光電關聯顯微鏡技術快速定位樣品臺的設計及應用

戴玉潔，常 林，趙復慶

（中國科學院重慶綠色智能技術研究院，綜合分析測試中心，重慶 400714）

為了深入探索物質規律，揭示科學問題的本質，科研工作中通常會結合光學顯微鏡、掃描電子顯微鏡（SEM）、原子力顯微鏡（AFM）、顯微拉曼光譜儀等各種儀器對材料、芯片等目標分析物進行多維度的分析，以獲取更全面、準確的特征.上述儀器已經廣泛的應用于各個學科的研究中，然而當前主流的技術手段對不同維度數據的分析呈現割裂狀態，對于同一微區目標樣品的原位聯合分析仍缺乏有效手段.尤其是主流高端科學儀器處于國外壟斷狀態，市場成熟的聯用產品通常造價較高，也無法同時實現多種科學儀器的聯用.

光電關聯顯微鏡技術（correlative light and electron microscopy，CLEM）可將樣品同一區域的光學顯微圖像和電子顯微圖像聯動，從而實現樣品表面跨尺度（毫米尺度光學成像到微納尺度電子成像）形貌研究，以及同一區域電子圖像與光學圖像的嵌合，以更全面的獲取樣品表面形貌特征.這種技術同時結合了光學顯微鏡大視野和電子顯微鏡高分辨大景深的技術優勢，能實現諸多光學顯微鏡下工作儀器（如AFM、顯微拉曼光譜等）的聯用，因而在眾多學科領域應用廣泛[1-5].

拉曼光譜廣泛應用于二維材料層數的表征及半導體器件及材料性能的研究.目標區域半導體材料的快速定位對于半導體器件的表征及制備有重要意義，目前工作流程仍停留在肉眼判定和大范圍篩查上.研究人員在拉曼光譜下定位到目標樣品后，較難在SEM、激光直寫、AFM 等儀器中定位至同一位置，大大影響了樣品表征的效率以及半導體器件電極的制備效率.此外，表面增強拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）可以快速、無損地檢測目標分析物[6]，但在實際應用中仍面臨重復性差、靈敏度低等問題.常見的SERS 基底包括芯片型[7-9]、納米顆粒溶膠[10-14]型，其中芯片型基底具有較高的一致性和穩定性，表面增強區域分布均一，但其靈敏度仍有一定限制.納米顆粒溶膠型基底具有強烈的局域表面等離激元共振效應和密集的熱點，靈敏度較高，但由于納米顆粒溶膠的團聚過程不可控，該類型的基底穩定性和一致性較低.為實現高性能的SERS 分析，納米顆粒溶膠在基底設計中不可或缺，但如何提升其穩定性和一致性，以及如何選取合適的區域進行SERS 檢測至關重要.對于該區域的光學圖像、電子圖像、元素分布圖像的原位嵌合以及跨尺度形貌表征是探明其增強機制和優化基底設計策略的前提.

為此，本文開發了分區帶標記的光學標尺及配套定制樣品臺，將其坐標與電子顯微鏡坐標相對應，通過掃描電子顯微鏡-能譜儀大面積拼接功能獲得樣品不同區域元素分布情況，實現了大面積電子圖像及能譜圖像的拼接及與光學圖像的同步，從而實現SERS 基底目標區域的多維度、跨尺度信息獲取，為相關機制研究提供有力支撐.

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

定制樣品臺、標尺制備所需儀器與材料：石英玻璃（定制，4 cm ×4 cm ×2 mm）；CNC 定制鋁合金（6061 型）；S1805 光刻膠（Microchem，美國）；顯影液（Microchem，美國）；勻膠機（EZ4，江蘇雷博，中國）；激光直寫機（DWL 66Fs，Heidelberg，德國）；濺射鍍膜機（DP650，Alliance concept，法國）；異丙醇（百靈威，中國）；丙酮（科隆試劑，中國）.分析測試設備包括：場發射掃描電子顯微鏡（JSM-7800F，JEOL，日本），光學顯微鏡（Primostar1，Zeiss，德國），高拍儀（GP1500AF，廣州科密，中國），原子力顯微鏡（Dimension EDGE，Bruker，德國），激光共聚焦拉曼光譜儀（InVia Reflex，Renishaw，英國）.試驗所用試劑均為分析純，沒有進一步純化處理，去離子水由實驗室純水機制得.

1.2 CLEM 定位樣品臺的設計與制作

1.2.1 樣品臺的設計與制作

本文定制的CLEM 樣品臺分為上下兩個部分，其設計如圖1（a）（c）所示，下方紅色部分為樣品臺底座，上方灰色部分為標尺邊框，其中下方紅色部分主要起樣品承載作用以及與SEM 標準樣品臺的固定連接，上方灰色部分為鏤空框架，用以搭載定位標尺，上下兩部分通過卡扣結合.使用50 mm×50 mm× 5 mm 的鋁合金板，通過數控車床CNC 按設計圖紙進行切割加工，得到試驗所需定制樣品臺，如圖1（b）所示.

