水稻FLZ 家族基因的表達分析

利用水稻數據庫Collection of Rice Expression Profiles (CREP) (http://crep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.pl),分析了水稻FLZ在明恢63不同組織、不同生長時期和圓錐花序發育不同階段的表達水平, 同時分析了OsFLZ13在明恢63 (Minghui 63, MH63)、珍汕97(Zhenshan 97, ZS97) 2個品種中不同組織中的表達。通過Origin聚類分析生成基因表達熱圖。

1.5 亞細胞定位實驗

使用Wolf PSORT[20]和CELLO[21]在線網站對OsFLZ13 蛋白的亞細胞定位進行預測。從水稻中花11 擴增OsFLZ13基因編碼序列(CDS) (不含終止密碼子), 并在CaMV35S 啟動子的控制下與含有增強型綠色熒光蛋白(eGFP)的pD1301S 載體融合, 構建35S::OsFLZ13::eGFP 重組表達載體。將重組表達載體導入根癌農桿菌(EHA105), 根據Kokkirala 等[22]的方法轉入4～6 周的煙草葉片表皮細胞中。注射36～48 h 后, 用FluoViewFV3000 共聚焦顯微鏡(Olympus,日本)觀察亞細胞定位結果。

1.6 組織定位重組載體pCAMBIA1381Z-OsFLZ13和基因編輯載體PHK1-Cas-U3-OsFLZ13 的構建

通過RGAP 下載OsFLZ13基因ATG 前2000 bp,用表1 中的引物OsFLZ13-GUS 從中花11 的DNA擴增啟動子序列, 選擇BamH ? 和EcoR ? 兩個酶切位點, 與含有GUS 的載體pCAMBIA1381Z 融合, 構建pCAMBIA1381Z-OsFLZ13重組表達載體。轉化DH5α 感受態細胞, 平板培養, 單菌落測序后采用農桿菌介導法轉化中花11 愈傷, 經培養獲得轉基因株系。利用表1 中的潮霉素基因檢測引物Hyg PCR 擴增, 篩選陽性轉基因株系。進一步通過Primer 5.0 設計分別位于載體和啟動子上的2 條引物OsFLZ13-GUS-Identify (表1)進行PCR 鑒定陽性植株。依據OsFLZ13(LOC_Os04g49650) 基因序列, 利用CRISPR-P2.0 (http://cbi.hzau.edu.cn/CRISPR2/)在線軟件在基因反義鏈的上游和下游位置各設計 1 個20 bp 的編輯靶點[23]。使用引物OsFLZ13-CRISPR(表1)進行PCR 擴增, 獲得含靶點序列的線性DNA片段, 用武漢伯遠生物科技有限公司單子葉基因編輯載體試劑盒, 構建雙靶點CRISPR-Cas9 載體, 并轉化DH5α 感受態細胞, 平板培養, 單菌落測序后采用農桿菌介導法轉化中花11 愈傷, 經培養獲得轉基因株系。利用表1 中的潮霉素基因檢測引物Hyg,PCR 擴增篩選出陽性轉基因株系。分別使用引物OsFLZ13-Target1,OsFLZ13-Target2 (表1) PCR 擴增包含靶點1 和靶點2 的序列, 由北京擎科生物科技股份有限公司測序, 獲得基因編輯類型。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

表1 引物及序列表Table 1 Primers and sequences in this study

1.7 GUS 染色和花粉染色觀察

OsFLZ13GUS 報告基因的定性檢測根據Lee 和Sch?ffl 的方法[24]。OsFLZ13的CRISPR-Cas9 材料的花粉經碘-碘化鉀染色后, 使用體式顯微鏡(leica S8AP0, Weztlar, 德國)觀察花粉活力。

