玉米花序發育基因AFP1 的定位及功能研究

薛 明 汪晨晨 姜露光 劉 浩 張路遙 陳賽華,*

1 江蘇省作物基因組學和分子育種重點實驗室 / 植物功能基因組學教育部重點實驗室 / 江蘇省作物遺傳生理重點實驗室, 揚州大學農學院, 江蘇揚州 225009; 2 作物雜種優勢與利用教育部重點實驗室 / 國家玉米改良中心 / 中國農業大學農學院與生物技術學院,北京 100193

玉米(ZeamaysL.)是重要的糧食、飼料、工業和能源原料, 在保障糧食安全、經濟發展及緩解能源危機等方面起重要作用。玉米也是典型的雌雄同株異花植物, 其花序包括雌穗和雄穗, 它們是玉米產量的載體?；ㄐ虻恼０l育對穩定玉米產量具有根本性的意義。

玉米雌穗和雄穗早期的發育是相似的。由營養生長向生殖生長轉換時, 花序由葉腋處的腋生分生組織(axillary meristem, AM)按固有模式分化和發育形成[1]。首先葉腋處的AM 啟動, 逐漸膨大伸長形成花序分生組織(inflorescence meristem, IM)。在性別分化期間, 雌穗小花中的雄蕊敗育, 雄穗小花中的雌蕊敗育, 最終分別形成成熟的雌雄花序[2]。雌花序分生組織 IM 產生數目不等的成對小穗分生組織(spikelet-paired meristem, SPM)。而雄穗發育過程中花序分生組織IM 分化形成雄穗側枝分支分生組織(branch meristems, BM), 之后BM 分化形成SPM?；ㄐ蚍只纬傻腟PM 繼續分化產生2 個小穗分生組織(spikelet meristem, SM)[3], 進而分化形成小花分生組織(floral meristem, FM)。最后, 小花分生組織形成花器官[4]。

玉米花序發育是一個復雜的過程, 由許多基因共同調控[3,5-6]。目前被報道參與SM 分化的基因主要有:BD1[7]、IFA1(INDETERMINATEFLORAL APEX1)[8]、IDS1(INDETERMINATESPIKELET1)[9]和RGO1(REVERSEDGERMORIENTATION1)[10]等。BD1突變后, 改變雌穗小穗分生組織的命運, 產生許多分枝結構而無法形成小穗和花絲, 而雄穗側生小穗數量明顯增多[7];IDS1、IFA1和RGO1在調控SM 命運決定功能上存在一定的冗余[11]。SM 分化異常最終將會影響FM 的發育。目前已經被清楚解析影響 FM 分化的基因較少[12], 主要包括:BDE(BEARDEDEAR)與ZAG1(ZEAAGAMOUS1)互作調控小花分生組織的產生和花器官分生組織起始與活性的維持[13];Zmm16(Zeamaysmads16)影響雄花漿片和雄蕊轉變、以及雌花中雄蕊的退化[14];SI1(Silky1)突變后導致雄蕊轉換為心皮、漿片轉換為類似于內外稃的結構[15]。

BD1 蛋白由315 個氨基酸組成, 含有1 個保守的ERF/AP2 結構域[7], 該結構域是ERF 的DNA 結合域和行使轉錄調控的關鍵[16]。ERF/AP2 家族蛋白被證明在植物生長發育、生物與非生物脅迫以及生物合成方面均有重要作用[17]。BD1 蛋白功能喪失后,影響玉米雌雄穗的發育, 但對其上下游基因調控的分子機制還需要進一步挖掘。

玉米花序發育過程涉及選擇性細胞死亡、信號轉導等多種遺傳調控機制。近年來許多研究結果證明赤霉素(GA)[18]、細胞分裂素(CK)[19]、油菜素內酯(BR)[20]、生長素(IAA)[21]和茉莉酸(JA)[22-23]等多種植物激素參與玉米花序發育過程。而 BD1是否通過調控激素信號轉導途徑影響雌雄穗的發育尚不清楚。

本研究利用EMS 誘變的突變體庫材料, 篩選獲得玉米花序發育模式改變的突變體afp1。結合表型和基因型分析, 對afp1進行精細定位。進一步利用轉錄組測序和qRT-PCR 對afp1調控的代謝途徑和關鍵基因的表達量進行了分析和鑒定。本研究為后續afp1基因的定位以及功能研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

afp1為花序發育模式改變材料(Mo17 背景下的EMS 突變體材料, 中國農業大學賀巖教授饋贈)。利用afp1作為父本與B73 雜交后自交, 構建F2群體,用于基因定位。

