miR-485-5p靶向氧連接的N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移與侵襲

胡東來, 趙梓岐, 李 元, 楊 麗, 雷艷麗, 楚元奎, 3)*

(1)寧夏醫科大學臨床醫學院檢驗學系, 銀川 750004;2)寧夏醫科大學基礎醫學院科研平臺, 銀川 750004;3)寧夏醫科大學總醫院醫學實驗中心, 銀川 750004)

前列腺癌是男性生殖系統最常見的惡性腫瘤[1],雄激素剝奪療法是轉移性病例的主要治療方法之一,然而,有相當一部分接受雄激素剝奪療法治療的患者最終卻進展為更為惡性的去勢抵抗性前列腺癌[2]。因此,探索前列腺癌發生發展的調控機制和尋找潛在的治療靶點是目前亟待解決的問題之一。

微RNA(microRNAs,miRNAs)是長度約為21～24核苷酸的非編碼RNA分子,其主要功能是通過靶向信使RNA(mRNA)轉錄物來調節基因表達和細胞的生物學過程[3]。研究表明,miR-485-5p通過靶向原癌基因酪氨酸蛋白激酶(Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src , SRC)在體內外抑制卵巢癌的進展[4]、通過靶向跨膜糖蛋白Mucin 1 (Transmembrane glycoprotein Mucin 1 , MUC1)抑制乳腺癌的進展[5],以及通過負向調控角蛋白17 (Keratin 17, KRT17)抑制口腔鱗狀細胞癌的進展[6]。然而,miR-485-5p在前列腺癌中發揮的作用鮮有報道。因此,明確miR-485-5p在前列腺癌中所發揮的作用與機制,有助于了解前列腺癌發生發展的內在原因。

氧連接的N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶(O-linked N-acetylglucosamine transferase, OGT)屬于多糖轉移酶家族,在碳水化合物活性酶數據庫中被分類為糖基轉移酶41家族的成員[7],已報道OGT與癌癥特異性細胞死亡之間存在顯著相關性[8, 9]。由于其是細胞增殖所必需的,但細胞在有絲分裂后在無它的情況下也能存活,這使得該酶成為典型的癌癥靶標[10]。OGT是一種參與癌細胞中氧非依賴性葡萄糖和谷氨酰胺消耗的酶,通過原癌基因MYC調節有絲分裂細胞代謝的相互作用而發展雄激素非依賴性前列腺癌,并在侵襲性前列腺癌中最常高表達[11]。先前的研究證實,在食管癌中,miR-485-5p通過靶向OGT抑制食管癌細胞增殖、遷移與侵襲[12],但miR-485-5p/OGT軸在前列腺癌中發揮的作用尚未報道,有待進一步研究。

鑒于此,本文旨在探究miR-485-5p是否靶向調控OGT從而影響前列腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲,明確miR-485-5p/OGT軸在前列腺癌進展中所發揮的作用,以期為前列腺癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 前列腺癌細胞系PC3、DU145、LNCaP、22Rv1及正常前列腺上皮細胞RWPE-1均來源于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫(上海)。

1.1.2 RPMI 1640培養基、DMEM培養基(上海源培生物科技股份有限公司);特級胎牛血清(BI,以色列);LipofectamineTM2000(Invitrogen公司,美國);miR-485-5p mimics與inhibitor、mimics NC、 inhibitor NC、si-OGT、si-NC、含miR-485-5p結合位點的Wt-OGT和Mut-OGT熒光素酶表達載體(上海吉瑪制藥技術有限公司);mimics、inhibitor、si-OGT、及各NC序列詳見Table 1;TRNzol Universal總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司);雙熒光素酶檢測試劑盒(北京全式金生物生物技術股份有限公司);逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);引物(上海生工生物工程股份有限公司)。GAPDH抗體(Proteintech公司;美國);OGT抗體(immunoway公司,美國);山羊抗兔 IgG-HRP、山羊抗鼠 IgG-HRP(Proteintech 公司,美國);全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)。

