N6-甲基腺苷(m6A)轉移酶METTL3和m6A調控LINC01465在肝細胞癌增殖轉移中的作用機制

劉肸琳,龍樸澤, 黃云美,羅春英,4

(1.右江民族醫學院 研究生學院,廣西 百色 533000;2.湖北醫藥學院附屬東風醫院 病理科,湖北 十堰 442008;3.右江民族醫學院附屬醫院 病理科,廣西 百色 533000;4.廣西肝膽疾病分子病理重點實驗室,廣西 百色 533000)

肝癌是中國最常見的惡性腫瘤之一,可分為原發性和繼發性[1]。具有高發病率和高死亡率的特點。是全球癌癥死亡率第三的惡性腫瘤[2]。由于術后的復發和轉移,治愈性手術后肝癌患者的5年生存率僅為35%～43%[3]。其中肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最普遍的亞型,占所有原發性肝癌的90%以上[4]。HCC的發病率和多種原因有關,其中包括乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)和/或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)的慢性感染、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic fatty liver disease, NASH)、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷和黃曲霉毒素暴露[5]。近些年對于肝細胞癌的探索層出不窮,但對其機制的研究仍不清晰。尋找和肝細胞癌有關的靶向分子標志物以及影響其預后的分子機制亟待解決。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)是現在發現最豐富的RNA修飾形式之一,由甲基轉移酶復合物(甲基轉移酶樣3[met L3]、甲基轉移酶樣14[met L14]和WT1相關蛋白[WTAP])催化[6],其中甲基轉移酶樣3(methyltransferase like 3, METTL3)是唯一的催化亞單位[7]。METTL3全長有580個氨基酸,由鋅指結構域(ZFD)和甲基轉移酶結構域組成。據報道METTL3對骨髓細胞瘤、卵巢癌等多種癌癥的發生發展進程中發揮著關鍵作用,促進腫瘤發生、癌細胞的增殖轉移、干細胞的分化[8]。研究顯示,在肝癌中METTL3能夠抑制HCC細胞中的糖酵解過程[9]參與HCC中的代謝重編碼[10]以及促進肝癌的增殖轉移[11],而METTL3在肝癌中發揮作用的機制尚不清晰。

LncRNAs是一種非蛋白編碼的RNA,通常由超過200個核苷酸組成,在細胞增殖分化中發揮著重要作用。并參與腫瘤發生、轉移以及耐藥性[12]。LINC01465被驗證在卵巢癌中具有促進癌細胞增值轉移的作用[13]。其在肝細胞癌中的作用研究尚未提及。本研究旨在探究METTL3對肝細胞癌增殖轉移的作用及潛在機制,為進一步探索臨床中METTL3作為HCC的重要標志物提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織和細胞系 收集2021年7月至2022年12月右江民族醫學院附屬醫院手術切除的新鮮肝癌及配對癌旁組織30例,并放于-80 ℃冰箱保存。所收集的患者標本術后均確診為肝細胞癌,患者未接受過放療化療等治療,所獲取的組織標本已通過右江民族醫學院附屬醫院倫理委員會審批(NO:YYFY-LL-2023-171)。實驗所用正常人肝細胞LO2和肝癌細胞系SMMC-7721、BEL-7404、HepG2購自中科院上海生物化學與細胞生物研究所。

1.1.2 主要試劑和儀器 于達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)、FBS(胎牛血清)、0.25%胰蛋白酶(含酚紅)、青霉素-鏈霉素雙抗溶液購于美國Gibco公司;蛋白預制膠(7.5%)、三色預染蛋白Marker、RIPA高強度裂解液購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司;TRIzol試劑、MonScript TM RTIII Super Mix with dsDNase(Two-Step)試劑盒、RT-qPCR試劑盒Mon AmpSYBR Green qPCR Mix (HighROX))-均購于武漢莫納生物科技公司;EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit(Colorimetric)試劑盒購于美國EPIGENTEK公司;METTL3抗體購于美國Cell Signaling Technology公司;實驗所涉及的細胞培養瓶、離心管、96孔板、6孔板均購自廣州潔特生物過濾有限公司;Molecular 多功能酶標儀 SpactraMaxi3x(美國 Molecular Devices);實時定量PCR儀(BTK-96);恒溫細胞培養箱 HH-B11(美國ThermoFisher公司); 熒光倒置顯微鏡 OLYMPUS-51(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與傳代 人正常肝細胞(LO2)和肝癌細胞系(SMMC-7721、BEL-7404、HepG2)放置于完全培養基中。培養基為DMEM,添加 10% 胎牛血清(FBS),以及0.5 mL的青鏈霉素配制成完全培養基。培養條件為 37 ℃,5% CO2恒濕環境。