1.2 田間試驗

試驗材料于海南樂東和江蘇揚州沙頭試驗基地種植, 種植株距為25 cm, 行距60 cm, 每行10株。水肥管理按照玉米常規栽培條件實施。

1.3 基因定位

根據 F2群體花序發育的表型, 隨機選取群體中花序正常發育的F2單株40 個, 平均分成2 份組成2 個混池樣本WM1 和WM2; 選取群體中花序發育異常的F2單株40 個, 平均分成2 份組成2 個混池樣本MM1 和MM2; 同步選取Mo17、afp1和B73材料各5 株分別組成混池, 利用Maize 6H-60K 芯片(遼寧東亞種業有限公司)對7 個混池材料的基因型進行鑒定。

芯片數據質控原則: (1) 保留Call Rates 大于等于80%的基因型位點; (2) 刪除沒有明確物理位置信息的基因型位點。親本afp1和B73 之間多態性SNP 篩選標準: (1) 刪除雙親中沒有多態性的SNP; (2) 刪除親本中未檢測到的基因型位點和雜合的基因型位點。

基于連鎖不平衡的原理, 首先尋找與表型連鎖的位點。隨后根據目標區段內自交系B73 和Mo17基因組差異設計分子標記, 利用后代群體中明確表型的交換單株, 對目標基因進行精細定位, 引物序列見表1。

表1 試驗中使用的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.4 總RNA 提取及測序

轉錄組測序材料為海南樂東基地種植F4分離群體, 待植株生長至抽雄期, 根據雄穗小花發育是否異常判定突變體表型材料和野生型表型材料, 同時利用分子標記M1722 和M1725 對基因型進行鑒定,選取候選區間純合的突變體材料和野生型材料發育早期的雌穗各3 株, 用液氮冷凍備用。

委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成RNA提取、文庫構建和轉錄組測序。選取突變體和對照材料的幼小雌穗組織, 利用TRIzol (諾唯贊, 南京)提取雌穗的總RNA。RNA 質量和純度分光光度計在波長為260 nm 和280 nm 條件下檢測。檢測合格樣品利用Oligo(dT)富集mRNA, 并通過Fragmentation Buffer 使其短片段化, 以短片段mRNA 合成雙鏈cDNA, 純化后進行末端修復、加堿基A、加測序接頭處理; 最后進行PCR 擴增完成測序文庫制備。采用Illumina NextSeq 550AR 平臺進行雙末端測序。

1.5 RNA-seq 數據分析

RNA-seq 數據過濾步驟如下: (1) 去除接頭;(2) 去除低質量的Reads (包括去除N 的比例大于10%和質量值Q≤10 的堿基數占整條Read 的50%以上的Reads)。經過上述一系列的質量控制之后得到的高質量的Clean Data。使用Hisat2 將質控后的clear reads比對到玉米參考基因組ZeamaysB73 Ref Gen_v4 ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/release-32/plants/fas ta/zea_mays/dna 上。通過FPKM (Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)對基因表達量進行標準化, 以FPKM＞1 為表達標準,隨后根據突變體與野生型材料基因表達量的比較,以| log2(Fold Change) |≥1 和P-value/FDR＜0.05)為標準確定差異表達基因(DEGs)。通過GO 富集分析DEGs 顯著富集的功能分類, 用KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)分析DEGs 主要參與的代謝途徑和信號通路。

1.6 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)分析

取500 ng 總RNA 利用反轉錄試劑盒(TaKaRa,日本)合成cDNA。使用SYBR Green RT-PCR 試劑盒(諾唯贊, 南京)進行定量qRT-PCR 檢測, 根據基因CDS 序列設計特異引物檢測基因的表達情況。利用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量,ZmGAPDH(Zm00001d049641)基因表達量作為對照。挑選的基因及使用的引物序列見表1, 每個基因的表達量統計均為3 次生物學重復和3 次技術重復。

2 結果與分析

2.1 表型鑒定

與野生型材料相比(圖1-A～E),afp1材料雌穗產生一系列側生分枝且無花絲形成(圖1-F～G); 雄穗側生小穗數量顯著增多(圖1-I)。經過多年多點鑒定該表型能夠穩定遺傳。對B73×afp1構建的F1群體植株的花序發育觀察發現, F1植株均正常發育; 進一步將構建的F1群體自交獲得F2分離群體, 通過統計突變表型植株和正常表型植株的數量后進行卡方測驗, 發現突變體表型和野生型表型的植株數量分離比符合1 ∶3 ( 表2), 說明afp1表型由1 對隱性核基因控制。

