cfDNA 研究現狀及分析前變量淺析

彭宏威，劉南，張姍姍，鄒聰，錢開宇

循環游離 DNA（circulating free DNA，cfDNA）是在外周血中發現的游離于細胞外的 DNA[1]。1977 年，Leon 等[2]用放射免疫測定法發現腫瘤患者血清中 cfDNA 含量水平明顯高于健康人群，現已證實它廣泛存在于人體血液、尿液、腦脊液、胸腹水、卵泡液、唾液等各類體液中[3-4]。cfDNA 是核小體凋亡 DNA 在細胞內循環核酸酶的作用下天然斷裂形成的平均長度為 180 ～ 200 bp 的小片段[5]，作為分子標志物具有獲取簡單、無創、信息量大等得天獨厚的優點，在無創產前檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT）、腫瘤診斷及監測、器官移植監測、糖尿病、自身免疫性疾病等領域均具有大量的研究[6-7]。目前 cfDNA 的檢測方法主要有PCR 和二代測序（next-generation sequencing，NGS），其原理和優缺點各不相同，需結合研究目的及分析前變量來選擇合適的方法。

cfDNA 分析前各種因素均會影響其質量，這嚴重阻礙了 cfDNA 在眾多領域內的臨床推廣應用。建立一套 cfDNA標準檢測前處理流程（pre-analytical procedures，PAP）是cfDNA 檢測實現臨床廣泛應用的關鍵。本文集中討論cfDNA 研究現狀及影響其質量的各種檢測前變量，以期為cfDNA 建立標準 PAP 以及為臨床檢測的應用提供參考。

1 cfDNA 研究現狀

cfDNA 主要類型有細胞核源性 DNA（nuclear cfDNA，ncfDNA）與線粒體源性 DNA（mitochondrial cfDNA，mtcfDNA）[8]。cfDNA 的產生機制目前不是完全清楚，現普遍認為是活細胞的主動釋放或凋亡與壞死細胞的被動釋放產生的[9]。人體 cfDNA 含量受肥胖、運動及腫瘤等多種因素影響[10-11]。在健康人外周血中 cfDNA 含量均值約為30 ng/ml[12]，幾乎都來自凋亡或壞死細胞，腫瘤患者體內的cfDNA 則更多來源于腫瘤細胞及鄰近非腫瘤細胞的凋亡[13]。

目前 cfDNA 的檢測主要有 PCR 和 NGS 兩種方法，近年來基于這兩種方法衍生出許多更加高效靈敏的檢測方法。隨著檢測靈敏度和精確度的不斷提高，PCR 技術現已發展為實時熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、數字 PCR（digital PCR，dPCR）和微滴式數字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）等多種檢測技術。NGS 是目前公認檢測 cfDNA 最有效的分析方法，具有靈敏度高、通量大的優點。cfDNA 的評估指標因檢測目的或樣本類型的不同而有所差異，主要有 cfDNA 濃度、純度、片段長度、片段完整性等基本指標[14-15]。Shen 等[16]以血漿 cfDNA 為模板，qPCR 定量檢測 ALU247 和 ALU115 片段的濃度，ALU247/ALU115 比率來評估 cfDNA 的完整性，發現多發性骨髓瘤患者血漿 cfDNA 水平顯著升高，ALU247 片段濃度與多種臨床特征顯著相關。此外，腫瘤的研究中還會借助腫瘤細胞釋放 cfDNA 進入體液的特點來測定 cfDNA 基因位點突變[17]、拷貝數變化[18]等指標或甲基化情況[19]。

