小麥TaSPX1 基因的克隆、表達及耐低氮逆境的功能研究

張寶華 劉佳靜 田 曉 田旭釗 董 闊 武郁潔 肖 凱李小娟,*

1 河北農業大學生命科學學院, 河北保定 071001; 2 河北省植物生理和分子病理學重點實驗室, 河北保定 071001; 3 河北農業大學農學院, 河北保定 071001

土壤中的有效氮含量通常無法滿足作物需求,使得氮素缺乏經常成為生長的主要限制因素[1]。為解決氮素短缺問題, 人們通過施加化肥增加土壤氮含量以確保作物生長和產量, 但作物只能從土壤中吸收部分氮素, 多余的氮除會引起環境問題外, 長期過量的氮肥輸入還可改變植物根際土壤微生物群落結構和土壤氮循環進而影響植物的氮素利用效率[2-3]。因此, 揭示植物應答低氮脅迫的分子機制培育氮高效作物種質具有重要的理論和實踐意義。

植物根系主要以無機氮NO3-和NH4+的形式從土壤中獲取氮素, 對于大多數植物尤其是旱生植物來說, NO3-是主要氮素來源[4]。植物根系對硝酸鹽的獲取主要通過高親和力轉運蛋白系統(high-affinity transporter system, HATS)和低親和力轉運蛋白系統(low-affinity transporter system, LATS)兩個氮素吸收系統進行[5]。前者由硝酸鹽轉運蛋白 2 (Nitrate Transporter 2, NRT2)家族組成并介導植株對低濃度硝酸鹽的吸收; 后者為硝酸鹽轉運蛋 1 (Nitrate Transporter 1, NRT1)/肽轉運蛋白(Peptide Transporter,NPF)家族, 主要在硝酸鹽充足時發揮作用, 此外部分成員可感知外界不同硝酸鹽濃度作為雙親和轉運蛋白參與根對NO3-的吸收[6-9]。上述NRT 家族成員受到NLP7[10]、NRG2[11]、NAC[12]、DREB[13]、BT[14]、LBD[15]和ATG[16]等轉錄因子和相關蛋白的調節, 其中NLP7 作為核心轉錄因子也可與其他轉錄因子相互作用進而調控植物對氮素的吸收轉運過程[10]。植物通過根系吸收的硝酸鹽在硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)、亞硝酸還原酶(nitrite reductase, NIR)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)催化下合成氨基酸和蛋白質等含氮化合物[17]。研究表明大麥基因HvNLP2[18]、番茄的自噬蛋白基因ATG6[19]、狐尾粟SiMYB30基因[20]以及甘蔗miR156[21]通過調控植株體內上述酶活性或者基因表達進而改變氮同化能力來抵御低氮脅迫?？梢? 植物利用氮素的機制精細且復雜, 硝酸鹽轉運蛋白的調節及氮同化過程在作物氮素吸收轉運和同化中發揮重要功能。

SPX 結構域存在于多種真核生物的N 端, 其命名來源于酵母抑制劑gpa1 (Syg1)、酵母磷酸酶81(Pho81)和人類多垂體逆轉錄病毒受體1 (Xpr1)的首字母。植物中, SPX 蛋白家族N 端均包含SPX 結構域, 根據C 端含有的不同保守域EXS、RING 和MFS被分為SPX-EXS、SPX-RING 和SPX-MFS 亞族以及只在N 端含SPX 結構域的SPX 亞族[22]。植物SPX基因家族成員已被證明在調節磷穩態和傳遞磷信號中發揮重要作用。研究表明SPX-EXS 亞家族成員中擬南芥AtPHO1、AtPHO1;H1和番茄SIPHO1;1介導磷從根部向地上部的轉運, 基因突變后導致植株根系磷含量升高, 而地上部磷含量降低[23-24]。擬南芥中SPX-MFS 亞家族成員VPT1 (液泡磷酸轉運蛋白1)也稱為PHT5;1 (磷酸轉運蛋白5;1)主要參與磷素由細胞質向液泡的運輸[25]。在水稻中過表達SPX-MFS 亞家族成員OsSPX-MFS1-3后植株液泡內的磷含量增加, 表明該家族成員主要負責磷素在液泡和細胞質間的轉運[26]。NLA 為SPX-RING 亞族成員, 研究發現其可通過與miR827 相互作用介導對磷的吸收以及磷從根部向地上部的轉運[27]。而水稻OsNLA1 通過降解磷轉運蛋白OsPT2 和OsPT8 來抑制磷吸收過程[28]。SPX 亞族成員擬南芥AtSPX1、水稻OsSPX1和OsSPX2作為磷信號轉導的負調節因子,磷酸鹽存在下, 其與轉錄因子PHR 相互作用進而抑制下游的磷酸鹽響應過程[29-30]。