2 結果與分析

2.1 水稻FLZ 家族基因成員的鑒定與蛋白質理化性質

以擬南芥(Arabidopsisthaliana) 16 個、大豆(Glycinemax) 37 個、二穗短柄草(Brachypodium distachyon) 26 個、玉米(Zeamays) 29 個、大麥(Hordeumvulgare) 16 個FLZ 蛋白為參考序列, 通過TBtools 的Blast 功能對水稻的蛋白質文件進行檢索,共獲得31 個水稻基因。其中, 29 條序列具有FLZ 結構域, 其余2 個基因沒有檢索到FLZ 結構域。參考RAP (https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)數據庫的命名信息, 將其基因命名為OsFLZ1～OsFLZ29。蛋白質一級結構理化性質分析見表2。OsFLZ基因核酸長度在309 (OsFLZ21)～1167 (OsFLZ1)個堿基之間, 平均核苷酸數量為555.3。編碼的蛋白質序列長度介于103(OsFLZ21)～389 (OsFLZ1)個氨基酸, 平均氨基酸數量為185.1。OsFLZ 等電點(Isoelectric point)最小值是4.33 (OsFLZ2), 最大值是11.05 (OsFLZ25)。其中17個等電點小于7, 為酸性蛋白, 12 個等電點大于7, 為堿性蛋白, 平均值為7.19。分子量在10.75 (OsFLZ21)～39.42 (OsFLZ1) kD 之間。蛋白質不穩定系數在50.35(OsFLZ9)～94.87 (OsFLZ16)之間, 平均親疏水性在-1.02 (OsFLZ14)～0.05 (OsFLZ15)之間, 脂肪族指數在40.07 (OsFLZ20)～82.36 (OsFLZ15)之間。根據不穩定系數小于40 為穩定蛋白的原則, 推測水稻FLZ 家族均為不穩定蛋白。其中OsFLZ13 只含有120 個氨基酸, 屬于小分子肽, 等電點為9.50, 不穩定系數為56.63, 脂肪族指數為51.76, 平均疏水性為-0.93。

表2 水稻FLZ 家族基因編碼蛋白的理化性質Table 2 Physicochemical properties of proteins encoded by OsFLZ family genes

2.2 水稻FLZ 蛋白保守基序、結構域與基因結構

CDD 搜索發現, 水稻FLZ 均含有FLZ 結構域,OsFLZ19 (LOC_Os06g05970)還含有一個未知功能620 結構域(DUF620) (圖1-B)。OsFLZ17、OsFLZ19、OsFLZ23 含有zf-FLZ superfamily, 其他的OsFLZ蛋白含有zf-FLZ 結構域。通過MEME 在線工具分析OsFLZ 蛋白序列, 共獲得14 個保守基序(motif),根據 E 值依次命名為 motif1 至 motif14。除了OsFLZ17 只含有motif1, 所有的OsFLZ 蛋白都含有motif1 和motif2 (圖1-A)。這表明motif1 和motif2是 OsFLZ 蛋白的重要組成部分, 其中 motif1(CX2CX3LX4DX3YX5FCSX2CR)是FLZ 蛋白的標志序列, OsFLZ19 由motif10、motif2 組成DUF620。此外, OsFLZ15、OsFLZ8 不僅含有motif1 和motif2,還含有 motif13。從基因結構看,OsFLZ1和OsFLZ3、OsFLZ11、OsFLZ13、OsFLZ17、OsFLZ19、OsFLZ28含有2 個內含子,OsFLZ2含有3 個內含子(圖1-C)。

圖1 OsFLZ 家族基因蛋白保守基序、結構域和基因結構分析Fig. 1 Analysis of conserved motifs, domains, and gene structure of OsFLZ family genes

2.3 水稻FLZ 家族基因啟動子區的順式作用元件

為進一步研究OsFLZ基因的轉錄調控機制, 對基因ATG 上游2000 bp 啟動子序列進行分析表明,OsFLZ 家族基因啟動子區至少包含58 種順式元件(圖2)。這些元件主要分為光信號響應元件、激素和脅迫響應元件和生長代謝元件3 個大類。其中, 光響應元件和植物激素響應元件占比較高, 大部分水稻FLZ 家族基因都包含光響應元件, 在基因的上游序列中普遍存在G-box。激素和脅迫響應元件也廣泛存在于水稻FLZ 家族基因中, 包括對生長素、赤霉素、脫落酸和低溫脅迫響應相關的元件。激素響應元件中參與脫落酸反應、茉莉酸甲酯反應的元件占比較高。其中24 個基因的啟動子中含有參與茉莉酸甲酯反應的CGTCA-motif 和TGACG-motif, 27 個基因含有與脫落酸響應相關的調控元件ABRE, 表明水稻FLZ 家族基因可能參與調控脫落酸和茉莉酸甲酯反應。脅迫響應元件中, 含有較多的厭氧誘導的響應元件(ARE), 還有部分低溫脅迫(LTR)和干旱誘導(MBS)響應元件, 表明水稻FLZ 家族基因可能參與抵抗嚴寒和干旱。FLZ 家族基因的第3 大類順式作用元件是參與生長代謝的元件, 調控細胞周期調節、晝夜節律控制、胚乳表達、柵欄葉肉細胞分化、玉米醇溶蛋白代謝、根特異性調節和分生組織表達等生命過程。OsFLZ13基因的啟動子區包括參與光反應、脫落酸反應、茉莉酸甲酯反應、赤霉素反應、厭氧和缺氧誘導的順式作用元件, 還含有干旱誘導的MYB 結合位點、低溫脅迫響應元件。其中光反應、脫落酸反應響應元件占比較多。