1.2.2 RT-qPCR RNA提取后,使用微量紫外可見分光光度計對RNA的濃度和純度進行檢測,進行cDNA的反轉錄。MonAmpTMSYBR Green qPCR Mix試劑盒及正向引物、反向引物配置成20 uL的體系,使用實時定量PCR儀進行qPCR實驗。將GAPDH設置為內參,用2- △△Ct計算目的基因和內參基因的相對表達量,基因引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 Western blot 提取蛋白后,配置蛋白質預制膠,將提取的蛋白上樣,進行電泳,隨后采用“三明治”法濕轉進行轉膜,轉膜結束后用1×的TBST漂洗5 min、3次。用封閉液封閉2 h。TBST洗滌,4 ℃一抗孵育過夜。約15 h后,結束孵育,用TBST洗滌3次,每次10 min,二抗孵育1 h后,再洗滌3次,隨后配置顯影液進行顯影。

1.2.4 比色法檢測細胞內m6A水平 購入比色法試劑盒,將條帶井從密封袋中取出,加入試劑盒中的80 μL BS溶液,以及2 μL NC、2 μL PC作為陰性和陽性對照組,加入200 ng RNA樣本,輕輕搖晃混勻。用Parafilm M覆蓋條帶井,37 ℃孵育90 min。用槍頭吸出BS溶液,用WB溶液清洗。依次加入50 μL CA溶液、50 μL DA溶液和50 μL ES溶液,Parafilm M封閉,室溫孵育1 h,WB洗滌。每個孔加入100 μL DS溶液,室溫下避光孵育,當陽性對照組的顏色變為中藍色,加入SS溶液終止反應,在酶標儀450 nm處檢測其吸光度。

1.2.5 細胞轉染 慢病毒轉染24 h前,將細胞均勻鋪在六孔板中,轉染時細胞密度達到70%。用Gibco替換完全培養基,向培養基內加入適量病毒以及助轉染試劑,16 h后用完全培養基進行換液。分別于24、48、72、96 h觀察細胞內熒光。

1.2.6 細胞增殖能力檢測(CCK-8) 購入Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑,將肝癌細胞以1×104每孔均勻鋪在96孔板內,每孔100 μL細胞懸液,設置5 d分別為0、24、48、72、96 h,以1∶9的比例將CCK-8試劑和完培配置成100 μL的混合液,放入37 ℃,5% CO2的細胞培養箱,培養2 h,檢測450 nm處的吸光度。

1.2.7 克隆形成實驗 以每孔800個細胞的濃度,接種在六孔板上,約14 d后,取出六孔板,用4%的多聚甲醛固定液固定細胞6 min,隨后用結晶紫染色10 min,用PBS輕輕漂洗干凈結晶紫,拍照并分析圖像。

1.2.8 Transwell小室侵襲實驗 Transwell小室上室面用Matrigel(50 mg/L)稀釋液包被后以FN涂抹在小室下面并干燥,紫外線消毒30 min。各孔加入1% BSA無血清培養基0.1 mL,Matrigel充分浸潤后吸掉殘余培養基。然后,制備細胞懸液,將細胞濃度調整為1×106個/mL,細胞懸液0.2 mL(1×105)加于預包被培養板各孔,于下室緩慢加入10% FBS培養基0.5 mL,溫箱培養16 h。最后,用棉簽將Transwell小室上室面未穿過基底層膜的細胞擦去,顯微鏡下進行計數細胞并比較。