Table 1 Sequence

1.1.3 CO2恒溫培養箱(Thermo Fisher Scientific,美國);倒置熒光顯微鏡(Olympus Corporation,日本);熒光定量PCR儀(Applied Biosystems ,美國);化學發光成像系統(GE通用電氣,美國);電泳儀(Bio-rad,美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染 DU145、PC3、LNCaP細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基、22Rv1細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基、RWPE-1細胞用前列腺正常上皮細胞專用培養基培養,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養,隔天換液,待細胞生長匯合度達90%左右時進行傳代。將對數生長期的細胞用胰酶消化、重懸后接種在六孔板中用于轉染。當細胞生長匯合度達到50%～70%時,參考LipofectamineTM2000試劑說明書,分別將miR-485-5p mimics及inhibitor、si-OGT及對應NC轉染到PC3和DU145細胞中,轉染終濃度為50 nmol/L,培養24 h～48 h進行后續實驗。

1.2.2 平板克隆形成實驗 將轉染48 h后的PC3和DU145細胞,消化后重懸成單個細胞懸液,于12孔板中鋪板,再放置培養箱中繼續培養,每3 d換液1次,培養9～14 d。PBS潤洗細胞,用4%多聚甲醛進行固定,再用0.1%結晶紫水溶液染色,PBS潤洗細胞,自然風干后計數細胞克隆數量,并計算克隆形成率。

1.2.3 劃痕愈合實驗 用0.25%胰蛋白酶消化處于對數生長期的PC3和DU145細胞,細胞重懸后,以3×105個/孔細胞數量鋪于六孔板中,待細胞生長匯合度達50%～70%時進行轉染。用1 mL吸頭進行劃痕,PBS洗去漂浮的細胞,分別在0 h、24 h拍照,記錄劃痕的寬度并計算細胞遷移率。

1.2.4 Transwell實驗 以無血清培養基1∶8稀釋Matrigel基質膠,侵襲實驗組每個小室中垂直加入60 μL稀釋好的基質膠,室溫靜置使基質膠充分凝固,遷移實驗組的小室不鋪膠。收集分組轉染24 h后的細胞,即胰酶消化,用無血清培養基重懸,并接種在上室中,保持上室終體積為200 μL,下室加入700 μL含20%血清的完全培養基,放入培養箱中培養24 h。用4%多聚甲醛進行固定以及0.1%結晶紫水溶液加以染色、PBS潤洗、棉簽輕輕擦去小室底部上層細胞,室溫風干,顯微鏡下拍小室底部下層的細胞圖片,imageJ軟件計數遷移與侵襲的細胞數量,分別計算遷移率和侵襲率,遷移率=[(遷移的細胞數)/(接種的細胞數)]×100%,侵襲率=[(侵襲的細胞數)/(接種的細胞數)]×100%。

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗 構建含miR-485-5p結合位點的Wt-OGT和Mut-OGT熒光素酶表達載體(上海吉瑪制藥技術有限公司),取對數生長期的293T細胞進行鋪板,將miR-485-5p mimics、 mimics nc、Wt-OGT、Mut-OGT分組共轉染,24 h后收集細胞樣品,具體參考TransDetect?Double-Luciferase Reporter Assay Kit 試劑盒(北京全式金生物生物技術股份有限公司)說明書進行熒光素酶活性的檢測。

1.2.6 qRT-PCR 實驗 Trizol 法提取各組總RNA,測濃度和純度,確保濃度和純度達標后,按照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR和 ChamQ SYBR qPCR master Mix 試劑盒說明書(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進行反轉錄和qRT-PCR檢測,引物序列詳見Table 2。反應條件:95 ℃、5 min,95 ℃、15 s,58 ℃、15 s,72 ℃、15 s,設40個循環,以GAPDH、U6作為內參,2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。

Table 2 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.7 Western 印跡實驗 各組細胞培養 48 h后,提取細胞總蛋白質,BCA法測其濃度,取20～30 μg蛋白質上樣,SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質后,轉印至PVDF膜上,用5% 脫脂牛奶于室溫搖床封閉2～3 h,PBST每次10 min漂洗3次后,加入相應一抗,4 ℃孵育過夜,回收一抗,PBST漂洗3次后,加入二抗,室溫孵育1 h,再次3次漂洗,加入ECL化學發光液顯影,以GAPDH為內參進行統計學處理。

1.3 統計學分析

數據以平均數±標準差(means ±SD)方式表示,所有實驗均生物學重復3次,采用SPSS.26及Graphad Prism 9.4.1 軟件進行統計分析,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用方差分析,以雙側P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-485-5p在前列腺癌中表達下調