圖2 水稻FLZ 家族基因順式作用元件分析Fig. 2 Cis-regulatory elements analysis of OsFLZ family genes in rice

2.4 水稻FLZ 家族基因的表達模式分析

構建了29 個OsFLZ 家族基因在24 個不同組織中的表達熱圖(圖3-A)。大部分OsFLZ 家族基因在各組織中均有表達, 在不同組織中的表達量差異較大。部分OsFLZ 家族基因表達表現為組織特異性,如OsFLZ15、OsFLZ18和OsFLZ22在吸脹的種子高度表達,OsFLZ24和OsFLZ26在幼苗的根和葉中表達較高,OsFLZ5、OsFLZ7、OsFLZ8和OsFLZ27在抽穗期前的莖中特異表達,OsFLZ2在抽穗期的莖中表達量較高,OsFLZ10在圓錐花序發育第3 階段的葉中表達量較高,OsFLZ20在開花前的穎殼中表達量較高。OsFLZ6和OsFLZ13在開花前的雄蕊中特異性表達, FPKM值分別為20,477.6和37,139.7。OsFLZ3、OsFLZ9和OsFLZ23在授粉后的胚乳中表達較高。OsFLZ4在抽穗期前的莖和開花前的雄蕊中表達較高,OsFLZ28在抽穗期前后的莖中有一定表達。

(圖3)

通過比較表達數據聚類與進化樹發現, 表達模式相近的OsFLZ 家族基因序列相似, 傾向于聚在一類。例如,OsFLZ6和OsFLZ13在進化上聚為一類,而且均在開花前的雄蕊中特異性表達?；虻膯幼禹樖皆M成也比較接近(圖 2),OsFLZ6和OsFLZ13啟動子序列中含有17 種相同元件, 這也可以解釋這2 個基因相似的表達模式。有意思的是,OsFLZ13表現更為特異, 在水稻的2 個品種珍汕97(Zhenshan 97, ZS97)和明恢63 (Minghui 63, MH63)中均在開花前雄蕊中高度特異表達(圖3-B)。在小穗中有一定的表達, 可能是其中含有雄蕊的緣故。因此, 推測該基因和水稻花藥發育有關。

OsFLZ 家族基因表達的組織特異性還與更細化的組織發育時期有關。研究發現, 在胚乳發育的不同時期, OsFLZ 家族基因成員的表達模式也有細微差異(圖3-A)。例如OsFLZ23在授粉后7 d 的胚乳中表達量高達38,950.7, 而在授粉后14 d 的胚乳中表達量為18,789.4, 授粉21 d 后表達量僅為4244.2, 逐漸下降。與之相反的是OsFLZ3在授粉后的第7 天、第14 天、第21 天, 表達量逐漸升高。因此, 水稻FLZ 家族基因的表達不僅具有組織特異性, 而且具有發育時期特異性。

OsFLZ 家族基因的幼苗在赤霉素(GA3)、激動素(KT)和萘乙酸(NAA)處理后, 大部分基因表達水平改變(圖3-C)。處理后,OsFLZ18 在幼苗中表達量大幅度降低。OsFLZ24表達量顯著升高, 尤其是在激動素處理后。48 h 黑暗或者光照處理同樣改變了 OsFLZ 家族基因在胚芽和幼根中的表達水平(圖3-C)。首先是胚芽中表達水平的改變, 無論是光照還是黑暗處理,OsFLZ8、OsFLZ9、OsFLZ21、OsFLZ23、OsFLZ26、OsFLZ27、OsFLZ28和OsFLZ29表達水平下調,OsFLZ1、OsFLZ15、OsFLZ17的表達水平上調; 然后是在幼根中表達水平的改變, 光照或黑暗處理后,OsFLZ9、OsFLZ21、OsFLZ23、OsFLZ26、OsFLZ27、OsFLZ28和OsFLZ29的表達水平下調, 而OsFLZ4、OsFLZ7、OsFLZ11、OsFLZ12、OsFLZ20則表達水平上調。

激動素處理后,OsFLZ13在幼苗中的表達水平上調。無論是在胚芽還是幼根, 48 h 的光照或黑暗處理,都使OsFLZ13的表達水平上調(圖3-C)。說明OsFLZ13可能與水稻幼苗抵御不良環境脅迫相關功能有關。