1.2.9 Transwell小室遷移實驗 向Transwell小室上室內加入200 μL配置好的完全培養基,激活小室底部膜后吸出,用1% BSA無血清培養基配置0.2 mL(1×105)的細胞懸液,加入小室的上室,向小室下室加入600 μL含FBS(胎牛血清)的完全培養基,37 ℃,5% CO2細胞培養箱培養24 h,取出24孔板,吸出殘留液體,4%的多聚甲醛固定液固定細胞10 min,用PBS清洗2次。1%的結晶紫染色10 min,用PBS清洗,直至將結晶紫溶液清洗干凈。用棉簽將上室面未穿過基底層膜的細胞擦掉,顯微鏡下觀察拍照并計數。

1.2.10 全轉錄組RNA甲基化(m6A)測序(MeRIP-seq) 細胞培養濃度至1×108/mL,按照培養瓶面積每1 cm2加入1 mL TRIzol將所有細胞消化掉,加入凍存管中,用干冰運輸至上海天昊生物公司,進行MeRIP-seq。

2 結果

2.1 METTL3在HCC細胞和組織中表達情況、與患者預后的相關性 通過TCGA數據庫,我們探究了METTL3在肝癌中的表達量,選取371例肝癌組織以及50例癌旁組織,分析METTL3在組織中的表達差異,發現其在肝癌組織中的表達量明顯高于癌旁組織(圖1A)。隨后采用RT-qPCR檢測正常肝細胞、肝癌細胞系以及肝癌組織和癌旁組織中METTL3的表達差異,發現其在肝癌組織以及肝癌細胞株SMMC-7721、BEL-7404中表達量顯著高于正常肝細胞和癌旁組織(圖1B、D)。通過western blot檢測正常肝細胞、肝癌細胞系以及肝癌組織和癌旁組織中METTL3的蛋白表達差異,并進行定量分析。肝癌細胞及組織中METTL3的蛋白表達量高于正常肝細胞及癌旁組織(圖1C、E)。在TCGA數據庫中進行Kaplan-Meier生存分析,在肝細胞癌中,高表達的METTL3多提示預后不良(圖F)。

A: METTL3在肝癌中的表達水平TCGA samples;B、D:RT-qPCR檢測正常肝細胞LO2、HCC細胞系(SMMC-7721、BEL-7404、HePG2)和癌旁組織以及HCC組織中METTL3的mRNA的表達量;C、E:WB檢測正常肝細胞LO2、HCC細胞系(SMMC-7721、BEL-7404、HEPG2)和癌旁組織以及HCC組織中METTL3的蛋白表達水平;F: METTL3對HCC預后的影響; *、**:P<0.05、P<0.01。

2.2 下調METTL3抑制肝癌細胞的增殖 METTL3在肝癌中呈高表達,且多提示不良預后,因此我們推測METTL3對肝癌的增殖遷移、侵襲有促進作用。敲低METTL3,RT-qPCR進行敲低效果的驗證(圖2A、B),隨后采用western blot檢測蛋白水平的敲低效果并進行定量分析(圖2C、D)。在7721細胞中選取敲低效果最好的sh-METTL3-3進行后續試驗,7404細胞株中選取sh-METTL3-1進行后續功能試驗。CCK-8實驗(圖2E、F)及克隆形成實驗(圖2G、H)顯示METTL3表達量降低后,細胞增殖能力下降。

A、B:RT-qPCR檢測肝癌細胞的轉染效率;C、D:Western blotting檢測肝癌細胞轉染效率;E、F:CCK-8實驗檢測對照組和實驗組細胞增殖情況;G、H:克隆形成實驗檢測對照組和實驗組細胞增殖情況;**、***:P<0.01、P<0.001。

2.3 下調METTL3抑制肝癌細胞的遷移 敲低METTL3后HCC細胞遷移能力比較:在SMMC-7721和BEL-7404細胞中敲低METTL3后, transwell遷移實驗檢測到METTL3表達量下降后敲低組細胞穿過小室的數量明顯下降,肝癌細胞遷移能力明顯降低,結果表明METTL3有促進肝癌細胞遷移的作用(圖3)。

A:SMMC-7721中對照組和敲低組細胞遷移能力情況;B:BEL-7404中對照組和敲低組細胞遷移能力情況;***:P<0.001。

2.4 下調METTL3抑制肝癌細胞的侵襲 敲低METTL3后HCC細胞侵襲能力比較:在SMMC-7721和BEL-7404細胞中敲低METTL3后, transwell侵襲實驗表明METTL3表達量降低后,敲低組細胞穿透基底膜的數量降低,HCC細胞侵襲能力降低。結果顯示高表達的METTL3會更快的穿透基底膜,促進肝癌細胞的侵襲(圖4)。