近年來的研究發現, 植物SPX 亞族成員除了調控磷信號轉導途徑, 還參與了其他非生物逆境的調控。水稻OsSPX1基因的過表達不僅增強了植株耐寒性, 還可能在應答氧化脅迫中發揮重要作用[31-32]。據報道SPX 亞族部分成員還參與氮磷代謝過程。水稻的OsSPX4在硝酸鹽存在下, 可與NRT1.1B 相互作用后被泛素化降解, 導致轉錄因子NLP3 和PHR2被釋放并激活下游的氮響應信號通路和磷利用途徑[33]。與水稻相似, 擬南芥SPX1 與硝酸鹽誘導的轉錄因子NIGT1 相互作用進而調節PHR1 的表達來響應磷信號途徑[34]。研究表明巨型浮萍SpSPX1和SpSPX2基因在磷和氮缺乏時顯著上調表達, 共同調控氮磷代謝過程[35]。此外SPX 還參與氮信號途徑的應答。大豆中GmSPX8與bHLH 轉錄因子GmPTF1相互作用共同調節植物根部結節發育和固氮作用[36]。對馬鈴薯低氮處理下的轉錄組進行分析發現SPX4基因對低氮脅迫顯著應答, 然而對其作用機制尚不清楚[37]。

小麥是我國重要的糧食作物, 已有研究發現小麥(Triticumaestivum)的部分SPX 家族成員的表達在磷脅迫下發生了變化, 但對其功能尚不明確[38-39]。本研究前期從小麥中鑒定了一個 SPX 亞族成員TaSPX1, 發現該基因對低氮脅迫有明顯應答, 利用遺傳轉化技術獲得過表達轉基因煙草株系, 結合表型分析、生理生化參數、活性氧清除系統和氮素吸收及轉運等方面研究該基因抵御低氮脅迫的功能,旨在豐富對小麥SPX 基因家族成員抵御營養逆境的認識, 為創制營養高效的作物品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草種子“本氏煙草” (NicotianabenthamianaDomin)和普通煙草“威斯康辛38” (Nicotiana tabacumcv. Wisconsin 38)提供瞬時轉化和遺傳轉化的外植體、小麥種子“中國春” (TriticumaestivumL.)、大腸桿菌“DH5α” (EscherichiacoliDH5α)、農桿菌“EHA105” 和“GV3101” (Agrobacteriumtumefaciens)、亞細胞定位載體pCAMBIA1300 和過表達載體pCAMBIA3301 均由河北農業大學生命科學學院植物生理與分子病理學重點實驗室保存留用。

1.2 小麥TaSPX1 的分子特征和系統進化分析

本研究前期從小麥基因家族中分離出一個SPX基因, 命名為TaSPX1(GenBank 登錄號為Ak332300), 獲得全長cDNA 序列1333 bp。使用ExPasy 軟件對其開放閱讀框ORF、編碼氨基酸數量、分子量和等電點進行分析。應用DNAMAN 和Pfam 軟件分析該基因編碼蛋白的保守結構域位置。利用 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線網站查找并下載水稻、擬南芥和小麥的SPX 蛋白家族成員, 應用MEGA 軟件進行ClustalW 方法的多序列比對, 選用鄰近法(Neighbor-Joining)和bootstrap 分析1000 次后構建小麥TaSPX1 與上述植物種屬的SPX 蛋白系統進化樹[40]。

