腦部外源性顆粒態污染物的識別與追蹤＊

李翔宇 黃俞銘 李林謙 陸達偉 劉 倩 江桂斌

（1.中國科學院生態環境研究中心，環境化學與環境毒理重點實驗室，北京，100085；2.中國科學院大學，北京，100049；3.江漢大學，武漢，430056）

近年來，流行病學研究已經發現大氣污染與腦血管、高血壓等腦部疾病發生或惡化有較強關聯[1?5].這說明外源性污染物很可能可以進入大腦并引發不可逆的損傷.比如，顆粒物可能誘導大腦中的蛋白質產生錯誤折疊，進而影響其生物學功能或產生毒性效應，如Aβ 淀粉蛋白和TAU 蛋白[6?8]；顆粒物可能干擾脂質代謝，使其發生紊亂，如升高腦血管中的膽固醇水平[9?11]；顆粒物可能影響特定基因表達，通過調控生酮作用、糖基化、神經細胞增值分化，進而引發腦部神經系統損傷[12?14]；顆粒物可能改變血管的緊張度，引起血管炎癥，促進心腦血管動脈粥樣硬化，增加腦卒中風險[15?17].2016年，英國蘭卡斯特大學研究團隊發現在英國曼徹斯特城的真實人體的大腦內存在0.3—12 μg·g?1磁性Fe3O4超細顆粒物[18]，并推斷其主要來源于大氣細顆粒物（PM2.5）.2022年，中國科學院生態環境中心劉思金研究團隊在腦部疾病患者的腦脊液樣本中發現外源性超細顆粒物[19].這引起人們對PM2.5能否進入大腦的廣泛關注.大腦不同于腎臟、脾臟、肝臟等，其具備較為嚴密的血腦屏障，可阻止大部分外源性污染物由血液進入其內，從而維持腦內部環境穩定.因此，關于外源性污染物（包括粒徑更小的超細顆粒物）能否進入大腦一直存在較大的爭議.目前，關于外源性顆粒物入腦的潛在途徑主要包括[20?26]：1、顆粒態污染物通過嗅神經入腦；2、顆粒態污染物與特定蛋白質結合（如血漿載脂蛋白E），再與血腦屏障中細胞受體作用以胞飲形式進入大腦，而不破壞血腦屏障；3、顆粒態污染物暴露進入血液，之后破壞血腦屏障而進入大腦.上述入腦途徑主要是基于金屬納米顆粒物的研究結果，真實環境中的顆粒態污染物成分極其復雜，既包括金屬組分，也包括大量有機組分.對于真實環境中可以入腦的污染物信息、暴露途徑、跨生物屏障轉運、代謝歸趨及生命周期等尚不清楚.隨著非靶向分析技術、暴露組學、原位成像技術和敏感的生物屏障模型等環境分析和環境毒理學技術的快速發展，可嘗試針對腦部外源性顆粒態污染物建立“識別-暴露-表征-追蹤” 的全流程研究路線，以厘清腦部顆粒態污染物的賦存特征，辨識具體暴露途徑，闡明代謝轉化行為機制等，進而為研究環境污染與腦部疾病的健康危害提供科學支撐.本文圍繞腦部外源性顆粒物污染，總結提出腦部顆粒態污染物識別與追蹤的潛在研究方法.

1 腦部顆粒態污染物的非靶向識別（Non-target identification of PM in the brain）

外源性顆粒態污染物組成復雜，包括各類無機組分和有機組分.因此，對于腦內未知顆粒態污染物的識別可以分為無機組分和有機組分的非靶向分析.面向無機組分的非靶向分析主要采取電感耦合等離子體質譜技術（ICP-MS）對腦部提取出的顆粒態污染物的元素組成進行解析.其中，需要解決的一個瓶頸問題是如何從腦部盡可能多的提取出顆粒態污染物.目前，本研究團隊已建立適用于生物樣本中超細顆粒物提純分離方法，主要通過生物酶（核酸酶、蛋白酶）和生物堿（四甲基氫氧化銨）等在保留顆粒態污染物微觀結構的前提下盡可能去除干擾，隨后通過超濾、離心等方法完成富集分離，通過標準加標回收法嚴格質量控制[27?28].腦部顆粒態污染物提取可以此為基礎進一步優化.提取出的顆粒態污染物一方面可通過消解為液態進樣分析，進而揭示其元素組成情況；另一方面可以在顆粒水平進行單顆粒分析，比如通過單顆粒飛行時間電感耦合等離子體質譜聯用技術實現，甚至可以通過電子顯微學的X 射線光譜儀、激光剝蝕電感耦合等離子體質譜聯用技術等實現單顆粒原位分析.面向腦部顆粒態污染物中有機組分的非靶向分析主要采用以下分析策略：