A:SMMC-7721中對照組和實驗組細胞侵襲能力情況;B:BEL-7404中對照組和實驗組細胞侵襲能力情況;*、**:P<0.05、P<0.01。

2.5 沉默METTL3對m6A水平、LNCRNA表達及功能的影響 用m6A比色法試劑盒檢測到肝癌細胞的m6A水平顯著高于正常肝細胞(圖5A)。MeRIP-seq測序對NC組與METTL3敲低組進行分析得到差異m6A峰值(Peak),有262個peak上調,355個peak下調(圖5B),并得到差異peak基因分布區域的餅狀圖,其比例顯示和NC組相比m6A峰主要位于exonic、nc-rnaexonic、UTR5(圖5C)。此外,NC組和敲低組的差異性peak分布顯示其主要分布在起始密碼子附近(圖5D)。與NC組相比敲低組的m6A峰值及基因表達量都發生了改變,其中表達量上調的基因圖有308個,下調的有284個。m6A峰值上調的有227個,下調的有306個(圖5E)。對于METTL3敲低組中有18個轉錄本在差異m6A甲基化修飾轉錄本中下調(圖5F)。GO富集結果顯示在分子功能(MF)中,METTL3敲低組和NC組相比較,其主要差異表現在參與GTP酶激活蛋白結合、硫酯酶結合、細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑活性、腫瘤壞死因子受體超家族結合。在細胞組分(CC)中差異性體現在突觸后特化,細胞內成分、富含ficolin-1的顆粒膜以及SCF泛素連接酶復合物方面。在生物學過程(BP)中甘油三酯代謝過程、子宮發育、溶酶體定位表現為顯著差異(圖5G)。KEEG富集結果顯示和NC組相比敲低組有幾條重要的信號通路發生顯著改變,主要表現在Rap1信號通路、肌動蛋白細胞骨架的調控、胰島素信號通路(圖5H)。

A:比色法測定正常肝細胞LO2及肝癌細胞系(SMMC-7721,BEL-7404)中m6A水平;B:火山圖展示了上調和下調peak數量;C:餅狀圖展示了peak的基因分布區域;D:差異peak基因分布密度;E:veen圖顯示上調的下調的差異性peak及基因表達量;F:交集四象限圖;G:GO富集顯示生物學功能的差異性改變;H:KEGG分析顯示通路的變化;**:P<0.01、。

2.6 敲低METTL3逆轉了LINC01465對肝細胞癌進程的促進作用 篩選出log2Fold Change絕對值大于1的基因,表示其有差異性。LINC01465在HCC中并無相關報道,且在樣本中具有顯著差異性。為了確認LINC01465是METTL3作用的靶基因,隨后分析了TCGA數據庫中50例正常肝組織,369例癌旁組織的LINC01465水平,顯示LINC01465基因在HCC組織中顯著高表達(圖6A)。網站預測發現METTL3和LINC01465在肝細胞癌中呈現正相關(圖6B)。通過qPCR驗證,在HCC細胞中敲低METTL3后LINC01465表達水平降低(圖6C)。在HCC細胞中LINC01465的mRNA水平顯著高于正常肝細胞(圖6D)。

A :TCGA 預測了LINC01465在肝細胞癌和癌旁組織中的表達[num(T)=369; num(N)=160];B :GEPIA預測METTL3和LINC01465的相關性;C:通過 RT-qPCR 檢測沉默 METTL3 后LINC01465的表達;D:通過 RT-qPCR 檢測LINC01465在正常細胞LO2、HCC細胞系(SMMC-7721,BEL-7404)中的表達水平;***:P<0.001。