1.3 TaSPX1 基因啟動子的順式作用元件分析

1.4 小麥TaSPX1 的表達特征分析

將小麥種子在室溫下黑暗處理至萌芽后轉移到MS (Murashige & Skoog)營養液中培養, 培養條件為: 光照周期14 h/10 h (明/暗), 溫度為25℃。待小麥生長至三葉期進行低氮處理, 于0、3、9、12 和27 h 和MS 下恢復24 h 的各處理時間點分別收取小麥的葉和根保存在-80℃冰箱。使用M5 Quickspin植物RNA 快速提取試劑盒(Mei5bio, 中國)提取上述材料的總RNA 后利用M5 Super plus RT-qPCR RT kit with gDNA remover (Mei5bio, 中國)試劑盒進行合成cDNA 并測定濃度。以各cDNA 為模板, 小麥Tubulin基因為內參, 使用實時定量PCR (RT-qPCR)方法擴增TaSPX1基因。RT-qPCR 反應體系總體積為20 μL, 包括10 μL 2× M5 HiPer Realtime PCR Supper Mix with Low Rox (Mei5bio, 中國), 上下游引物各0.5 μL, 2 μL cDNA 和7 μL 無核酸水。含3個生物學重復。使用2-ΔΔCT法計算表達量[41]。

1.5 TaSPX1 亞細胞定位特征分析

通過PCR 方法, 以1.4 中0 h 的葉片cDNA 為模板, 擴增TaSPX1基因的編碼閱讀框(ORF)序列。產物回收后連接pUCM-T 克隆載體(Mei5bio, 中國),重組質粒經單酶切驗證后送華大基因生物公司測序驗證, 測序正確的菌液保存于-80 ℃, 為后續亞細胞定位載體提供模板。

構建pCAMBIA1300-35S-TaSPX1-GFP 載體完成后, 將含有35S::TaSPX1-GFP 重組質粒和35S::GFP質粒的GV3101 農桿菌注射本氏煙草的下表皮。采用瞬時表達法[42]對煙草培養 48 h 后, 以注射含有35S::GFP 質粒的農桿菌的煙草葉片為對照, 并結合DAPI 核染料在熒光顯微鏡下觀察亞細胞定位情況。

1.6 轉基因煙草植株的遺傳轉化和鑒定

同1.5 中方法擴增TaSPX1基因, 使用DNA 重組技術, 構建基因表達質粒。利用農桿菌EHA105介導的遺傳轉化技術, 得到過表達煙草威斯康38 轉基因植株并完成轉基因植株的鑒定[42]。

1.7 轉基因煙草在低氮和低磷脅迫下的表型鑒定

采用MS (Murashige & Skoog)營養液水培法培養野生型(wild type, WT)和過表達TaSPX1(overexpression lines, OE)的煙草株系幼苗[42]。WT 和OE 煙草種子在蛭石中萌發并生長至三葉期, 選取長勢一致的幼苗, 轉移至MS 全營養液培養1 周后, 再挑選一致的WT、OE3 和OE4 煙草植株轉移至MS、低氮營養液(20 μmol L-1)和低磷營養液(10 μmol L-1)中,每組3 個重復, 于處理后7 d 和21 d 觀察生長情況并照相記錄。稱量植株鮮重和根重并計算葉面積,測量植株葉綠素含量和光合參數(Pn、Gs、Ci和Tr)、可溶性糖和可溶性蛋白含量, 最后分別收取WT、OE3 和OE4 的根和葉, 于-80℃冰箱保存, 為后續試驗提供材料。

1.8 低氮脅迫下保護酶活性和丙二醛含量測定

以WT、OE3 和OE4 的煙草葉片為材料。以1.7營養液培養的 WT 和過表達株系OE3 和OE4 的煙草葉片為材料。測定包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)的保護酶活性以及MDA含量[43]。

1.9 低氮脅迫下氮吸收同化參數分析和氮含量測定

以1.7 營養液培養的WT 和過表達株系OE3 和OE4 的煙草葉片為材料。利用凱氏定氮法測定WT、OE3 和OE4 植株地上部的氮含量[44]。測定硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NIR)和谷氨酰胺合成酶(GS)的活性[45-47]。

在作品設計階段，需要緊緊圍繞賽題的基本要求，對各個模塊的功能進行設計。首先要確定系統應該具備的功能模塊，各功能模塊應該圍繞題干，重點突出需要完成的功能要求。其次，要進一步設計各個功能模塊應采用什么方法去做，采用哪些算法來解決問題，此階段分析的越細，開發階段越輕松。在作品設計階段，各組的學生可以相互交流，相互提出自己的觀點，然后大家一起分析討論，指導老師可以在分析過程中給學生一些必要的指導建議，保證作品設計的方向符合作品的要求。