2.5 OsFLZ13 組織器官表達的GUS 染色和亞細胞定位

克隆了OsFLZ13基因啟動子序列并連接到載體pCAMBIA1381Z, 遺傳轉化獲得陽性轉基因植株。取轉基因植株的萌發種子、根、葉、莖節和莖節間,以及花期的小穗和花藥進行了GUS 染色(圖4)。在營養生長期, 除在萌發種子的胚芽鞘以及莖稈的幼嫩部位有少量染色外, 其余組織無染色, 說明OsFLZ13在營養生長期表達量低(圖4-A, B)。在生殖生長期的花藥不同發育階段, 主要在花藥發育的后期著色(st11～st14), 說明OsFLZ13可能影響花藥后期的發育(圖4-C)。此外, 在雌蕊未見著色, 說明OsFLZ13在雌蕊不表達(圖4-D)。進一步觀察發現,在花藥發育st8b 時期, 絨氈層已有輕微染色, 但花粉沒有染色, 花藥發育st13 和st14 時期, 花粉粒染色較深, 說明OsFLZ13可能先影響了絨氈層后再影響花粉的發育(圖4-E, F)。

圖4 pCAMBIA1381Z-OsFLZ13 轉基因水稻營養和生殖組織器官的β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色Fig. 4 β-glucuronidase (GUS) staining of the tissues and organs across vegetative and reproductive stages from the pCAMBIA1381Z-OsFLZ13 transgenic rice plants

克隆中花11 的OsFLZ13基因CDS 序列(不含終止密碼子), 并構建表達載體 35S::OsFLZ13::eGFP,在煙草葉片表皮細胞中瞬時表達, 觀察蛋白的亞細胞定位。根據熒光出現的位置判斷, OsFLZ13 蛋白定位于質膜和細胞核中, 與生物信息學預測結果一致(圖5)。

圖5 OsFLZ13 蛋白在本氏煙草中的亞細胞定位Fig. 5 Subcellular localization of OsFLZ13 protein in Nicotona benthamiana

2.6 OsFLZ13 的CRISPR/Cas9 材料構建和突變體水稻表型觀察

由于OsFLZ13在開花前的花藥中特異表達, 推測可能和花粉育性相關, 構建了OsFLZ13的CRISPRCas9 載體遺傳轉化水稻中花11 (圖6-A, B)。經組織培養獲得13 株再生植株, 取葉片提取DNA, 利用潮霉素引物進行陽性鑒定, 共獲得9 株陽性再生植株。對轉基因陽性株系T1代植株基因的2 個靶點區域PCR 擴增和測序, 結果均為雙峰, 未獲得純合轉基因株系。通過與野生型序列比較分析, 篩選出在2個靶點均產生突變的2 個獨立轉化株系(Osflz13-1和Osflz13-2) (圖6-C)。Osflz13-1在靶點1 插入一個堿基C, 在靶點2 缺失3 個堿基。Osflz13-2在靶點1缺失12 個堿基, 在靶點2 缺失3 個堿基(圖6-C)。

圖6 CRISPR/Cas9 編輯材料(Osflz13-1 和Osflz13-2)構建過程及Osflz13 基因序列Fig. 6 Construction of CRISPR/Cas9 editing lines (Osflz13-1 and Osflz13-2) and Osflz13 gene sequences

觀察2 個突變株系的T1代植株的小花, 發現和野生型植株在花藥發育的st13 有明顯差異, 突變體花藥變小而雌蕊無明顯差異(圖7-A, B)。對突變體開花前的花粉碘染, 顯示Osflz13-1和Osflz13-2均有50%以上的花粉敗育(圖7-C)。這與GUS 染色中,OsFLZ13在花藥發育的第13 階段和第14 階段高度表達的結果一致。野生型的穗粒飽滿稻穗彎曲, 突變體植株有大量空癟種子, 稻穗直立(圖7-D)。野生型結實率高達94%, 突變體結實率顯著降低(圖7-E),突變體Osflz13-1和Osflz13-2的結實率分別只有44%和36% (圖7-F)。

圖7 Osflz13 突變體植株的雄蕊、雌蕊和花粉育性的觀察及其結實率Fig. 7 Stamen, pistil, pollen fertility, and seed-setting rates of Osflz13 mutant plants

3 討論

FLZ 基因家族對植物的生長發育和逆境脅迫具有重要的作用。一般認為, FLZ 蛋白的主要功能是介導蛋白質之間的相互作用[25]。FLZ 蛋白能夠通過與SnRK1α 亞基相互作用, 發揮在糖代謝、發育和應對脅迫方面的調控功能。目前, 在水稻中FLZ 家族基因功能研究較少。有報道表明,OsFLZ2通過與短日照條件下的開花激活基因OsMADS51相互作用延遲開花[26]。最近有研究對水稻OsFLZ 家族做了較系統的分析, 指出OsFLZ18負向調控水稻抽穗期, 并且負向調控水稻抗淹水脅迫[12-13]。但FLZ 家族基因在水稻生長發育中特別是花發育中的作用缺乏研究,絕大部分成員功能尚不明確。

