CXCR2在食管癌組織中的表達及其對食管癌細胞生物學行為的影響

黃叢改，劉 清，鄭樹濤，劉 濤，譚依依，彭天元，陳 嬌，盧曉梅

(新疆醫科大學第一附屬醫院，省部共建中亞高發病成因與防治國家重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011)

食管癌是全球發病率排位第8 和死亡率排位第6的惡性腫瘤，其中我國的發病率和死亡率最高[1]。在我國，食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)占總食管癌病例的90%以上。盡管ESCC多模式治療取得了重大進展，但晚期ESCC患者的5年生存率仍低于20%[2]。目前，食管癌的治療仍與腫瘤分期、分型及是否存在遠處轉移密切相關[3]。CXC 受體2(CXC receptor 2，CXCR2)編碼基因位于染色體2q33-q36，屬于7 次跨膜的G 蛋白(G protein-coupled receptors，GPCR)偶聯受體家族。CXCR2 在腫瘤微環境中的作用越來越得到重視，研究發現CXCR2參與腫瘤的發生發展及治療過程[4]。目前，CXCR2 拮抗劑SCH527123 在食管癌治療方面的作用鮮有報道。本實驗采用免疫組織化學技術檢測ESCC 組織及癌旁正常食管組織中CXCR2 的表達水平，分析CXCR2 表達與食管癌臨床病理特征的關系，并檢測CXCR2 拮抗劑SCH527123 對食管癌細胞生物學行為的影響，旨在為探索CXCR2 作為ESCC 的分子預測和靶向治療分子標志物提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 組織樣本與細胞系

選取經組織病理學確診手術切除的ESCC 組織74例作為研究組，患者術前均未行放療或化療；選取配對距離ESCC組織邊緣5 cm以上的正常食管組織74例作為對照組。ESCC 患者中男性66 例，女性8 例；年齡43～90歲，中位年齡63歲；腫瘤部位上、中、下段分別為2、23 和49 例；腫瘤大體分型縮窄型3 例、蕈傘型7 例、髓質型13 例、潰瘍型51 例；腫瘤直徑≤5 cm 者68 例，＞5 cm 者6 例；病理分級高分化者25 例、中-低分化者49 例；浸潤深度達黏膜下層者8 例、肌層15 例、外膜51 例；發生脈管瘤栓者24 例；神經侵犯者12例；淋巴結轉移者51例。

本研究經新疆醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準(KY2022274)，患者或其家屬知情同意。人食管癌細胞系KYSE30 購自武漢大學細胞庫，且經短串聯重復序列(short tandem repeats，STR)測序，證實為食管鱗狀細胞癌細胞株。

1.2 主要試劑

免疫組織化學一抗CXCR2 單克隆抗體購自美國R&D 公司，將一抗CXCR2(MAB331-100)按1∶100 標準化稀釋。通用二抗試劑及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司。PRMI-1640細胞培養液和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco 公司，CXCR2 拮抗劑SCH527123購自美國Selleck公司，CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自美國ApexBio公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學檢測CXCR2 在食管癌組織中的表達石蠟切片常規脫蠟至水，采用EnVision 法檢測74 例ESCC 及相應癌旁正常食管組織中CXCR2 的表達。用檸檬酸緩沖液(pH=6.0)高壓修復抗原。使用PBS代替一抗作為陰性對照，預實驗的陽性組織切片作為陽性對照。根據細胞染色強度和陽性細胞百分率進行免疫組織化學綜合評分，結果由2 位經驗豐富的病理專家完成獨立評價。細胞染色強度評分為：無著色計0分，黃色計1分，棕黃色計2分，黃褐色計3分；陽性細胞百分率評分為：腫瘤細胞無陽性顯色為0 分，陽性顯色≤10%為1 分，陽性顯色＞10%～50%為2 分，陽性顯色＞50%～80%為3 分，陽性顯色＞80%為4 分。將細胞染色強度和陽性細胞百分率得分相乘，總分＜4分判讀為CXCR2低表達，反之為高表達。