借助dbDEMC網站 (biosino.org)現有數據集對前列腺癌中差異表達的miRNA進行預測,分析結果發現,與前列腺癌旁組織相比miR-485-5p在前列腺癌組織中低表達(P=1.16e-2,Fig.1A-B),并且經查閱文獻得知,在前列腺癌中研究其表達、功能和作用機制的報道甚少,因此,選擇相對新穎的miR-485-5p分子作進一步研究。通過qRT-PCR技術檢測miR-485-5p在前列腺正常上皮細胞與癌細胞系中的表達差異,結果顯示,與在前列腺正常上皮細胞RWPE-1中的表達量(1.00 ± 0.06)相比,miR-485-5p在PC3(0.35 ± 0.03)、DU145(0.38 ± 0.01)及LNCaP(0.42±0.05)細胞系中呈低表達,且差異具有統計學意義(P<0.01,Fig.1C),考慮到與LNCaP細胞相比,PC3和DU145細胞具有更強的增殖、遷移及侵襲能力,并且更能代表前列腺癌發展的晚期階段,因此,在接下來的探索方面選擇在PC3和DU145細胞中研究miR-485-5p的功能及相關調控機制。

Fig.1 The expression of miR-485-5p in prostate cancer tissue and cells (A-B) Heat map analysis of miR-485-5p was performed in the dbDEMC website and its expression in prostate cancer tissues was analyzed. (C) The expression of miR-485-5p in prostate cancer cell lines was detected by qRT-PCR.**P<0.01. n=3

2.2 miR-485-5p抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移與侵襲

采用qRT-PCR技術檢測miR-485-5p在2種細胞中的轉染效果,在PC3細胞中,與mimics NC組 (1.00 ± 0.09) 相比,miR-485-5p mimics組表達量顯著上調(1.30 ± 0.07) ,在DU145細胞中,與mimics NC組(1.01 ± 0.12)相比,miR-485-5p mimics組表達量顯著上調( (16.08 ± 0.13),差異具有統計學意義(P<0.05, Fig.2A-B)。通過平板克隆形成實驗檢測miR-485-5p對前列腺癌細胞增殖能力的影響,結果顯示, PC3細胞中,與mimics NC組(100.00% ± 9.00%)相比,過表達miR-485-5p能夠顯著抑制PC3細胞的克隆形成率(59.33% ± 3.51%),DU145細胞中,與mimics NC組(100.30% ± 6.42%)相比,過表達miR-485-5p同樣能夠顯著抑制DU145細胞的克隆形成率(71.0% ± 8.54%),差異具有統計學意義(P<0.01, Fig.2C-E)。采用Transwell實驗檢測miR-485-5p對前列腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響,結果顯示,PC3細胞中,分別與遷移的mimics NC組(99.00% ± 8.54%)和侵襲的mimics NC組(100.00% ± 9.00%)相比,過表達miR-485-5p能夠顯著抑制PC3細胞的遷移率(59.33% ± 6.51%)和侵襲率(44.67% ± 4.51%),DU145細胞中,分別與遷移的mimics NC組(100.00% ± 5.00%)和侵襲的mimics NC組(100.30% ± 10.02%)相比,過表達miR-485-5p同樣能夠抑制DU145細胞的遷移率(40.67% ± 4.73%)和侵襲率(36.00% ± 4.58%),差異具有統計學意義(P<0.01, Fig.2F-I)。同時,劃痕愈合實驗結果顯示,與PC3細胞的mimics NC組(100.0%±11.27%)相比,過表達miR-485-5p顯著抑制了PC3細胞的遷移率(54.67%±7.5%),與DU145細胞的mimics NC組(100.30% ±3.51%),過表達miR-485-5p同樣是抑制了DU145細胞的遷移率(44.33% ± 2.08%),且差異具有統計學意義(P<0.01, Fig.2J-L)。綜上所述,miR-485-5p抑制PC3和DU145細胞的增殖、遷移與侵襲。

