擴大分散液液微萃取法測定水中20種有機氯和菊酯農藥殘留

芮鴻飛，吳俊，羅淑文，歐陽曉潔，劉曉穎，吳峰華

(1.杭州市臨安區疾病預防控制中心，浙江 杭州 311300；2.浙江農林大學 現代農學院，浙江 杭州 311300)

有機氯農藥(organochlorine pesticides，OCPs)作為主要的殺蟲劑，在我國20世紀60—70年代曾廣泛使用[1]，是一類重要的難降解有機物，具有生物累積性、生物放大作用和致癌、致畸、致突變作用[2-3]。80年代開始，我國對部分有機氯農藥已嚴令禁止生產和使用，但由于有機氯難降解，在國內外很多水體和沉積物中仍能檢測到它們的存在[4]。擬除蟲菊酯類農藥(pyrethroid pesticides)是一類能防治多種害蟲的廣譜殺蟲劑，對昆蟲具有強烈的觸殺作用，具有低毒、高效、低殘留的特點，在農作物生產過程中使用廣泛[5]。菊酯類農藥對哺乳動物具有中等的免疫系統毒性、神經毒性等多種潛在的毒性，人體長期接觸低劑量的菊酯類農藥也會引起慢性疾病[6]。

由于有機氯和擬除蟲菊酯農藥存在一定的同分異構體，且受樣品本身基質的影響，這2類農藥殘留檢測較為困難。目前，有機氯和擬除蟲菊酯檢測方法有氣相色譜法、氣相質譜法、液相色譜-質譜聯用等方法，常見的前處理方式有液液萃取、固液萃取、固相萃取、固相微萃取、懸浮固化微萃取和DLLME[7-8]。其中，DLLME是在液液萃取的基礎上進行改進的，通過形成水相、分散劑、萃取劑三元渾濁體系，增大了目標物與萃取劑的接觸面積，從而高效快速地將目標物萃取出來[9]。與傳統萃取技術相比，DLLEM具有有機試劑用量少、萃取時間短、富集倍數高等優點，因而被廣泛應用[10]。但DLLME最終樣液往往只有十幾甚至幾微升，無法通過儀器批量自動進樣，且易揮發，給實驗過程帶來不便。

本文將液液分散微萃取體系擴大，建立了擴大分散微萃取結合GC-ECD測定飲用水中20種有機氯和菊酯農藥殘留方法，優化了DLLME萃取體系中提取劑和分散劑的種類和體積、鹽含量、萃取時間等條件。該方法簡單、穩定可靠，最終樣液體積能夠滿足自動進樣的要求，拓展了DLLME應用的范圍，使實驗更具有可操作性，可為相關檢測和日常監管工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津2010plus氣相色譜儀，配ECD檢測器(日本島津公司)；高速冷凍離心機，Heraeus Multifuge X1R(Thermo Fisher Scientific)；電子天平，JJ600Y(常熟市雙杰測試儀器廠，常熟)；氮吹儀，N-EVAP112(USA Organomation)；渦旋振蕩器，MS 3 B S25(GER IKA)；離心機，mini G S25(GER IKA)；數控超聲波清洗器，KQ-500DE(昆山市超聲儀器有限公司，昆山)；250 μL內插管(美國安捷倫公司)。

20種有機氯及菊酯標準品(濃度為100 μg·mL-1的、α-六六六、六氯苯、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、七氯、環氧七氯、硫丹、p，p′-DDE、p，p′-DDT、o，p′-DDT、p，p′-DDD、三氯殺螨醇、聯苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯)，購于北京標樣部。三氯甲烷(分析純)購于華東醫藥股份有限公司，四氯化碳(分析純)、四氯乙烯(分析純)均購于Aladdin公司，乙腈(色譜純)、正己烷(色譜純)均購于TEDIA公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

分別移取各有機氯標準原液1.0 mL于25 mL容量瓶中，正己烷定容，得到濃度4.0 μg·mL-1的有機氯準備溶液，移取各擬除蟲菊酯原液1.0 mL于10 mL容量瓶中，正己烷定容，得到濃度為10 μg·mL-1的有機氯儲備溶液；然后將有機氯儲備溶液稀釋成0.10 μg·mL-1、擬除蟲菊酯儲備溶液稀釋成0.2 μg·mL-1的標準使用液，再逐階稀釋成系列梯度溶液，待分析。

1.2.2 樣品前處理

取40 mL水樣置于50 mL離心管中，加入4 mL乙腈(分散劑)，混勻后，加入400 μL三氯甲烷(萃取劑)，漩渦振蕩30 s，以5 000 r·min-1的速度離心3 min，將下層三氯甲烷沉積相(210 μL)吸出，置于1.5 mL塑料離心管中，氮吹至干，100 μL正己烷復溶，吸出置于有250 μL內插管的進樣瓶中，待GC-ECD分析。