無創、成本低、靈敏度高、取樣簡單、特異性強一直是臨床診斷標志物的選擇標準。目前，從 cfDNA 中獲取的生物信息在 NIPT 和癌癥等方面已有廣泛的應用。在 NIPT領域，cfDNA 檢測主要用于識別胎兒染色體異常的遺傳疾病和性別鑒定等。Zhu 等[20]通過高通量測序分析了一個NIPT 病例，有效評估了分別來源于骨髓移植和供體卵子體外受精的 cfDNA 的遺傳相關性，為非侵入性產前親子鑒定提供了一種新的方法。腫瘤發病隱匿，發展周期長，如何在影像學未檢查出腫瘤灶前就提示腫瘤存在是醫學界有待攻破的難題。cfDNA 檢測較影像學靈敏度更高且無創、無輻射，使其在腫瘤領域備受關注。cfDNA 既可以作為生物標志物檢測腫瘤基因異質性[21]，還能作為輔助組織活檢的新方法用于腫瘤診斷、治療后監測及耐藥性檢測[22-23]。飲食暴露誘導脂肪細胞凋亡也會導致 cfDNA 釋放，來自 cfDNA的信息可提前預測 2 型糖尿病的發展[6]。在器官移植中供體來源的 cfDNA 可作為分子標記來評估排斥反應后的同種異體移植物損傷[24]。cfDNA 在自身免疫性疾病中作為疾病進展和治療反應預測的生物標志物也發揮著重要作用[25]。

目前，雖然 cfDNA 已被報道在眾多領域內廣泛應用，但普遍存在的問題是分析前的各種變量描述不全或不明確，且在大多領域內依然停留在初期研究階段，尚未實現臨床推廣應用。Shen 等[16]在分析 cfDNA 水平和完整性與多發性骨髓瘤患者臨床特征之間的相關性時，描述了采集的血液在4 ℃ 下保存及 8 h 內進行處理，未描述樣本在長時間緩沖處理期間是否還經歷過常溫轉運等可能影響樣本質量的因素。Wolf-Doty 等[24]通過檢測同種異體器官移植受體血液中供體來源的 cfDNA 來評估排斥反應后的移植物損傷情況，沒有明確描述血液采集量、處理時限、cfDNA 提取相關信息等分析前變量，這使分析結果缺乏可靠性，也不利于方法的驗證及研究成果的臨床應用。

2 規范 cfDNA 檢測分析前變量的意義

cfDNA 在 NIPT 領域內已得到權威驗證且具有廣泛的臨床應用，但目前可供參考的 NIPT 分析前數據非常有限[7]。cfDNA 在其他臨床領域內研究非常廣泛，但尚未達到常規臨床診斷廣泛推廣應用的水平，原因之一是 cfDNA分析前階段缺乏標準 PAP。刁振麗等[26]專門探討了宏基因組下一代測序（mNGS）用于全國 80 個實驗室檢測血液樣本中微生物 cfDNA 的質量保證問題，調查了樣本分析前、分析中、分析后和進行性能驗證的情況，結果發現各實驗室mNGS 工作流程差別很大，需要積極優化工作流程來確保及時準確的檢測結果。Luo 等[27]為探究不同采血管對血漿cfDNA 和 NIPT 質量控制的影響，比較了保存在 EDTA、ImproGene 和 Streck 試管中的血液樣本溶血、cfDNA 濃度和片段分布情況，最后發現 ImproGene 管性能最為優良。尿液 cfDNA 除血液 cfDNA 通過腎臟濾過外，還來源于腎、膀胱等泌尿器官細胞的釋放，故在泌尿系統腫瘤患者體內含量明顯高于健康人群。尿液量大且易收集，是研究泌尿系統腫瘤的理想樣本[28]。然而，尿液 cfDNA 的成功應用卻相對較少，很重要的原因是尿液樣本 cfDNA 濃度低且容易降解，同時缺乏標準的 PAP。

樣本質量是確保轉化研究成果可重復性的決定性因素之一。樣本采集、轉運、預處理、提取及保存等過程中許多因素（表 1）均會影響分析前 cfDNA 的樣本質量。當前面臨的最主要的問題有：①cfDNA 容易受基因組 DNA 的污染[30]，且在體外不穩定，易發生降解，即使在采集時使用 EDTA 保護液并及時處理樣本，也可能會因為捐贈者身體狀況原因或樣本轉運條件等多種不易控制的因素疊加而導致 cfDNA 受到污染或降解[29,38]；②cfDNA 濃度低且片段小，而 cfDNA 用于分析檢測前需要經過復雜繁多的步驟，該過程極易發生 cfDNA 的含量損失或關鍵片段丟失[33]；③cfDNA 的檢測與定量方法多樣，其準確性相互之間難以確證比較。如 PCR 常通過看家基因或穩定的非編碼重復序列來對 cfDNA 進行定量，qPCR 測量靶基因的 Ct 值后再用標準曲線計算 cfDNA 的量，使用不同的標準品或參考基因可能會得到差別極大的結果，另外提取過程中的樣本損失也會使測定結果偏低，這些因素使同一樣本 cfDNA 的不同定量結果無法比較[39]。只有對 cfDNA 分析前的各個變量及細節進行規范且統一，最終檢測結果的可靠性和重復性才能得到保障，因此建立 cfDNA 的標準化 PAP 意義重大。