①基于多溶劑并行提取建立針對腦部生物樣品的前處理方法，實現其中有機組分的無差別提取，形成適于液相/氣相分離分析的提取液.其中腦部生物樣品的提取步驟為蛋白酶孵育后加有機溶劑進行蛋白沉淀，以釋放蛋白結合態有機物，進而實現最大程度的提取.

② 結合二維液相色譜-高分辨質譜和二維氣相色譜-高分辨質譜建立腦部提取樣本中有機組分的分離與檢測方法，實現提取液中有機組分之間的充分分離和不同極性有機組分的全覆蓋高靈敏檢測（非靶向分析），形成“色譜-質譜全掃描/數據依賴的二級裂解/數據非依賴的二級裂解”譜圖.

③開發腦部樣品顆粒態提取物的數據分析策略，通過機器學習、大數據分析技術，借助有機化學譜數據庫，建立腦部樣品中外源性顆粒態污染物有機組分化學身份識別的方法系統.綜上，實現腦部顆粒態污染物中有機/無機組分的非靶向分析，揭示腦部顆粒態污染物的賦存特征.

2 顆粒態污染物暴露途徑表征（Characterization on the exposed pathway of PM）

目前，關于PM2.5入腦的暴露途徑研究仍存在嚴峻的分析方法學挑戰.現有的入腦途徑（如圖1）解析主要是基于金屬納米顆粒物（如納米銀、納米金、納米二氧化鈰）或金屬摻雜顆粒物的研究結果[25,29?31].由于生物體中貴金屬的背景含量通常較低，可以對體內貴金屬顆粒物直接分析；對于體內含量較高的金屬顆粒物則需通過放射性同位素標記的方法進行示蹤.在黑碳等顆粒物的暴露途徑研究中，主要是通過將貴金屬（如Au）或放射性同位素（如125I）修飾在顆粒物表面[32?33]，進而通過追蹤標記物的信號進而解析其入腦途徑.然而，PM2.5中金銀等貴金屬含量通常很低，很難通過分析其信號解析顆粒物的入腦行為；此外，PM2.5的組成復雜，在其表面進行穩定修飾標記存在技術挑戰[34].因此，目前針對金屬納米顆粒物、碳質顆粒物等研究方法較難直接用于解析PM2.5的腦暴露途徑研究.

圖1 外源性顆粒物腦部污染研究示意圖[25]Fig.1 Exogenous particulate matter in the brain[25]

對PM2.5中顆粒及其附著的有機組分在可能的暴露途徑（嗅神經和血腦屏障）上的原位分析將為解析其入腦行為提供直接證據.近年來快速發展的成像技術為該研究提供了有力工具.比如，飛秒激光剝蝕系統（LA）可以在剝蝕大部分金屬顆粒態物質過程中盡可能減少元素分餾和基體效應，從而滿足后續（多接受器）電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS/MC-ICP-MS）高分辨率的元素或同位素成像分析.這將對識別真實PM2.5中金屬類物質在生物體的空間分布提供有效幫助.此外，基質輔助激光解析電離質譜成像系統（MALDI-MSI）和電噴霧解析電離源質譜成像系統（DESI-MSI）可以實現生物組織和細胞中元素碳（EC）和有機碳（OC）的成像分析[23]，如與高分辨質譜（Orbitrap MS）聯用則可以實現PM2.5有機碳中化合物的識別篩查.電子顯微學和光學顯微技術也可以實現生物組織細胞、金屬顆粒物等微區分析.需要注意的是，上述成像技術的應用對檢測目標物的濃度有一定的要求，因此可能無法全部滿足實際生物腦組織樣本顆粒態污染物的表征分析.鑒于此，研究者可以構建體內和體外的PM2.5暴露模型（如血腦屏障模型），構建真實PM2.5的暴露體系，進而通過上述成像分析技術和高分辨質譜分析技術定性定量的解析PM2.5中可入腦的污染物信息、具體暴露途徑及傳輸效率等.