1.2.3 色譜條件

DB-5石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 μm×0.25 μm，美國安捷倫)；進樣口溫度為220 ℃；ECD檢測器溫度為320 ℃；載氣為高純氮，柱流量為1 mL·min-1；升溫程序：80 ℃保持1 min，以40 ℃·min-1速率升至160 ℃，以5 ℃·min-1上升至200 ℃(保持5 min)，以8 ℃·min-1上升至240 ℃，以5 ℃·min-1上升至290 ℃(保持3 min)，以30 ℃·min-1上升至300 ℃(保持3 min)；進樣方式為分流進樣，分流比為1∶10，進樣量為1.0 μL。

1.3 計算方法

分散液液萃取中富集因子(enrichment factor，EF)和萃取回收率(extraction recovery，ER)是判斷DLLME方法有效率的重要參數。EF的定義為萃取后有機相中分析物的濃度(Csed)與萃取前水中分析物濃度(C0)的比值，即：EF=Csed/C0；ER是萃取后有機相中分析物的含量(n)相對于樣品中分析物含量(n0)的占比，即ER=n/n0。

1.4 數據分析

采樣Excel 2007和SPSS 22.0進行數據整理和分析。萃取效率研究時，同分異構體以總面積進行比較。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確認

分別利用DB-5(30 m×0.25 μm×0.25 μm)、RTX-5(30 m×0.25 μm×0.25 μm)、SK-5(60 m×0.25 μm×0.25 μm)對20種有機氯及擬除蟲菊酯標準溶液進行色譜分析，RTX-5的p，p′-DDT和o，p′-DDD出現峰重合現象，DB-5和SK-5色譜柱的峰形較好，但SK-5色譜柱色譜時間過長，因此，選用DB-5色譜柱，對程序升溫的初始溫度及升溫速率進行優化，結果見1.2.3節。同時考慮到p，p′-DDT、p，p′-DDD等組分會因進樣時溫度過高而降解[11]，導致回收率偏低，因此，進樣口溫度控制在220 ℃，以保證回收率。在此條件下，20種有機氯及擬除蟲菊酯實現了基線分析，各組分之間無干擾，且各組分不受水體基質的影響，加標色譜見圖1。

1—α-666；2—六氯苯；3—β-666；4—γ-666；5—δ-666；6—七氯；7—環氧七氯；8—硫丹-Ⅰ；9—p，p′-DDE；10—硫丹-Ⅱ；11—p，p′-DDT；12—o，p′-DDD；13—p，p′-DDD；14—三氯殺螨醇；15—聯苯菊酯；16—甲氰菊酯；17—氯氟氰菊酯；18—氟氯氰菊酯；19—氯氰菊酯；20—氰戊菊酯；21—溴氰菊酯。圖1 20種有機氯和菊酯農藥加標色譜圖Fig.1 Chromatograms of 20 organochlorine and pyrethroid pesticides

2.2 擴大分散液液微萃取條件的確認

2.2.1 萃取溶劑的選擇

萃取劑的選擇對提取效率影響顯著，一般所選用的提取劑應該密度大于水且不溶于水，對目標物有良好的提取能力，性質穩定，色譜峰良好且與目標物區[12]。本研究選擇了三氯甲烷、四氯化碳、四氯乙烯作為提取劑進行實驗，移取有機氯及菊酯農藥標準使用液各10 μl于40 mL超純水中，制得0.5 μg·L-1的有機氯及菊酯農藥模擬水樣，分別用400 μL三氯甲烷、四氯化碳、四氯乙烯作為萃取劑，在4 mL乙腈為分散劑的條件下進行實驗。由圖2可知，四氯化碳作為萃取劑萃取效率最差，三氯甲烷和四氯乙烯較好，同時三氯甲烷比四氯乙烯穩定性更佳，因此，本實驗選取三氯甲烷作為最佳萃取劑。

圖2 萃取劑種類對DLLME萃取效率的影響Fig.2 Effect of extractant type on DLLME extraction efficiency

2.2.2 萃取劑體積的選擇

萃取劑的用量決定了方法的富集倍數和萃取效率。本實驗考察了不同三氯甲烷體積(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL)對方法富集倍數和萃取效率的影響，結果如圖3所示。隨著萃取劑體積的增加，峰面積逐漸減少，富集效率越低。當三氯甲烷為0.2 mL時，因體積過小，無法對目標物進行充分提取，且最終沉積相體積約90 μL，體積過小時，偏差較大，且溶劑置換后再次被稀釋，所以峰面積相差較大。綜合考慮操作性，三氯甲烷體積選擇0.4 mL進行實驗。

圖3 萃取劑體積對DLLME富集效率的影響Fig.3 Effect of extractant volume on DLLME enrichment efficiency

2.2.3 分散劑的選擇

分散劑可以促使萃取劑形成微小液滴，使萃取劑均勻分散于溶液中，增大萃取劑與目標物的接觸面積，從而提高萃取效率；實驗通常要求分散劑有良好的色譜行為，以及萃取劑在其中的溶解性要大于在水中的溶解性[13]。本實驗對不同分散劑(甲醇、乙腈、丙酮)進行考察，選用甲醇作為分散劑時，可能是由于甲醇在水溶液中的溶解度較大，導致離心后沉積相較少，萃取效率較低；用乙腈和丙酮作為分散劑時萃取效率接近，但丙酮作為分散劑時，α-666、六氯苯、β-666和氯氟氰菊酯的重復性較差，所以選擇乙腈作為分散劑。