本研究采用同源序列搜索方法在水稻中鑒定了29 個OsFLZ 家族基因, 分析了該家族蛋白的理化性質、基因結構、蛋白保守結構域、順式作用元件等信息。研究發現, OsFLZ 具有高度保守的FLZ 結構域, 蛋白質長度較小, 在103～389 個氨基酸之間。水稻FLZ 家族和玉米、大豆等植物中鑒定的FLZ 家族基因具有很高的相似性[27-28]。從結構域看, 目前發現的植物FLZ 蛋白均只含有FLZ 單結構域, 且不含有跨膜結構和信號肽序列[25]。OsFLZ 蛋白也基本類似, FLZ 結構域均含有保守motif, 并且呈現α-β-α 的二級拓撲結構特征?；蚪Y構分析也顯示OsFLZ 家族基因與其他植物的FLZ 家族基因相似, 大部分只含有單一的內含子(圖1-C), 部分成員具有2 個或3個內含子。但研究發現, OsFLZ19 除了含有FLZ 結構域外, 還含有一個DUF620 (圖1-B)。值得注意的是, 在生物信息預測中, OsFLZ 蛋白均不含有跨膜結構域和信號肽。但研究表明OsFLZ2、OsFLZ5、OsFLZ6、OsFLZ11、OsFLZ18、OsFLZ20 和OsFLZ27定位于細胞核和細胞質[12]。亞細胞定位中, 本研究OsFLZ13 也定位于細胞核和質膜?？赡苁且驗橛行┑鞍踪|的定位不依賴于經典的信號肽路徑, 而是通過非典型信號肽或者直接與其他蛋白質相互作用形成復合物等方式定位, 這有待進一步研究。

植物基因的表達模式與功能密切相關。水稻FLZ 家族基因家族成員表達模式多樣, 有些成員表現時空和組織特異性, 如OsFLZ5、OsFLZ7、OsFLZ8和OsFLZ27只在抽穗期前的莖中表達(圖3-A)。在水稻花序發育不同階段中, 大多數OsFLZ 家族基因表達較高。OsFLZ1、OsFLZ4、OsFLZ6、OsFLZ13、OsFLZ16和OsFLZ17在生殖器官中高水平表達。在擬南芥中, 有些AtFLZ 家族基因也在生殖階段的花中具有更高的表達水平[16]。在水稻中,OsFLZ2通過與正向調控水稻抽穗期的轉錄因子OsMADS51相互作用調控水稻抽穗期, 延遲開花[26]。OsFLZ18負向調控水稻抽穗期, 過量表達OsFLZ18可導致抽穗延遲, 抑制了植株中開花途徑相關基因Ehd1、Hd3a和RFT1的表達[13]。過表達OsCTZFP8植株在冷處理下可保持高的花粉活力和結實率[29]。本研究發現, 家族基因成員OsFLZ13在雄蕊中高度特異表達。因此,有必要進一步了解OsFLZ 家族基因在水稻生殖生長中的作用。隨后的GUS 染色進一步明確了該基因在發育后期的花藥中特異表達, 在雌蕊中無表達。通過CRISPR 基因編輯獲得的突變體Osflz13大部分花粉喪失活性, 結實率顯著降低。因此, 本研究表明OsFLZ13參與水稻花藥發育, 對于產生正常育性的花粉具有重要作用。本研究首次發現了OsFLZ13在花藥發育和花粉育性中的作用, 對于花粉育性形成機理研究以及雜種優勢的利用具有積極的意義。但OsFLZ13作用的分子機制, 及其是否與花藥開裂以及花粉和柱頭的識別、花粉管萌發有關有待進一步闡明。

4 結論

本研究共鑒定了FLZ 家族成員29 個, 分布在11 條染色體上, 具有特定的FLZ 結構域。OsFLZ 家族基因表達多樣化, 有些成員具有組織特異性。其中OsFLZ13亞細胞定位在質膜和細胞核, 在開花前的花藥中特異性表達, 并通過 β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)活性染色證實。通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術獲得了2 個獨立轉化株系, 發現突變體植株花粉?；钚詥适? 結實率顯著下降。本研究為揭示FLZ 家族基因成員在水稻生長發育中的功能建立了基礎。