1.10 下游相關基因的表達分析

以1.7 中低氮脅迫下處理的WT、OE3 和OE4的根為材料, 使用1.4 中的方法進行提取總RNA 和反轉錄cDNA。以煙草的Ntactin基因作為內參, 利用RT-qPCR 對包含5 個SOD、11 個POD 和6 個CAT在內的保護酶基因以及氮吸收轉運途徑的6 個NR、5 個NIR、6 個NRT 和7 個GS 基因的表達量進行分析。使用的基因特異性引物見表1。RT-qPCR 的反應體系、程序和計算方法見1.4。

表1 用于RT-qPCR 的引物Table 1 Primers used for RT-qPCR analysis

1.11 數據分析

使用Microsoft Excel 和SPSS 21.0 軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 TaSPX1 的分子特征和系統進化分析

本實驗室前期從小麥基因家族中獲得一個SPX 基因成員TaSPX1(Ak332300), 其ORF 為888 bp, 編碼295 個氨基酸, 分子量為33.39 kD, pI 5.20。TaSPX1 蛋白只在N 端1～167 位氨基酸殘基處含有一個SPX 結構域, 屬于SPX 亞族成員。為探究小麥TaSPX1 與擬南芥、水稻和小麥等植物種屬其他SPX 蛋白的親緣關系, 從NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載相關SPX 蛋白序列, 利用MEGA7 軟件分析并構建系統進化樹。結果顯示, 上述3個物種的SPX蛋白依據結構域序列特征分為4 個組, 分別為SPX、SPX-EXS、SPX-MFS 和SPXRING 亞族, 小麥TaSPX1 與同屬于SPX 亞族的水稻OsSPX1 親緣關系較近(圖1)。

圖1 TaSPX1 與小麥、水稻和擬南芥SPX 家族同源蛋白的系統進化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of TaSPX1 and homologous from wheat, rice, and Arabidopsis thaliana

2.2 TaSPX1 的亞細胞定位特征分析

應用瞬時表達法, 將驗證正確的包含35S::TaSPX1-GFP 質粒和包含35S::GFP 質粒的農桿菌分別注射到本氏煙草葉片中, 并培養至48 h 后選用葉片下表皮,結合DAPI 染液侵染在熒光顯微鏡下觀察。結果顯示, 瞬時表達GFP 蛋白的對照組煙草葉片細胞中熒光信號分布在整個細胞; 而表達TaSPX1-GFP 融合蛋白的葉片細胞僅在細胞核中觀察到熒光信號, 結合DAPI 染色結果進一步確定TaSPX1 定位于細胞核中發揮相應功能(圖2)。

圖2 轉化煙草表皮細胞的TaSPX1-GFP 亞細胞定位Fig. 2 Subcellular location of the TaSPX1-GFP fusion in epidermis cells of transformed tobacco (50 μm)

2.3 TaSPX1 在低氮脅迫下的時空表達特征

為探究TaSPX1在小麥中的表達特征, 以低氮處理0、3、9、12 和27 h 和恢復24 h 的小麥老葉、新葉和根為材料, 使用RT-qPCR 技術, 以小麥Tubulin為內參基因進行TaSPX1的表達量分析。結果表明,TaSPX1在老葉、新葉和根中的表達均上調, 其在不同組織中的表達特征有所不同。低氮處理后3 h, 老葉中的表達量達到最高值, 之后下降直至27 h 與處理前無顯著差異; 新葉中TaSPX1的表達隨著處理時間的延長有所增加, 至27 h 達到最高值; 根中表達量在脅迫9 h 達到最高, 27 h 仍保持較高表達量。在恢復正常供氮水平24 h 后, 老葉、新葉和根系樣本的TaSPX1表達量回落至與處理前無顯著差異(圖3)?？梢? 小麥不同組織中的TaSPX1基因均對低氮脅迫產生了明顯應答。

圖3 小麥TaSPX1 基因在低氮脅迫下的表達特征Fig. 3 Relative expression pattern of TaSPX1 of wheat seedlings under low-N stress

2.4 TaSPX1 啟動子順式作用元件分析

使用Plant care (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)獲取TaSPX1起始位點ATG 上游2000 bp 啟動子區, 分析該區域順式作用元件發現, 其除了含有應答ABA、鹽和干旱逆境等元件外,還包含6 個應答低氮脅迫的順式作用元件(表2)。