2.2.4 分散劑體積的選擇

分散劑的用量影響著三元渾濁體系的形成，理論上，在一定范圍內增加分散劑的用量，其萃取效率會隨之增大；然而，當分散劑用量過多時，萃取劑會大量溶解于其中，進而導致目標物在水中的溶解度增大而不易被萃取出來[13]。本文考察了不同乙腈體積(2、3、4、5、6 mL)對萃取效率的影響，隨著乙腈體積的增加，萃取效率也隨之增加，當乙腈超過5 mL后，提取效率逐漸降低。4 mL乙腈的萃取效率和5 mL乙腈萃取效率差異不大，綜合考慮選擇乙腈體積為4 mL。

2.2.5 鹽離子濃度的影響

研究[14]表明，適當增加水中鹽濃度可以使目標分析物在水中的溶解度減小，從而提高有機溶劑對目標分析物的提取效率?；诖?，本研究在保持其他條件不變的情況下通過向水樣中添加不同量的NaCl(0.0%、2.5%、5.0%、10.0%、15.0%)，考察了鹽效應對萃取效果的影響。結果表明，鹽濃度對提取效率影響不顯著，當鹽濃度增加時，p，p′-DDT和氟氯氰菊酯等組分的萃取效率反而有所降低，這是由于隨著水中鹽濃度的增加，目標分析物在水中溶解度減少的同時，萃取劑在水中的溶解性也隨之降低，從而導致萃取溶劑體積變大，富集系數變小，萃取效率降低；同時鹽含量的增加，也使水中目標分析物的傳質系數變差，從而影響萃取效率[15]。實驗過程中還發現，NaCl中的部分農殘本底也對提取過程造成一定的影響。因此，本實驗選擇不添加NaCl。

2.2.6 萃取時間的影響

萃取時間即萃取劑、分散劑、水3項混勻萃取的時間。本實驗對不同萃取時間(15、30、90、120 s)進行了比較，結果表明，萃取30 s比萃取15 s的萃取效率略有增加，30 s后，萃取時間對各組分萃取效率影響不顯著，因此，本實驗選取30 s為萃取最佳時間。

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線和檢測限

配置0.002～0.10 μg·mL-1的有機氯及0.01～0.20 μg·mL-1的擬除蟲菊酯混標系列溶液，按上述優化后的條件處理，進行GC-ECD分析。以標準系列梯度溶液的濃度為橫坐標，以各組分峰面積為縱坐標，繪制標準曲線；將加標樣品梯度稀釋后進樣，以(S/N)≥3計算方法檢出限，以(S/N)≥10計算方法定量限(表1)。20種有機氯及擬除蟲菊酯分別在0.002～0.10 μg·mL-1、0.01～0.20 μg·mL-1范圍內曲線良好，r>0.998，檢出限在0.001～0.002 μg·L-1，定量限在0.003～0.00 6 μg·L-1，方法富集倍數在168～206，與相關研究[16-18]的報道相近。

表1 20種有機氯及擬除蟲菊酯農藥的線性范圍、線性方程、檢出限Table 1 Linear ranges，linear equations and detection limits of 20 organochlorine and pyrethroid pesticides

2.3.2 回收率和精密度

以空白自來水為研究對象，加入一定量的有機氯及擬除蟲菊酯標準溶液，配成各組分濃度為0.025、0.05、0.25 μg·L-1的加標水樣，按上述前處理方法處理后檢測分析，重復6次，計算其相對標準偏差(RSD)。由表2可知，各組分在3個水平濃度上的加標回收率在83.30%～116.70%，RSD在0.84%～9.87%，表明本方法準確性高，穩定性好，能夠滿足飲用水中20種有機氯及擬除蟲菊酯殘留的測定。

2.3.3 自來水樣本的測定結果

對135個農村飲用水進行檢測。檢測結果顯示，水樣中未檢出擬除蟲菊酯；有不同濃度的有機氯農藥檢出，檢出率最高的是七氯(55.8%)和γ-HCH(38.2%)，檢出濃度最高的是六氯苯，其濃度范圍為1.7～132.5 ng·L-1，平均濃度為21.6 ng·L-1，γ-666的檢出濃度僅次于六氯苯，濃度范圍為1.5～127.4 ng·L-1，平均濃度為17.3 ng·L-1。所測水樣中OCPs均遠低于GB 5749—2006《生活飲用水衛生標準》及美國國家環境保護局(US EPA)中規定的OCPs的限量值。

3 結論

本文建立了擴大分散微萃取結合GC-ECD測定飲用水中20種有機氯和菊酯農藥殘留方法，結果表明，該方法具有良好的回收率和重復性，操作簡單，能夠滿足自動進樣時最終樣液體積的要求，使實驗更具有可操作性，適合大批量檢測水中多組分農藥殘留的實際需要。