圖1 Mo17 和afp1 花序表型Fig. 1 Ear and tassel of Mo17 and afp1

表2 afp1 突變位點的遺傳分析Table 2 Genetic analysis of the afp1 locus

2.2 基因定位及候選基因預測

對F2代分離群體構建的混池樣本以及親本的基因型數據分析顯示: 4 個混池樣本的基因型缺失率從4.44%到5.01%變化, 雜合率均約43%左右; 親本B73 和afp1基因型缺失率分別為0.40%和1.83%, 雜合率分別為0.38%和8.78% (表3)。去除親本B73 和afp1的雜合基因型、缺失基因型以及兩者間無差異的基因型數據后共篩選到26,826 個高質量的SNP,且均勻分布在10 條染色體上, 說明芯片數據可靠。

表3 SNP 芯片檢測數據分析Table 3 Data analysis identified by SNP array

利用質控后獲得26,826 個高質量的SNP 對混池樣本的基因型進行鑒定, 并根據連鎖不平衡原理對候選基因進行初定位: 挑選WM1 和WM2 混池中樣本基因型為雜合、MM1 和MM2 混池中樣本基因型為純合的區段, 最終將候選基因定位在7 號染色體SNP 標記AX-107979066 和AX-107996145 之間, 并進一步通過與表型連鎖的分子標記M150 和M176對候選區段進行確認, 兩者之間物理距離約為 26 Mb。為了縮小定位區間, 利用后代群體以及新開發的14 對分子標記對候選基因進行精細定位, 將afp1精細定位在分子標記M1722 和M1725 間的300 Kb范圍內(圖2-A)。

圖2 afp1 精細定位及候選基因分析Fig. 2 Fine mapping of afp1 and analysis of candidate gene

分子標記M1722 和M1725 之間包含一個已知的花序發育基因BD1。利用afp1和Mo17 材料對BD1(Zm00001d022488)基因的CDS 和起始密碼子(ATG)上游～2 kb 的序列進行測序發現:BD1基因ATG 下游第199 位胞嘧啶C 突變為胸腺嘧啶T, 其余堿基序列均無變化(圖2-B)。該突變位點位于BD1 蛋白的AP2/ERF 結構域, 導致BD1 蛋白第67 位的氨基酸由精氨酸R 變為色氨酸W (圖2-B)。AP2/ERF 結構域為BD1 蛋白保守功能域(圖2-C), 且afp1材料花序的表型與BD1基因突變后植株表型一致[7], 說明afp1花序發育模式的改變可能是BD1 的R67W 造成的。

2.3 afp1 調控通路分析

為了進一步挖掘和探討afp1調控玉米花序發育的分子機制, 我們對野生型和突變體材料的幼嫩雌穗進行了RNA 測序(RNA-seq), 以分析afp1可能調控的代謝通路。6 個RNA-seq 文庫原始數據過濾分析后結果見表4。過濾后Q20 均大于96%, GC 含量約為55%, 單一位置序列比對率均大于82%, 表明測序數據質量良好, 可用于下一步分析。

表4 Illumina 測序數據組裝概述Table 4 Overview of the sequence assembly after Illumina sequencing

對野生型和突變體材料的基因表達量分析發現,在突變體材料和野生型材料間共有274 個差異表達基因, 其中154 (56.20%)個基因的表達量下調, 120(43.80%)個基因的表達量上調(圖3-A)。為了驗證RNA-seq 結果的準確性, 隨機選取6 個差異表達基因進行了qRT-PCR 分析(挑選基因和對應引物序列見表1)。結果如圖3-B 所示, 所挑選基因的表達量在突變體材料和野生型材料間均表現出顯著差異,與RNA-seq 數據一致。對qRT-PCR 與RNA-seq 結果進行相關性分析, 發現兩者的決定系數R2=0.81,說明RNA-seq 結果可靠。

圖3 差異表達基因火山圖及qRT-PCR 分析Fig. 3 Volcano plot of differentially expressed genes (DEGs) and the relative expression patterns of genes