圖1 定制樣品臺（a）（c）設計圖及（b）實物圖Fig. 1 (a) (c) Design drawings and (b) physical drawing of customized sample stage

1.2.2 定位標尺的制作

選擇2 mm 厚的透明石英片作為定位標尺的基底，通過微納加工的方式在石英片的一面標記坐標，具體加工流程如圖2（a）所示.

圖2 （a）標尺加工流程圖，（b）標尺實物圖Fig. 2 (a) Flow chart of ruler processing, (b) physical drawing of ruler

首先，在石英片上旋涂一層S1805 光刻膠并進行前烘程序，使用激光直寫機將預先設計好的標尺圖形曝光到涂有光刻膠的石英片上，之后對曝光的基片進行顯影處理，并用N2槍吹干.顯影后的基片采用濺射鍍膜儀先后進行Cr 20 nm 及Au 100 nm濺射，之后用丙酮超聲清洗5 min 剝離剩余光刻膠.最后以異丙醇、去離子水分別清洗石英片并用N2槍吹干，即可獲得覆有坐標的標尺，如圖2（b）所示.其中標尺的尺寸為4 cm × 4 cm，每個微區大小為2 mm ×2 mm，每個微區分別以字母A 至T 代表行數，以數字1 至20 代表列數進行標記.

1.3 CLEM 樣品臺的快速定位分析流程

使用CLEM 標尺進行定位時，首先采用標尺上的微區對目標區域進行粗定位，之后以目視判斷的方法對微區內的光學特征與電子顯微特征進行對照，以實現原位圖像嵌合.具體流程如圖3（a）所示：

圖3 CLEM 樣品臺用于快速定位分析Fig. 3 Correlative light and electron microscopy sample stage for rapid localization analysis

（1）將負載有目標分析物（實驗室制備的WS2[15]）的硅片用碳導電膠帶固定在定制的樣品臺底座上，并將定制樣品臺用導電膠帶固定到SEM 標準樣品臺上.

（2）將帶有標尺的石英片覆蓋在上述第一步固定有目標分析物的定制樣品臺中，并用高拍儀從俯視視角拍攝樣品臺（從上至下包含樣品臺標尺，硅片，樣品臺底座和SEM 標準樣品臺）.

（3）將上述高拍儀拍攝的圖像導入能譜儀軟件AZtec，然后去掉帶標尺的石英片，將第一步固定好的樣品送入SEM 樣品倉內.

（4）利用第三步導入的樣品圖像，使用能譜儀軟件AZtec 圖像配準功能，實現能譜儀軟件控制樣品臺定位和導航.在SEM 觀察模式下進行微區形貌分析，確定目標分析位點，并拍攝相應的SEM 形貌圖[如圖3（b）所示].此時，在能譜儀軟件AZtec 圖像配準模式下讀出該處目標區域標尺坐標.

（5）將第一步固定好樣品的定制樣品臺取下，根據樣品表征需要放入拉曼光譜儀、光學顯微鏡和AFM，根據第四步所得標尺坐標值，分別快速定位至檢測區域，在目標區域進行拉曼檢測[圖3（c）]、光學圖像拍攝[圖3（d）]、AFM 表征[圖3（e）]，獲得相應表征數據.

2 結果與討論

2.1 利用CLEM 樣品臺表征二維材料

按照1.3 項下的快速定位分析流程表征實驗室制備的WS2二維材料.圖4 為同一WS2樣品點在光學顯微鏡、SEM、拉曼光譜、AFM 下獲得的材料信息.使用CLEM 樣品臺快速定位后，能夠實現樣品的粗定位和導航，在進行SEM 拍攝時，其對應區域的圖像信息可與光學顯微鏡圖像進行對照，實現原位圖像嵌合.如圖4（a）所示，WS2片層結構粗定位于標尺A1 區域，其對應的光學圖像如圖4（a1）（a2）所示.根據其粗定位坐標可快速在SEM 中定位單個WS2材料的位置，對應的SEM 圖像如圖4（a3）（a4）所示，對照光學和對應的SEM 圖像確定嵌合，其嵌套精度可達微米尺度.同時利用光學導航定位，實現了相同位置拉曼光譜儀中單個WS2材料的快速定位與mapping 分析，如圖4（b）所示，其特征結構與光學顯微圖像及SEM 圖像吻合，證實所制備的快速定位樣品臺的優越性.并且利用該樣品臺快速定位至單個WS2材料對其成分[圖4（c）]及層厚進行分析[圖4（d）].表明所設計的CLEM 樣品臺可實現快速定位，并聯合高分辨電子顯微圖像、AFM、拉曼光譜對同一位置、同一WS2樣品點實現成分、形貌、厚度等多種信息的原位表征.