2.3 miR-485-5p靶向調控氧連接的N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶

通過TargetScan、PITA、miRmap、miRDB、microT及PicTar網站預測miR-485-5p的靶基因,Venn圖表明,OGT是這六款軟件共同預測的待選靶基因之一(Fig.3A)。隨后構建OGT3′UTR的野生型和突變型雙熒光素酶報告載體,采用雙熒光素酶報告檢測驗證miR-485-5p與OGT的靶向關系,結果顯示,與mimics NC組(1.0±0.08)相比,miR-485-5p mimics使得OGT3 ′UTR-Wt組的熒光素酶活性顯著降低(0.85 ± 0.30),而OGT3 ′UTR-Mut的熒光素酶活性無顯著變化(0.96 ± 0.06),即:正如預測,兩者具有結合位點(P<0.05,Fig.3B-C)。接著本文通過Western 印跡檢測過表達miR-485-5p,OGT蛋白的表達量變化,結果顯示,過表達miR-485-5p時,OGT蛋白的表達量顯著下調(Fig.3D),同時采取qRT-PCR技術檢測過表達miR-485-5p后OGTmRNA的表達量變化,與mimics NC組(1.00 ± 0.19)相比,過表達miR-485-5p后,OGTmRNA表達量顯著下調(0.39 ± 0.01),差異具有統計學意義(P<0.01,Fig.3E)。上述結果表明,miR-485-5p能夠與OGT靶向特異性結合,OGT是miR-485-5p的直接靶標。

2.4 氧連接的N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶在前列腺癌中表達上調

借助GEDS(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GEDS/)網站分析OGT在多種腫瘤中的表達情況,結果顯示,其在前列腺癌、肺癌和肝癌等癌組織中高表達(Fig.4A)。利用GEPIA網站 (Gene Expression Profiling Interactive Analysis) (cancer-pku.cn)來分析OGT在前列腺癌組織中的表達,結果顯示,與前列腺正常組織相比,OGT在癌組織中高表達(P<0.01,Fig.4B )。隨后,采用qRT-PCR技術檢測OGT在前列腺癌細胞系中的表達,與在前列腺正常上皮細胞RWPE-1中的表達量(1.01 ± 0.14)相比,OGT在PC3(19.10 ± 0.08)、DU145(3.89 ± 0.23)、LNCaP(19.17 ± 0.32)、22Rv1(3.55 ± 0.12)4種癌細胞系中均高表達(P<0.01,Fig.4C),提示其可能在前列腺癌的進展中發揮促癌作用。

Fig.4 The expression of OGT in prostate cancer tissues and cells (A) The expression of OGT in tissues in various tumors was analyzed using the GEDS website. (B) The expression of OGT was analyzed in prostate cancer tissues via GEPIA website. **P<0.01. (C) The expression of OGT in prostate cancer cell lines was detected by qRT- PCR,**P<0.01, n=3

2.5 氧連接的N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶促進前列腺癌細胞的增殖、遷移與侵襲

采用qRT-PCR技術檢測OGT在 mRNA水平的干擾效果,在PC3細胞中,與si-NC組(1.00 ± 0.10)相比,si-OGT-1的mRNA表達量下降至(0.26 ± 0.03),si-OGT-2的mRNA表達量下降至(0.36 ± 0.02),在DU145細胞中,與si-NC組相比(1.00 ± 0.03),si-OGT-1的mRNA表達量下降至(0.25 ± 0.01),si-OGT-2的mRNA表達量下降至(0.46 ± 0.07),差異均具有統計學意義(Fig.5A,P<0.01 )。采用Western印跡檢測OGT在蛋白質水平的干擾效果,干擾OGT后,其蛋白質表達量顯著下降(Fig.5B ),選擇si-OGT-1用于后續實驗。采用平板克隆形成實驗檢測干擾OGT對前列腺癌細胞增殖的影響,結果顯示,PC3細胞中,與si-NC組(100.00% ± 7.94%)相比,干擾OGT能夠顯著抑制PC3細胞的克隆形成率(64.67% ± 6.51%),DU145細胞中,與si-NC組(100.30% ± 9.07%)相比,干擾OGT同樣能夠抑制DU145細胞的克隆形成率(50.67% ± 7.37%),差異均具有統計學意義(Fig.5C-D,P<0.01)。同時,通過Transwell實驗檢測干擾OGT對前列腺癌細胞遷移與侵襲的影響,結果顯示,PC3細胞中, 與si-NC遷移組(100.30% ± 5.51%)相比,干擾OGT能夠顯著抑制PC3細胞的遷移率(64.67% ± 4.73%),與si-NC侵襲組(99.67% ± 6.43%)相比,干擾OGT能夠顯著抑制PC3細胞的侵襲率(42.00% ± 6.56%),DU145細胞中,與si-NC遷移組(99.67% ± 10.60%)相比,干擾OGT同樣能夠抑制DU145細胞的遷移率(45.33% ± 7.10%),與si-NC侵襲組(100.00% ± 7.00%)相比,干擾OGT同樣能夠抑制DU145細胞的侵襲率(53.33% ± 9.50%),差異均具有統計學意義(Fig.5E-H,P<0.01)。綜上所述,OGT促進前列腺癌細胞的增殖、遷移與侵襲。