3 影響 cfDNA 樣本質量的因素

3.1 樣本采集過程

cfDNA 樣本采集時捐贈者身體狀況、樣本類型、抗凝劑、采集容器和采集量等均會影響樣本保存質量。人體主要依托血液循環進行新陳代謝，采集血液用于 cfDNA 檢測研究適用面最廣，其他樣本來源的 cfDNA 檢測研究相對較少。捐贈者身體狀況主要包括年齡、是否運動、是否妊娠、疾病狀況等情況，捐贈者身體狀況不同，體液 cfDNA 含量不同[29]。Neuberger 等[40]研究表明運動通過影響人體免疫穩態從而引起體液中 cfDNA 含量的顯著增加。Krasnyi 等[41]比較了早產女性與足月分娩女性血漿 cfDNA 和胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的含量，發現妊娠22 ～ 31 周和 32 ～ 36 周的早產女性比足月分娩女性 cfDNA含量高，妊娠 32 ～ 36 周的早產女性比足月分娩女性cffDNA 含量高。

首選血漿用于 cfDNA 的檢測，血漿可避免白細胞裂解釋放的基因組 DNA 影響 cfDNA 的濃度及純度[30]，常選擇含 EDTA、肝素和檸檬酸鹽等抗凝劑的采血管來采集樣本[42]。含不同抗凝劑的采血管樣本保存效果不同，肝素會與血液中 cfDNA 形成聚合物而影響 cfDNA 提取及qPCR 效率[43]。雖有研究稱含有 3.2% 檸檬酸鈉采血管比K2EDTA 采血管性能更好[44]，但缺乏更多可靠的研究支撐。如果血液暫存時間不超過 4 h，則優先推薦 EDTA 采血管。由于采集血液樣本后經常要跨地區運輸而不能立即處理，近年來許多保存效果很好的商業專用采血管被用于 cfDNA檢測目的的采集中，可使血漿 cfDNA 含量在 7 d 內保持穩定[31]。腫瘤患者血漿 cfDNA 濃度通常在 180 ng/ml 左右，循環腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）片段較短且含量更少，為了保證采集到足量 cfDNA 用于后續DNA 提取及人表皮生長因子受體（EGFR）突變檢測，有專家共識推薦采集 10 ml 全血用于進一步分離血漿[45]。

表1 cfDNA 的分析前變量及其影響方式

目前關于尿液、腦脊液和腹水等體液 cfDNA 樣本的采集研究相對較少，由于樣本量大，為方便采集，大多先采用無菌容器收集好樣本，得益于血液 cfDNA 樣本收集的成熟經驗，部分研究者會向樣本中加入 EDTA 等抗凝劑。Markus等[46]使用全基因組測序來表征尿液 cfDNA 的片段模式，收集尿液后加入 0.5 mol/L EDTA 0.8 ml 并在 1 h 內進行處理。Chauhan 等[47]用 NGS 方法分析 42 例膀胱癌患者的尿液 cfDNA，在根治手術前用含有 2 ml 的 0.5 mol/L EDTA 的無菌小瓶收集尿液樣本。他們都借鑒了已有的經驗，特別對添加 EDTA 保護劑、縮短處理時限等關鍵分析前變量進行嚴格控制，因此能夠確保腫瘤來源的尿液cfDNA 在分析前質量可控，進而得到了可靠有用的信息。

3.2 樣本轉運及暫存過程

樣本采集至預處理前涉及到樣本的轉運和暫存，該過程中運輸時間、溫度及暫存時間是影響樣本質量的主要因素。EDTA 管內的血液應在采集后 4 h 內處理，如不能及時處理，應暫存于 4 ℃ 條件下以避免基因組 DNA 的污染，但延遲處理時間最好不要超過 24 h。涉及跨地區樣本采集，最好使用商業專用的 cfDNA 管來采集樣本并常溫運輸，在7 d 內可以確保樣本質量的穩定。樣本轉運及暫存過程中應避免發生溶血，細胞中釋放的血紅蛋白及其代謝產物對 Taq酶活性有抑制作用，最終會導致 PCR 擴增效率降低[38]。尿液樣本暫存條件跟血液樣本大致一樣，腦脊液、胸腹水等樣本基本是采集并處理后立即用于檢測，轉運及暫存過程的參考實例較少。