為了探索差異表達基因的功能, 我們對差異表達基因進行GO 注釋分析。差異表達基因被注釋到17 個細胞組分、53 個分子功能和143 個生物過程。其中細胞組分分析中差異基因顯著富集在細胞核、胞外區域和質膜等組分類別; 分子功能分析中差異基因顯著富集在RNA 聚合酶II 調控區DNA 結合、蛋白質二聚化活性和DNA 結合等方面; 生物過程分析中差異基因顯著富集在遠軸細胞命運決定、RNA代謝或轉錄調控和莖尖分生組織發育等過程。

進一步對差異表達基因進行pathway 富集分析發現, 差異表達基因被注釋到56 條代謝通路中。以矯正的P＜0.05 為篩選標準, 未發現明顯富集的通路。KEGG 分析結果中最主要的10 條代謝通路為MAPK 信號途徑、氰氨酸代謝、二萜生物合成、淀粉和蔗糖代謝、檸檬烯和蒎烯降解、亞麻酸代謝、植物激素信號轉導、核糖核酸聚合酶、賴氨酸降解和苯并惡唑嗪酮的生物合成(圖4)。其中, 富集基因數量最多的3 個通路為MAPK 信號途徑、淀粉和蔗糖代謝以及植物激素信號轉導途徑。MAPK 信號途徑中富集的差異表達基因數目為7 個, 其中2 個基因下調表達, 5 個基因上調表達; 淀粉和蔗糖代謝中富集的差異表達基因數為5 個, 其中1 個基因下調表達, 4 個基因上調表達; 植物激素信號轉導途徑中富集到6 個差異表達基因, 其中5 個基因下調表達,1 個基因上調表達。植物激素信號轉導途徑富集83.3%基因的表達量都顯著下調, 說明這些激素信號可能在玉米花序發育中發揮重要作用。

圖4 基于差異表達基因的KEGG 分析Fig. 4 KEGG analysis based on the differentially expressed genes (DEGs)

多種植物激素已經被證明參與到玉米花序的發育過程, 對玉米花序的形態建成起到一定的調節作用。afp1突變后生長素、水楊酸和乙烯3 種激素信號途徑的基因表達發生顯著變化(表5)。其中, 生長素信號轉導通路富集到2 個差異表達基因, 表達量均下調; 水楊酸信號響應通路富集到3 個差異表達基因, 2 個基因表達量下調; 乙烯信號響應通路富集到1 個差異表達基因, 表達量下調。

表5 植物激素信號轉導路徑相關基因Table 5 Genes involved in phytohormone signaling pathway

為了進一步挖掘afp1調控的基因, 我們對差異表達基因進行注釋發現, 多個已被解析影響玉米花序發育的基因表達量都顯著下調, 包括調控FM 確定的基因Zm00001d017614(BDE)[13]、影響玉米雌雄穗發育和性別決定的基因Zm00001d008882(Zmm2)、Zm00001d037737(ZAG1)[24]和Zm00001d036425(SI1)[15]、調控心皮發育和花對稱發育的基因Zm00001d042618(Zmm16)[14]、Zm00001d028216(IFA1)和Zm00001d048083(DroopingLeaf1,DRL2)[25](圖5-A), 說明AFP1可能正調控這些基因的表達。

除上述已報道的Zmm2、ZAG1和Zmm16外, 多個MADS-box 基因家族(Zeamaysmads)成員的表達量也顯著下調, 包括Zm00001d048082(Zmm8)、Zm00001d051465(ZEAAGAMOUS5,ZAG5) 、Zm00001d031620(Zmm6)、Zm00001d028217(Zmm14)、Zm00001d010232(Zmm29)、Zm00001d023955(Zmm1)、Zm00001d010233(Zmm18)、Zm00001d006094(Zmm27)、Zm00001d021057(Zmm7)、Zm00001d015381(Zmm17)和Zm00001d041781(ZEAAGAMOUS2,ZAG2) (圖5-B)。其中Zmm29和Zmm18也已經被報道在玉米花序發育中可能與Zmm16的功能冗余[14]。

本研究還發現6 個主要在雌雄穗中表達的基因在afp1材料中表達量顯著降低(圖5-C), 而多個在雌穗中不表達或者表達量低的基因在afp1材料中表達量顯著增加(圖5-D), 例如,Zm00001d014840主要在根和雄穗中表達(https://www.maizegdb.org/), 而在afp1材料其表達量增加最顯著(圖3-B 和圖5-D), 說明這些基因可能參與玉米雌雄穗發育過程。