表2 TaSPX1 基因啟動子的順式作用元件分析Table 2 Analysis of putative cis-acting elements in the promoter region of TaSPX1

2.5 TaSPX1 基因的功能分析

2.5.1 過表達轉基因株系的陽性鑒定 利用農桿菌遺傳轉化重組質粒獲得轉基因煙草株系, 提取WT 和各OE 植株的葉片總RNA, 反轉錄為cDNA。以cDNA 為模板, 使用特異性引物進行RT-qPCR 檢測, 結果顯示OE 中TaSPX1基因表達量較WT 顯著增加, 表明TaSPX1基因遺傳轉化煙草植株成功, 得到5 個陽性煙草轉化株系OE1～OE5 (圖4)。

圖4 過表達煙草植株中TaSPX1 的表達分析Fig. 4 Relative expression level of TaSPX1 in overexpression tobacco lines

2.5.2 過表達轉基因煙草的表型特征及低氮脅迫下的生物量、葉綠素含量和光合參數測定 選取2.5.1 中表達量較高的煙草株系OE3 和OE4 與野生型(WT)為材料, 在MS 營養液、低氮和低磷處理下進行水培培養分析表型特征。結果表明, 在MS 營養液正常條件和低磷處理下, OE3 和OE4 與WT 的長勢沒有明顯差異。而在低氮處理21 d 后, OE3 和OE4相較于WT 有明顯的生長優勢, 主要表現為地上部增大、根系較長、葉片較多和葉色更綠等特點(圖5-A,B)?？梢? 過表達TaSPX1沒有增強植株耐低磷特性,卻促進了對低氮脅迫的抵御。

圖5 WT、OE3 和OE4 在低磷和低氮下的表型特征及低氮處理下的生理生化特征Fig. 5 Phenotype of WT, OE3, and OE4 plants under low-Pi and low-N treatments and physiological and biochemical characteristics under low-N treatment

為了進一步探究TaSPX1對低氮脅迫的抵御能力, 測定了WT、OE3 和OE4 煙草植株的生物量、葉綠素含量和光合參數。結果顯示, 與WT 相比,OE3 和OE4 植株的鮮重、根重和總葉面積均明顯增加(圖5-C, D, E)。與WT 相比, 過表達植株下葉位、中葉位和上葉位的葉綠素含量均增加明顯(圖5-F)。對光合參數測定發現, 葉片蒸騰速率(Tr) (圖5-G)、凈光合速率(Pn) (圖5-H)以及氣孔導度(Gs)升高(圖5-I), 而胞間CO2濃度(Ci)下降(圖5-J)?？梢? 超表達TaSPX1改善了煙草植株低氮脅迫下的光合和生理性能, 表現出了明顯的生長優勢。

2.6 過表達煙草植株氮含量和可溶性糖及蛋白含量測定

對WT 和過表達煙草植株OE3 與OE4 地上部的氮含量進行分析。結果顯示, MS 條件下, WT 和OE 植株中氮素含量無明顯變化; 低氮脅迫下,OE3 和OE4 植株體內的含氮量顯著高于WT (圖6-A)。另外, 與WT 相比, OE3 和OE4 可溶性糖和可溶性蛋白的含量也明顯增加(圖6-B, C)?？梢?煙草植株中過表達TaSPX1基因增強了低氮處理下植株氮素的吸收利用效率及合成含氮化合物的能力。

圖6 低氮處理下WT、OE3 和OE4 植株氮含量(A)、可溶性糖(B)和可溶性蛋白(C)Fig. 6 Contents of nitrogen (A), soluble sugar (B), and soluble protein (C) in WT, OE3, and OE4 under low-N treatment