圖4 （a1）（a2）A1 區域左側WS2 樣品光學顯微圖像及（a3）（a4）電子顯微圖像，（b）同一位置的拉曼mapping 圖，（c）WS2樣品拉曼譜圖，（d）WS2 樣品AFM 厚度測定Fig. 4 (a1) (a2) Optical microscopy images and (a3) (a4) electron microscopy images of WS2 at left of region A1, (b) Raman mapping results of same location, (c) Raman spectrum of WS2, (d) AFM image of WS2

2.2 利用CLEM 樣品臺解析雙咖啡環增強機制

本課題組已通過耦合金納米棒和陷光結構石英片，制備了一種基于雙咖啡環效應的新型基底，所制備的新型基底為疏水陷光結構.陷光結構由刻蝕石英片后形成，呈凹凸結構，陣列排布，該結構能保護金納米棒不被解吸并提高基底穩定性（如圖5所示）.金納米棒與陷光結構組裝后，聚集在陷光結構凹面上.陷光結構還進行了疏水化處理，避免下一個液滴與金納米棒接觸[16].不同于傳統SERS 基底，該基底能夠實現高靈敏、高一致性檢測的區域僅位于雙咖啡環交叉處.在試驗過程中，需要反復定位同一位置咖啡環，并對其進行分析，利用現有的光學顯微鏡及SEM 很難實現定位嵌合，但所設計的CLEM 樣品臺可以在不同分析儀器（如SEM、SERS 等）間實現同一位置咖啡環的重復定位.通過能譜大面積拼接元素分布分析驗證了目標分析物以及金納米顆粒溶膠在咖啡環上的富集，聯合拉曼光譜技術驗證了基于雙咖啡環效應下SERS 檢測性能的提升.通過高分辨掃描電子圖像進一步揭示了雙咖啡環效應的底層原理，最終實現了三苯基錫的快速檢測.

圖5 陷光結構微觀形貌[16]Fig. 5 SEM of light-confining structures[16]

使用定制的CLEM 樣品臺以及大面積拼接能譜功能對單、雙咖啡環區域進行大面積成像[圖6（a）]和元素分布[圖6（b）（c）]分析，證實了金納米棒在第一咖啡環形成時同步組裝在陷光結構的內部，金納米棒在咖啡環效應的作用下大部分分布到液滴邊沿，在毛細力作用下進行組裝，該結果由能譜大面積拼接決定[圖6（c）].目標分析物三苯基錫在第二咖啡環形成時，在其與第一咖啡環交叉處與金納米棒充分混合、吸附，待液滴完全揮發后，待測物完全吸附在金納米棒的表面，形成共混的自組裝體系，使待測物充分的分布在熱點區域，目標分析物的分布由能譜大面積拼接決定[圖6（b）].由于咖啡環效應，該體系位于陷光結構的作用區域內，在陷光效應下其電場強度得到進一步的增強，提高了SERS檢測的穩定性和一致性，并且在咖啡環效應和超疏水的雙重作用下，納米溶膠和待測物三苯基錫均會在咖啡環上充分富集，進一步提高基底的靈敏度.

圖6 （a）雙咖啡環的大面積拼接掃描電子圖像，（b）雙咖啡環中第二咖啡環的分析物分布，（c）雙咖啡環中第一咖啡環的金納米顆粒分布，（d）陷光結構耦合雙咖啡環基底與單獨陷光結構及納米顆?；椎男阅軐Ρ?，（e）三苯基錫SERS 梯度檢測[16]Fig. 6 (a) Large area SEM image of inter coffee ring, (b) analyte distribution of second coffee ring, (c) gold nanorods distribution of first coffee ring, (d) SERS performance comparison of different structures, (e) triphenyltin SERS assay[16]

使用定制的CLEM 樣品臺對比了目標分析物在陷光結構內、目標分析物與金納米顆?；旌系渭釉诠杵?，以及雙咖啡環效應下的基底SERS 性能[圖6（d）]，結果表明雙咖啡環效應下的SERS 性能大幅提升.通過CLEM 聯用手段在顯微拉曼光譜儀下對目標檢測區域快速定位，最終實現了高靈敏度、高一致性的三苯基錫檢測，檢測下限達到10-12mol/L[圖6（e）].

3 結論與展望

本研究設計制作了一種通過光學導航、目視粗定位以及顯微圖像定位結合的樣品臺及配套標尺.快速實現了SEM 與光學顯微鏡及其他具有顯微光學系統的儀器（AFM、顯微拉曼光譜儀）聯用，大大增強了儀器聯用程度以及平臺的樣品原位數據分析能力.成功實現了二維材料SEM、拉曼以及AFM 聯合表征，聯合拉曼、SEM 以及大面積拼接功能，解析了SERS 基底的增強機制.該樣品臺及標尺廣泛兼容了材料制備、分析過程中需使用到的多數儀器，大大提升了相關學科數據獲取能力，對其科研工作具有重要意義.由于當前樣品臺的定位仍然需要目視嵌合，無法實現自動化微納米尺度的套準，未來還可搭載電動位移臺、電驅系統以及與各儀器廠商的樣品臺適配等，集成原位拉伸、原位電化學等系統，以實現更為全面的樣品分析.