3.3 樣本處理過程

樣本處理過程非常重要，既要確保 cfDNA 提取得率，也要避免可能來自基因組 DNA 對樣本的污染。離心力、離心時間等參數會影響 cfDNA 提取含量。對血液來說，為了有效減少基因組 DNA 對樣本的污染，處理時推薦兩步離心法，第一步使用較低離心力去除大量細胞成分，第二步使用較高離心力去除細胞殘余物和細胞碎片。尿液、腹水、腦脊液和唾液等體液樣本中所含細胞成分相對較少，現有研究基于不同目的或樣本類型的離心處理方式各不相同，大多借鑒了血液樣本處理方法，采用二次離心或一次離心方式來處理樣本。Ding 等[3]在探究 cfDNA 用于非小細胞肺癌診斷的應用中，將 EDTA 管采集的外周血進行二次離心，第一次是在 4 ℃ 以 1900 ×g離心 10 min，第二次是在4 ℃ 以 16 000 ×g離心 10 min；收集的唾液樣本也是采用二次離心方法進行處理，先在 300 ×g下離心 20 min，再以 10 000 ×g離心 20 min，樣本在提取 DNA 前均凍存于-80 ℃。該研究血液和唾液的處理流程中，由于血液中細胞成分遠比唾液復雜，處理血液的兩次離心力均大于處理唾液的離心力，唾液具有一定黏性且含有泡沫，因此處理唾液的時間比血液更長。Miller 等[32]通過對腦脊液 cfDNA 測序分析驗證了微創分子診斷的臨床經驗，用無菌 Streck 管收集腦脊液后對樣本進行二次離心（1600 ×g離心10 min，3000 ×g離心 10 min）徹底去除細胞沉淀等雜物。Liu 等[48]用全基因組測序分析腫瘤來源的腦脊液 cfDNA，用無菌管收集腦脊液后對樣本進行一次處理（1500 ×g離心 10 min），上清液等份分裝至新的 1.5 ml Eppendorf 管中。由于研究目的不同，這兩種腦脊液樣本前處理參數和流程差異很大，目前腦脊液 cfDNA 研究得較少，沒有可推薦的最佳樣本前處理方案。

3.4 樣本提取過程

cfDNA 提取效率是決定檢測結果的重要步驟，但cfDNA 含量低且片段小，如何高效快捷提取 cfDNA 一直是研究的重點。目前提取 cfDNA 主要方法有異戊醇抽提法、磁珠法和親和柱法等，大多實驗室均采用商業試劑盒來提取cfDNA。商業試劑盒種類較多，其中 Qiagen 公司生產的一系列 DNA 提取商業試劑盒應用較為廣泛，但該試劑盒提取純化過程中會損失 150 bp 以下小片段而導致 cfDNA產率降低[33]。Diefenbach 等[34]比較了 6 種 cfDNA 提取試劑盒的性能，該研究首次使用添加 DNA 片段來評估商業cfDNA 試劑盒，發現基于旋轉柱的 Qiagen QIAamp 循環核酸試劑盒是性能表現最穩定的試劑盒。方仲表等[35]比較了基于磁珠法的天根游離核酸提取試劑盒和基于硅膠膜吸附柱法的德國 Qiagen 循環核酸試劑盒對血漿中 cfDNA 的提取效果，采用 EGFR 突變基因檢測試劑盒作為定量分析方法，發現 Qiagen 試劑盒在 cfDNA 提取濃度及純度、EGFR 突變基因的陽性檢出率和重復性方面的表現均要優于天根試劑盒。不同試劑盒所獲得的 cfDNA 產率、純度及特定片段大小等一般是不同的，且各個試劑盒的定量分析方法也不同，目前主要定量方法有試劑盒法、qPCR 及某些特定基因的拷貝數等[49]，因此很難有可推薦的對比研究結果。