Fig.5 The effect of OGT interference on the proliferation and migration of prostate cancer cells (A) The interference efficiency of OGT at mRNA level was detected by qRT-PCR,**P<0.01, n=3. (B) The interference efficiency of OGT at protein level was detected by Western blotting. (C-D) The proliferation ability of PC3 and DU145 cells after interference with OGT was detected by plate clone formation assay. The bar graph indicated the clone formation rate,**P<0.01, n=3. (E-H) Transwell assay detected the migration and invasion ability of PC3 and DU145 cells after interference with OGT, and the scale was 50 μm. Bar charts showed relative mobility and invasion rate, respectively,**P<0.01, n=3

2.6 干擾氧連接的N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶能夠部分逆轉miR-485-5p對前列腺癌細胞增殖、遷移與侵襲的影響

采用qRT-PCR技術檢測miR-485-5p的抑制表達效果,經轉染的PC3細胞中,與inhibitor NC組(1.00±0.07)相比,miR-485-5p的表達量下降至(0.15 ± 0.02),差異具有統計學意義(Fig.6A,P<0.01)。DU145細胞中,與inhibitor NC組(1.00 ± 0.06)相比,miR-485-5p的表達量下降至(0.40 ± 0.08),差異具有統計學意義(Fig.6B,P<0.01)。平板克隆形成實驗檢測干擾OGT后,miR-485-5p對前列腺癌細胞增殖的影響,結果顯示,PC3細胞中,與inhibitor NC+si-NC組(100.00% ± 3.73%)相比, miR-485-5p inhibitor+si-NC組克隆形成率顯著升高(208.50% ± 11.53%),而miR-485-5p inhibitor+si-OGT組克隆形成率僅為(146.50% ± 10.16%),DU145細胞中, 與inhibitor NC+si-NC組(100.00% ± 14.78%)相比,miR-485-5p inhibitor+si-NC組克隆形成率顯著升高(205.4%±11.44%),而miR-485-5p inhibitor+si-OGT組克隆形成率僅為(157.50% ± 8.88%),差異均具有統計學意義(Fig.6C-D,P<0.01)。采用Transwell實驗驗證干擾OGT后,miR-485-5p對前列腺癌細胞遷移與侵襲的影響,結果顯示,PC3細胞中,與inhibitor NC+si-NC遷移組(100.00% ± 8.97%)相比,miR-485-5p inhibitor+si-NC組遷移率顯著升高(221.80% ± 13.14%),而miR-485-5p inhibitor+si-OGT組遷移率僅為(143.20% ± 9.77%),DU145細胞中,與inhibitor NC+si-NC遷移組(100.00% ± 18.81%)相比,miR-485-5p inhibitor+si-NC組遷移率顯著升高(245.90% ± 11.44%),而miR-485-5p inhibitor+si-OGT組遷移率僅為(158.10% ± 12.93%),差異均具有統計學意義(Fig.6E-F,P<0.01)。PC3細胞中,與inhibitor NC+si-NC侵襲組(100.00% ± 11.81%)相比,miR-485-5p inhibitor+si-NC組侵襲率顯著升高(233.70% ± 15.92%),而miR-485-5p inhibitor+si-OGT組侵襲率僅為(151.50% ± 8.60%),DU145細胞中,與inhibitor NC+si-NC侵襲組(100.00% ± 9.80%)相比, miR-485-5p inhibitor+si-NC組侵襲率顯著升高(260.90% ± 12.67%),而miR-485-5p inhibitor+si-OGT組侵襲率僅為(158.80% ± 12.12%),差異均具有統計學意義(Fig.6G-H,P<0.01)。上述結果表明,干擾OGT在一定程度上能夠逆轉miR-485-5p對前列腺癌細胞增殖、遷移與侵襲的影響。因此,miR-485-5p通過靶向調控OGT發揮著抑制前列腺癌細胞增殖、遷移與侵襲的作用。