3 討論

根據前人報道,BD1參與玉米花序形態建成, 盡管BD1 蛋白在水稻和高粱等物種中只有45%至75%的同源性, 但它們AP2/ERF 結構域的氨基酸完全一致[7], 本研究中對不同作物BD1 蛋白AP2/ERF 結構域的氨基酸序列分析也發現了類似的結果, 說明該結構域的氨基酸序列非常保守?；?BD1 蛋白AP2/ERF 結構域氨基酸序列的保守性以及afp1表型與bd1表型基本一致, 本研究初步認為BD1第199位堿基由胞嘧啶C 突變為胸腺嘧啶T (BD1 蛋白第67 位氨基酸由R 變為W), 導致其功能缺失。同時也說明該位點可能是BD1 蛋白發揮作用的關鍵位點。

玉米花序形態建成需要多種激素的參與。玉米AM 的正常啟動和身份決定與生長素的調節密切相關[26]:BIF1和BIF4編碼的Aux/IAA 蛋白調控BA1的表達, 進而調控AM 的形成[21],BA1突變后, 玉米發育過程中不能啟動腋生分生組織, 導致植株只由莖和葉組成[27]; 高濃度CK 可以抑制雌蕊形成[19],促進細胞分裂素合成的基因KN1功能缺失后植株表現為頂端分生組織縮小, 產生稀疏的花序[28]; 內源赤霉素(GAs)在促進玉米雄蕊退化和抑制雌蕊原基敗育中也發揮重要作用[29-30]; 油菜素內酯(BR)生物合成途徑中的NA1突變后, 玉米植株會出現雄穗結實的現象, 而外源噴施BR 能抑制這種現象的發生[20]; 茉莉酸(JA)及其相關物質在決定玉米雌雄蕊發育中也發揮重要作用,SK-A7110突變后, 雌穗中JA 和JA-Ile 水平顯著增加, 導致雌蕊敗育[23], 影響玉米雄花花序發育的基因TS1和TS2突變體后, 內源JA 含量顯著降低, 而外源噴施JA 能夠恢復雄花花序發育[22]。本研究中的差異表達基因富集到3 種激素信號轉導途徑, 其中生長素信號途徑中GH3 家族基因(Zm00001d043350)表達量降低最顯著(log2(FC)=-6.38), 其同源基因OS01G0764800被證明在不同水稻品種開花期的表達量呈現顯著差異[31]; 此外, 水楊酸和乙烯信號途徑中多個基因的表達量也發生了顯著變化, 在玉米雌穗發育異常fea5(fasciatedear5)材料也發現了類似的現象[32], 說明水楊酸和乙烯信號轉導途徑也可能參與SM 和FM 的發育過程, 但還需要更多的試驗來驗證。

MADS-box 基因家族是植物中最大的家族之一,在花序發育過程中起著重要的作用[33]。本研究發現除3 個已經被解析參與玉米花序發育的MADS-box家族基因表達量顯著降低外, 其他多個MADS-box基因家族成員的表達量在afp1材料中的表達量也顯著下調, 說明這些基因可能在玉米花序發育中也發揮重要作用。同時, 多個在雌雄穗中特異表達的基因在afp1材料中表達量顯著降低、以及多個在雌穗中不表達或者表達量低的基因在afp1材料中表達量顯著增加, 說明AFP1可能調控這些基因的表達從而調控玉米FM 的形成。此外, 本試驗中還發現afp1材料中Zm00001d037708的表達量顯著提高(圖6-D), 該基因的同源基因在擬南芥中編碼尿苷二磷酸-糖基轉移酶(UGTs), UGTs 也被報道參與玉米花絲的形成[34], 因此,Zm00001d037708也可能通過編碼UGTs 調控玉米花序形態建成。

4 結論

本研究通過表型分析和連鎖分析對影響玉米花序發育的基因afp1進行定位, 并通過進一步精細定位將候選區間縮小至300 kb 的范圍內, 初步確定該候選基因為BD1。BD1 蛋白保守結構域ERF/AP2 的氨基酸R67W 的改變導致玉米花序發育異常, 說明該位點是BD1 蛋白發揮作用的關鍵。通過對afp1與野生型材料的幼穗組織進行RNA-seq 分析鑒定了274 個差異表達基因。對這些差異表達基因進行GO富集分析發現, 它們富集在17 個細胞組分、53 個分子功能和143 個生物過程。進一步KEGG 分析發現差異表達基因富集到多條代謝通路中。其中, 生長素、水楊酸和乙烯信號轉導途徑中富集的83.3%基因表達量都顯著下調, 說明afp1可能通過影響激素信號途徑從而調控玉米花序發育。