3 討論

N6-甲基腺苷(m6A)是高等真核生物中mRNA和長鏈非編碼RNA中最為豐富的內部修飾,在RNA代謝和多種生物學過程中發揮著重要作用,m6A甲基化過程是一個可逆的過程[14]。m6A甲基化受一組m6A調控酶進行動態調節,包括寫入酶(METTL3、METTL14、WTAP)、擦除酶(FTO、ALKBH5)和讀取酶(YTHDF-1、YTHDF-2)[15]。這一過程可以影響多種生物學功能,包括晝夜節律調節、干細胞更新分化、早期胚胎發育等[16]。m6A可以調節基因表達并促進細胞的各種過程,包括細胞更新、免疫、凋亡、分化及癌細胞的侵襲[17]。參與m6A這一過程的酶可以通過影響m6A水平來調節癌基因和抑癌基因[18]。

METTL3作為最重要的甲基轉移酶之一,在腫瘤形成和進展過程中有不可忽視的作用。先前研究顯示,METTL3在膀胱癌[19]、膠質母細胞瘤[20]等腫瘤中起到了非常關鍵的影響。在結直腸癌中METTL3通過促進IGF2BP2的m6A水平來促進結直腸癌的進程[21]。在膀胱癌中METTL3以m6A依賴的方式促進Pri-miR221/222的成熟,來促進癌細胞增殖轉移[22]。也有研究發現,METTL3通過上調基因的m6A水平來成為腫瘤抑制因子[23]。對于METTL3在肝癌中的作用之前的研究中有提到,Chen等[24]發現METTL3通過YTHDF2轉錄后沉默SOCS2來促進肝癌的增殖轉移。但關于METTL3對lncRNA發揮的作用以及對肝癌增殖轉移的作用機制尚不清晰。

lncRNA是一種不編碼蛋白質,長度大于200 nt的轉錄物[25]。越來越多研究顯示lncRNA參與疾病的發生和病理生理學過程。其參與細胞周期[26]、骨髓生成[27]、癌癥上皮間質轉化[28],以及調節癌細胞的增殖、侵襲、凋亡和轉移[29],lncRNA可以與蛋白質相互作用參與腫瘤發生的各種信號通路[30]。這些lncRNA通過在基因轉錄和轉錄后修飾中發揮作用,在癌癥中發揮著重要作用。LINC01465在卵巢癌中過度表達,并促進癌癥進展[31],但其在肝細胞癌中的作用機制并未有研究。

本研究發現METTL3在肝癌細胞系以及肝癌組織中都呈高表達,且和患者預后相關。因此可以確定METTL3在肝細胞癌中是一個高表達的促癌基因。通過沉默METTL3基因后進行功能試驗,進行結果分析后發現,METTL3表達量降低后,CCK-8結果顯示450 nm處的吸光度明顯降低,克隆形成以及Transwell的細胞數也發生明顯差異,由此可得出METTL3在肝細胞癌中起到促進增殖、遷移的作用。研究證實在胰腺癌、胃癌中METTL3也發生了促進癌細胞增殖轉移的作用[32-33],這些研究結果也可以證實本實驗結果的正確性。敲低METTL3后,高通量測序結果顯示下游靶基因LINC01465的表達量以及m6A水平發生差異性改變,干擾METTL3后,qPCR檢測LINC01465的表達水平,結果表明sh-METTL3會抑制LINC01465的表達。在TCGA數據庫分析發現LINC01465在正常肝組織中的表達量低于肝癌組織,與qPCR結果顯示一致,LINC01465在正常肝細胞中的表達量顯著低于HCC細胞,在肝細胞癌中發揮促癌作用。在HCC中,高表達的METTL3會通過m6A依賴方式影響LINC01465的m6A水平,進一步促進LINC01465的表達水平來促進HCC細胞的發展進程。

本研究結果顯示,METTL3作為一個促癌基因對HCC的進程起到了促進作用,測序結果顯示沉默METTL3會抑制靶基因LINC01465的m6A水平,來降低LINC01465的表達量,從而實現抑制HCC增殖轉移的效果。

綜上所述,本研究揭示了一個新的機制,METTL3以m6A依賴方式調控LINC01465的m6A水平來改變LINC01465的表達水平,進而影響HCC的進程。METTL3在肝細胞癌中呈高表達,通過升高LINC01465的m6A水平促進了LINC01465的表達量來加快HCC發展,其表達量的改變與HCC細胞的侵襲、遷移和增殖有關。這一機制可使METTL3作為HCC早診和早治療的關鍵分子,其有望成為未來臨床對HCC治療的重要靶向分子標志物。