2.7 氮吸收同化參數及相關基因的表達特征分析

植物通過氮吸收同化途經獲得并利用外界環境中的氮素。對WT 和過表達煙草植株OE3 與OE4葉片的氮同化相關參數亞硝酸還原酶(NIR) (圖7-A)、硝酸還原酶(NR) (圖7-B)和谷氨酰胺合酶(GS)(圖7-C)的活性進行分析。結果顯示, MS 條件下, WT和OE 植株中NIR、NR 和GS 的活性無明顯變化; 低氮脅迫下, OE3 和OE4 植株中3 種酶的活性較WT明顯增加。又對上述材料根中的亞硝酸還原酶(NIR)基因、硝酸還原酶(NR)基因、氮轉運蛋白(NRT)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因的表達進行分析。結果發現, 低氮處理下與WT 相比, OE3 和OE4 的氮吸收相關基因NtNRT1.1-s和NtNRT2;1(圖7-D)以及氮同化相關基因NtNIR1和NtNIR4(圖 7-E),NtNR2和NtNR3(圖7-F),NtGS2、NtGS4和NtGS6(圖7-G)表達量均明顯增加。表明過表達TaSPX1轉基因煙草株系增強了N 吸收和同化酶活性及部分基因的表達, 可能由此提高了植株低氮脅迫下對N素的吸收利用。

圖7 低氮脅迫下WT、OE3 和OE4 株系的氮吸收同化酶活性和基因表達Fig. 7 Activities of nitrogen anabolases and relative expression of NIRs, NRs, NRTs, and GSs in WT, OE3, and OE4 lines under low-N treatment

2.8 保護酶活性和基因表達分析及丙二醛含量的測定

對WT、過表達煙草株系OE3 和OE4 葉片保護酶和MDA 的含量進行測定。結果顯示, 在正常MS條件下, WT、OE3 和OE4 的保護酶活性和MDA 沒有明顯差異; 而在低氮處理下與WT 相比, OE3 和OE4 的SOD (圖8-A)、POD (圖8-B)和CAT (圖8-C)活性都顯著增加, 而MDA 含量下降(圖8-D)。進一步對上述材料根中的保護酶基因表達量進行分析表明, 在低氮處理下與 WT 相比, OE3 和 OE4 的NtFeSOD(圖8-E),NtPOD1;5、NtPOD4和NtPOD9(圖8-F),NtCAT1;1和NtCAT1;3(圖8-G)的表達量明顯增加, 供試其他相關保護酶基因成員的表達量則變化不明顯?？梢? 過表達TaSPX1煙草株系增強了清除活性氧的能力。

3 討論

迄今, 繼第一個具SPX 結構域的蛋白在釀酒酵母中發現后, 已在不同植物種屬中鑒定出包含SPX、SPX-EXS、SPX-MFS 和SPX-RING 四個亞族的SPX家族成員[22]。其中, 在擬南芥和水稻中的功能研究較多, 上述成員已被證明在傳遞磷信號和調節磷穩態中發揮重要作用, 但結構域的不同賦予了上述亞族在應答磷信號過程中吸收和轉運等具體功能的差異[22]。此外, 研究還發現SPX 亞族的部分成員參與了其他環境信號的應答。水稻OsSPX1除參與磷應答外, 還參與植株抵御低溫和氧化脅迫的功能[31-32];水稻OsSPX4則通過NRT1.1B-SPX4-NLP3 組成的調控模塊觸發硝酸鹽應答反應, 并調控磷信號的核心轉錄因子PHR2, 實現氮磷應答的協同激活[33]; 擬南芥AtSPX1也可通過NIGT1-AtSPX1-PHR1 信號轉導途徑來激活下游的磷利用途徑[34]; 另外巨型浮萍的SpSPX1和SpSPX2以及大豆GmSPX8也參與了氮磷信號的調節[35-36]; 轉錄組分析發現馬鈴薯SPX4對氮信號有應答[37]。目前在小麥中SPX 家族基因的研究尚少, 轉錄組分析發現部分成員的基因表達在磷脅迫下發生了改變[38-39]。本研究從小麥中獲得的TaSPX1基因編碼蛋白僅在N 末端含有一個SPX 結構域, 對其系統進化關系的研究發現TaSPX1 與水稻中同為SPX 亞族的OsSPX1 親緣關系較近, 屬于SPX 亞族。TaSPX1基因啟動子區含有6 個已知應答低氮脅迫的順式作用元件, 結合RT-qPCR 研究發現其對低氮逆境發生明顯應答, 過表達植株具有明顯的生長優勢, 其生物量和光合參數等均顯著增強,表明TaSPX1增強了植株抵御低氮逆境的功能。以上研究結果豐富了對小麥SPX 亞族功能以及該亞族成員參與磷信號之外其他非生物逆境功能的認識, 并拓寬了對氮信號調控網絡的理解。