3.5 樣本保存過程

保存提取的 cfDNA 比保存用于提取的體液會更加穩定，保存時間、保存溫度、cfDNA 提取物濃度等均會影響cfDNA 提取物樣本的保存質量。Shao 等[36]系統地研究了反復凍融循環對 DNA 樣品穩定性的影響，研究發現凍融循環次數的增加會加速 DNA 的降解，且大片段的 DNA 最容易降解，但增加 DNA 濃度可以減少由反復凍融循環引起的 DNA 片段降解。許多研究因實際需要保存的是初步處理后用于提取 cfDNA 的體液樣本，如血漿、尿液、腦脊液等[38]。體液樣本冷凍保存后超過 3 次以上的凍融循環會引起 cfDNA 片段化[37]。Clausen 等[50]研究了血漿于 -25 ℃儲存 0 ～ 6 年 cffDNA 及 cfDNA 含量的變化情況，發現儲存 2 ～ 3 年的血漿中可擴增的 cffDNA 和總 DNA 水平顯著增加，儲存 3 年后 cffDNA 部分略有下降，推測可能是隨著時間的推移，DNA 中蛋白質的丟失引起了 cffDNA及 cfDNA 產量增加。Chen 等[51]研究了 cfDNA 在不同溶劑中的凍融穩定性，發現存在于血漿中或儲存在提取緩沖液中的 cfDNA 凍融后回收率穩定，且 cfDNA 濃度在 4 ℃下 24 h 內保持穩定，在室溫下 12 h 內保持穩定。尿液、腦脊液等體液針對 cfDNA 檢測研究的保存目前報道極少，還沒有形成可供參考的經驗。樣本處理后根據研究使用需求進行小體積多份數分裝更有利于樣本的保存和提高使用效率[7]，也可以減少將來樣本可能存在的凍融循環。

4 總結與展望

cfDNA 是極具應用潛力的分子標志物，存在于各類體液樣本中，在 NIPT 和癌癥等眾多領域內均具有廣泛的研究或應用。前處理流程中影響 cfDNA 樣本質量的因素眾多且復雜，現有研究尚存在一些不足。目前絕大部分研究均是針對血液樣本 cfDNA 檢測前處理流程，尿液、胸腔積液、腦脊液等[48]體液樣本cfDNA 檢測前處理流程及方法基本是參考血液的經驗或者非常簡易的操作過程，還缺乏更多相關研究來形成更加精準規范的方法。有研究表明 cfDNA 甲基化受分析前因素的影響[52]進而可能會最終影響 cfDNA的分析結果，相關機制還不明確。此外，不同樣本處理后常用試劑盒來提取 cfDNA，不同的試劑盒提取效率各不相同[34]，并且 cfDNA 的定量檢測也有爭議[39]，這些極不利于不同實驗室之間的數據對比及 cfDNA 檢測前處理流程的規范，試劑盒的提取效率還有待優化，相應配套的定量檢測方法也有待摸索。

cfDNA 檢測前處理流程的標準化是一項非常復雜的工作，仍需以下大量工作才能促進標準化 PAP 的建立：①尿液、胸腔積液、腦脊液等體液 cfDNA 檢測的分析前質量控制因素需要更多可靠的比對研究來確認；②cfDNA 的提取方法需要進一步優化，開發可以避免基因組 DNA 污染且實現小片段 cfDNA 高效提取的試劑盒，針對尿液、胸腔積液、腦脊液等不同體液開發不同的專用試劑盒以獲得可靠的提取得率；③在 cfDNA 的定量檢測方法上，針對 PCR 定量檢測方法，可以使用多內參基因分析并開發新的 cfDNA含量評估辦法，經過更多研究確證后形成行業標準并推廣使用，此外可以將拉曼光譜法、電化學傳感器法等靈敏度更高的檢測方法應用到 cfDNA 的定量檢測中。

在 cfDNA 分析前處理中，研究表明部分操作可以作為建立標準化 PAP 的規范。如樣本收集時添加 EDTA 保護液[46-47]和血液樣本及時處理[31]對保證 cfDNA 質量至關重要。隨著技術的快速發展以及越來越多研究人員參與到實際問題的解決中，cfDNA 檢測前處理流程在不久的將來會更加規范，必定也會為臨床診療做出更突出的貢獻。