Fig.6 Verification of the interaction between miR-485-5p and OGT at the level of cell function (A) qRT-PCR verified the inhibitory expression efficiency of miR-485-5p in PC3 cells,**P<0.01, n=3. (B) qRT-PCR verified the inhibitory expression efficiency of miR-485-5p in DU145 cells,**P<0.01, n=3. (C-D) Plate clone formation assay was used to detect the proliferation ability of cells in each group. The bar graph indicated the clone formation rate,**P<0.01, n=3. (E-F) Transwell assay was used to detect the migration ability of cells in each group, and the scale was 50 μm. Bar graph showed the relative migration rate of cells,**P<0.01, n=3. (G-H) The invasion ability of cells in each group was detected by Transwell assay, and the scale was 50 μm. The bar graph showed the relative invasion rate of cells,**P<0.01, n=3

3 討論

前列腺癌是美國男性癌癥死亡的第二大原因[13], 在中國,前列腺癌的發病率近年來呈逐漸上升趨勢[14]。毫無疑問,探索前列腺癌的發病機制及尋找有效的治療靶點迫在眉睫。

越來越多的研究表明,許多癌癥病例與miRNA失調相關。如:Zhao等人[15]研究表明,過表達miR-29a-3p或miR-29b-3p能夠抑制乳腺癌細胞的增殖,Tang等人[16]研究顯示,上調miR-21-5p能夠促進肺癌細胞增殖、遷移與侵襲。就前列腺癌而言,已報道miR-205和miR-34a參與前列腺癌的進展并用作前列腺癌的潛在生物標志物或治療靶標[17]。眾所周知,miRNA可充當腫瘤抑癌基因或癌基因角色,既往研究表明miR-485-5p在許多腫瘤中扮演著抑癌基因角色,如:Yuqin Pan等人[18]的研究證實,過表達miR-485-5p可抑制結直腸癌細胞的增殖和侵襲,Zhao等人[19]研究顯示,轉染miR-485-5p inhibitor可促進肝癌細胞的增殖、遷移與侵襲。然而,miR-485-5p在前列腺癌中的作用仍未可知,因此,本文旨在探究miR-485-5p在前列腺癌中的作用和機制。

本文通過生物信息學分析發現miR-485-5p在前列腺癌組織中低表達,qRT-PCR實驗證實其在前列腺癌PC3、DU145及LNCaP細胞系中均低表達,過表達miR-485-5p發現,PC3和DU145細胞的增殖、遷移與侵襲能力受到了顯著抑制。眾所周知,miRNA具有較為廣泛的生物學調節功能,可通過直接結合信使RNA的3'非翻譯區而調控基因的表達,為明確miR-485-5p抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用機制,本文借助靶向預測網站分析miR-485-5p的下游靶標,發現OGT是其中之一,另外,經查閱文獻得知OGT在前列腺癌中表達上調[11, 20, 21],且較高的OGT表達與Gleason評分、pN分期和神經周圍侵襲顯著相關,提示OGT是晚期前列腺癌的潛在預后標志物[22]。隨后,本文通過雙熒光素酶報告、Western 印跡和qRT-PCR證實OGT是miR-485-5p的一個下游靶基因,后續實驗證明,干擾OGT能夠顯著抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲,從而證實了OGT在前列腺癌中發揮的促癌作用,因此,本文推測miR-485-5p可以通過靶向結合OGT的mRNA進而發揮抑癌的生物學效應。共轉染實驗結果顯示,干擾OGT能夠在一定程度上逆轉下調miR-485-5p對前列腺癌細胞增殖、遷移與侵襲的促進作用,從而證實miR-485-5p通過負向調控OGT發揮著抑癌作用。不足之處是本文只是在細胞水平做了研究,進一步的研究需要建立裸鼠模型來深入探究miR-485-5p的作用及調控機制,這將是今后繼續研究的方向之一。

綜上所述,本研究證實了miR-485-5p在前列腺癌細胞中的表達和生物學功能,并初步明確miR-485-5p可通過靶向調控OGT進而抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移與侵襲。上述研究結果將有助于進一步揭示miR-485-5p在前列腺癌發生發展中的作用和機制,可為尋找前列腺癌的治療靶點提供實驗依據。