硝酸鹽是植物主要的氮源之一, 植物通過高親和力運輸系統(HATs)和低親和力運輸系統(LATs)調節硝酸鹽的吸收和運輸。研究表明水稻中過表達AP2/ERF (APETALA2/ethylene-responsive factor)家族基因OsDREB1C[13]以及擬南芥中過表達茶樹脂質轉運蛋白基因CsATG3a[16](AuTophaGy-related genes)可以通過分別正調控NRT 家族成員OsNRT1.1B、OsNRT4.1、AtNRT1.1、AtNRT2.1和AtNRT2.2的表達進而提高植株對氮素的吸收轉運和利用。而蘋果的MdBT2(BTB and TAZ domain protein 2)則對NRT家族基因負調控, 降低植株對氮素的利用效率[14]。另外, 氮同化相關酶NR、NIR 以及GS 等在植株體內氮素利用的過程中也扮演著重要角色。據報道大麥基因HvNLP2突變后導致植物體內相關基因如硝酸鹽同化基因HvNR1、HvNIR、HvGS1.2和HvGS2的表達量降低, 導致氮同化減少從而增加了硝酸鹽的含量[18]。低氮脅迫下過表達SiMYB30的水稻激活氮同化相關基因OsGOGAT1、OsGOGAT2和OsNIA2,從而提高了植株籽粒和莖中的氮含量[20]。本研究發現, 低氮脅迫下過表達TaSPX1的煙草葉片中的氮吸收同化酶NIR、NR 與GS 的活性較WT 明顯增加。另外過表達TaSPX1的煙草植株根中氮轉運蛋白NtNRT1.1-s和NtNRT2;1, 氮同化相關基因亞硝酸還原酶基因NtNIR1和NtNIR4, 硝酸還原酶NtNR2和NtNR3, 以及谷氨酰胺合成酶基因NtGS2、NtGS4和NtGS6的基因表達水平與WT 相比上調, 這也與植株的含氮量在過表達株系中增加的結果一致。表明TaSPX1基因可通過調節上述基因的表達增強植株對氮素的吸收轉運和同化過程來提高植株的氮素利用率, 對其抵御低氮脅迫的分子機制還有待進一步研究。

植物遭受非生物脅迫后會導致細胞自由基代謝失衡, 對細胞造成毒害和損傷, 引起過氧化氫(H2O2)和單分子氧(O2-)的積累[48]。已有研究表明,活性氧清除系統在植株抵御非生物脅迫中發揮重要作用。 在擬南芥中過表達VvWRKY30和GmWRKY49后通過提高ROS 清除系統相關POD、CAT 和SOD 酶活性或基因表達水平, 增強了植株對鹽的耐受性[49-50]。對大麥的研究發現, 耐低氮型比敏感型野生大麥SOD、POD 和CAT 酶活性增強,加強了細胞內活性氧清除能力, 表現出更強的耐低氮能力[51]。本研究表明, 低氮脅迫下, 過表達TaSPX1煙草株系的保護酶活性明顯高于野生型。另外發現保護酶相關基因NtFeSOD、NtCAT1;1、NtCAT1;3、NtPOD1;5、NtPOD4和NtPOD9等的表達量高于WT。保護酶活性水平的增強和基因表達水平的提高與MDA 含量下降的結果一致, 暗示了TaSPX1可能通過增強植株保護酶活性和基因表達兩個層面加強活性氧清除能力實現了對植株更有力的保護來抵御低氮脅迫。

迄今, 對成員眾多的SPX 家族基因功能與機制的研究主要集中在磷信號應答中, 本研究豐富了對該家族成員功能的新認識, 初步探究了TaSPX1應答低氮逆境的功能, 研究結果為作物抵御低氮營養逆境的遺傳改良提供了理論依據。

4 結論

從小麥中鑒定得到一個SPX 家族基因TaSPX1,該基因對低氮脅迫產生明顯應答, 編碼蛋白定位于核內。其與水稻SPX 亞族的OsSPX1 親緣關系較近。構建煙草過表達轉基因株系, 發現低氮脅迫下, 與野生型相比, 過表達株系增強了抗低氮脅迫的能力。進一步的分析表明TaSPX1可能通過加強保護酶系統、增強氮吸收和轉運以及改善光合能力等在介導植株抵御低氮脅迫中發揮重要作用。