1.3.2 CCK-8 法及平板集落形成實驗檢測食管癌細胞的增殖本實驗分為兩組，常規PRMI-1640培養基培養的食管癌細胞為對照組，細胞培養基中添加了CXCR2 拮抗劑SCH527123(10 mmol/mL)的食管癌細胞為觀察組。將食管癌細胞KYSE30 每孔1 500 個細胞(100 μL)接種于96孔板中，培養于37 ℃，CO2體積分數為5%培養箱中，待細胞貼壁后更換培養基，其中，觀察組添加含有10 mmol/mL 的CXCR2 拮抗劑0.2 μL(根據前期預實驗結果濃度)，分別于SCH527123作用細胞24、48、72、96 h后，吸棄培養基，每孔新加入90 μL PRMI-1640 培養基+10 μL CCK-8 溶液，避光、混勻，繼續在培養箱中靜置2 h 后，使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度值。

平板集落形成實驗中，正常培養的食管癌細胞為對照組，培養基中添加了CXCR2拮抗劑SCH527123的食管癌細胞為觀察組，6孔板中每孔1 000個細胞，每組3個復孔，每孔2 mL培養基，培養過夜后，觀察組添加拮抗劑SCH527123 每孔2 μL，放入培養箱靜置培養，當培養皿底部有可見的細胞集落時，終止培養，用4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色。將6孔板置于白紙上拍照，使用ImageJ軟件對克隆細胞進行計數及定量分析。

1.3.3 Transwell 遷移和侵襲實驗將Transwell 小室放入24孔培養板中進行細胞遷移實驗。上室為無血清培養基200 μL，接種1×105個KYSE30細胞；下室為含血清培養液600 μL，添加10 mmol/mL 的SCH527123 0.6 μL。作用36 h后染色、拍照及統計。同時設常規培養的食管癌細胞為對照組。侵襲實驗在Transwell小室上室鋪Matrigel基質膠，其余操作同遷移實驗。

1.4 統計學分析

應用SPSS 16.0 統計軟件。各組計數資料以百分率(%)表示；組間比較采用χ2檢驗或Fisher's 精確檢驗進行分析。使用ImageJ 軟件、GraphPad Prism 8 軟件對細胞實驗數據進行統計分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CXCR2在ESCC組織中的表達

CXCR2 在研究組ESCC 組織及對照組癌旁正常食管組織的表達情況見圖1。CXCR2 棕黃色顆粒主要表達在細胞漿，部分在細胞膜。經統計分析結果顯示，對照組的CXCR2 高表達細胞占13.5%(10/74)，而研究組CXCR2 高表達細胞占73.0%(54/74)，較對照組顯著升高，差異具有統計學意義(χ2=53.298，P=0.000)，見表1。

表1 CXCR2在食管鱗癌組織中的表達情況

圖1 免疫組織化學檢測食管鱗癌組織CXCR2的表達

2.2 CXCR2表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系

食管鱗癌組織中CXCR2 的表達水平與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大體分型、腫瘤直徑、浸潤深度、脈管瘤栓及神經侵犯均無顯著相關關系(P＞0.05)，但與ESCC的病理分級(χ2=5.515，P=0.019)和淋巴結轉移(χ2=7.320，P=0.007)間的差異均具有統計學意義，見表2。

表2 食管鱗癌組織中CXCR2表達與臨床病理特征的關系

2.3 抑制CXCR2表達對食管癌細胞增殖能力的影響

相較于對照組，CCK-8細胞增殖實驗和平板集落形成實驗結果均顯示，添加CXCR2拮抗劑SCH527123后顯著抑制了KYSE30食管癌細胞的增殖(圖2)。

圖2 CXCR2拮抗劑SCH527123對食管癌細胞增殖能力的影響

2.4 抑制CXCR2 表達對食管癌細胞遷移和侵襲能力的影響

與對照組比較，添加CXCR2 拮抗劑SCH527123后，KYSE30 細胞遷移數量較對照組明顯減少。統計分析結果顯示，抑制CXCR2的表達可明顯抑制食管癌細胞KYSE30 的遷移能力(P＜0.01，圖3)。將Transwell小室上室鋪Matrigel 基質膠，進一步檢測了CXCR2 拮抗劑SCH527123對食管癌細胞侵襲能力的影響，結果發現添加了拮抗劑的觀察組食管癌細胞KYSE30 侵襲能力明顯低于對照組(P＜0.01，圖4)。

圖3 CXCR2拮抗劑SCH527123對食管癌細胞遷移能力的影響

圖4 CXCR2拮抗劑SCH527123對食管癌細胞侵襲能力的影響

3 討 論

CXCR2 是G 蛋白偶聯受體，能夠促進血管生成[5]。研究發現腫瘤細胞可通過自分泌方式分泌趨化因子與CXCR2 結合，或以旁分泌方式結合CXCR2，促進腫瘤細胞的生長；CXCR2還可激活基質細胞，促進腫瘤血管生成、轉移擴散和免疫逃逸[6]，提示腫瘤細胞在CXCR2的作用下實現了自身的增殖和轉移。而Wu等[7]研究發現沉默CXCR2顯著降低了食管癌細胞在體內的生長，并通過ERK1/2 途徑誘導細胞凋亡來預防食管癌[7]。

本研究結果顯示，食管鱗癌組織中CXCR2的陽性表達明顯高于癌旁正常食管組織，表明CXCR2在食管鱗癌組織中表達上調，推測其可能具有癌基因的功能；且CXCR2的高表達與食管鱗癌分化程度差和淋巴結轉移密切相關，即食管癌患者腫瘤分化越差、淋巴結出現轉移時CXCR2表達越高，預示食管鱗癌不良預后。既往研究[8]表明CXCR2 表達與淋巴結轉移顯著相關，是ESCC 切除后的不良預后因素；CXCR2 表達陽性的食管癌患者5 年生存率和預期生存時間顯著低于陰性者[9]；ESCC 組織中CXCR2 呈高水平表達且與TNM 分期、淋巴結轉移和遠處轉移關系密切[10]；術后出現并發癥的CXCR2呈陽性表達的食管癌患者預后較差[11]。本實驗結果與先前研究報道一致。綜合本實驗結果和文獻報道，表明CXCR2 在食管癌組織中高表達，CXCR2陽性表達促進食管癌的遷移和侵襲，預后不良。

SCH527123 是一種有效的、變構的口服活性CXCR2 拮抗劑[12]。關于SCH527123 在腫瘤中的作用已有相關報道。研究[13]顯示，口服SCH527123 選擇性靶向CXCR2 是抑制黑色素瘤生長和血管生成的一種有前景的治療方法；SCH527123 還可抑制卵巢腫瘤細胞遷移和侵襲，下調STAT3 和AKT 磷酸化以及survivin表達[14]。CXCR2 拮抗劑SCH527123 通過抑制IL-8/CXCR1/2 信號通路可降低人胰腺癌細胞的惡性特征[15]，并能抑制結直腸癌的增殖以及能增強體內外結直腸癌細胞對奧沙利鉑敏感性[16]。

但目前，關于SCH527123在食管癌中的作用尚未見報道。于是，本文進一步用CXCR2 拮抗劑SCH527123作用于食管癌細胞KYSE30，觀察CXCR2 的表達被拮抗后食管癌細胞生物學行為變化。結果顯示，相較于對照組，SCH527123 可顯著抑制KYSE30 食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

已知CXCR2 配體有7 個趨化因子：CXCL1/2/3、CXCL5/6/7/8。有報道提示CXCLs/CXCR2 軸可能通過維持和促進癌癥干細胞(cancer stem cells，CSCs)的遷移在腫瘤的進展和轉移中發揮重要作用，這些CSCs周圍的內皮細胞不僅可以分泌CXCLs，還可上調CSCs中CXCR2的表達，從而增強CSCs的遷移和生長[17]。查閱國內外相關文獻，目前關于CXCLs/CXCR2 在食管癌中的研究報道不多。Yang等[18]的研究表明直接干擾腫瘤細胞源性CXCL1 或抑制CXCL1/CXCR2 通路可有效恢復食管癌患者體內放射耐藥異種移植物的放射敏感性，CXCL1 通過CXCR2-STAT3 通路進一步激活癌癥相關成纖維細胞來驅動食管癌放射耐藥。CXCL8/CXCR2或IL-8/CXCR2表達升高與ESCC患者的腫瘤進展、轉移以及不良預后相關[19-20]。目前，CXCR2 參與食管癌患者預后的確切機制尚不完全清楚，需要深入探究，另外用動物模型驗證CXCR2拮抗劑的作用也將是我們下一步的工作計劃。

總之，本研究結果顯示食管鱗癌組織中CXCR2表達水平上調，且與患者的不良預后相關。CXCR2的拮抗劑SCH527123 可顯著抑制食管癌細胞KYSE30 的增殖、遷移和侵襲，推測CXCR2可能為食管鱗癌潛在的預測和靶向治療的分子標志物。