3 追蹤顆粒態污染物在腦部的代謝與轉化（Tracing the metabolism and transformation of PM in the Brain）

外源性顆粒態污染物暴露進入生物體往往會經歷吸收、轉移、轉化、排出等一系列過程.然而，關于顆粒態污染物在腦部的代謝與排出效率認識十分局限.隨著醫學理論和科學技術的快速發展，可以嘗試針對不同醫療案例設計取樣隊列，并借助質譜分析等技術監測外源性顆粒態污染物入腦代謝和排出的效率.需要注意的是，在這一系列過程中，外源性顆粒態污染物自身往往會發生相應的變化.比如前期研究已表明MoS2納米顆?？稍谏矬w發生生物轉化，降解生成鉬酸根離子，進而參加鉬酶的生物合成，影響肝臟的代謝功能[35].然而，PM2.5在體內特別是腦部的代謝與轉化尚不明確.其主要癥結是生物基質干擾嚴重，且在生物體內可通過生物礦化作用等生成生物源性的超細顆粒物[18].穩定同位素可作為示蹤PM2.5關鍵活性組分生物轉化研究的有效工具.穩定同位素是質子數相同、中子數不同的非放射性元素形式.由于同一元素的不同穩定同位素之間存在一定的質量差異，其組成可能在一些特殊的物理、化學和生物過程中發生變化，即穩定同位素分餾.PM2.5與生物體內源性生成的生物源性細顆粒物經歷了不同的生成過程，因此可以根據穩定同位素指紋分析實現兩者的區分，從而扣除生物源性顆粒物的干擾.另外，PM2.5細顆粒物在生物體內發生系列生物轉化過程也可引起相關元素的穩定同位素分餾行為，可通過穩定同位素分析解析PM2.5中關鍵活性組分的腦部生物轉化行為并追蹤其參與的重要生命過程.需要注意的是，實際樣品同位素指紋分析對目標組分含量有一定的要求.

對于無法滿足實際分析測試需要的情況，可以通過構建真實PM2.5的暴露體系研究其在腦部的代謝與轉化行為研究.比如，可以在活體動物層面開展PM2.5暴露實驗，研究其代謝動力學，并對其腦部組織不同區位樣本進行的多維表征，與初始暴露的顆粒物的結構、形貌、化學組成進行比對分析，基于呈現的差異推斷其可能的轉化行為.進而，在分子和細胞層面具體研究可能發生的生化反應及同位素分餾規律，基于同位素分餾規律解析指證其在活體腦部層面的轉化過程，比如，在模擬生理條件下，構建肺部表面活性物質與血漿蛋白冠包覆的PM2.5及相關標準品生物轉化過程中可能涉及的重要生物化學反應（如生物源性顆粒物（如Fe3O4）生成，pH 介導的解離，I 相代謝酶（細胞色素P450 酶等）介導的氧化還原，II 相代謝酶介導的配位結合，與膜運輸、轉運蛋白、儲存蛋白等關鍵蛋白的結合，典型金屬酶的生物合成等），評估相關反應動力學，分析反應物和生成物的同位素組成變化情況，構建同位素分餾模型，標定同位素分餾系數，闡明相應反應過程的同位素分餾機制.進而，將之與細胞水平和活體水平細顆粒物生物轉化過程中的同位素分餾情況比對，以揭示目標組分生物轉化過程中發生的相關反應.

4 總結與展望（Conclusion and perspectives）

本文圍繞PM2.5的腦部識別與追蹤中的研究現狀與瓶頸問題，提出綜合應用非靶向分析、原位成像、同位素追蹤等技術開展相關研究，揭示腦部外源性顆粒物的污染特征，區分腦部顆粒態物質的生物源性與外源性，識別具體環境來源與可能的暴露途徑，追蹤其關鍵組分的生物轉化與代謝歸趨.需要注意的是，本文所描述的研究對象主要是醫院的臨床隊列，即在遵照醫學倫理要求的前提下，對醫院具體診療中可以采集到的靶器官樣本進行系統分析.考慮到腦部疾病發生過程很有可能導致血腦屏障的破損，從而增加顆粒態污染物的暴露風險.因此，未來對于健康人群隊列的腦部顆粒物的識別與追蹤方法研究非常重要.但是由于方法學的限制，目前對于健康人群體內顆粒物的識別與追蹤仍存在極大的挑戰.對腦部顆粒態污染物的準確識別與追蹤是科學評估其腦部生物學效應的基本前提.目前關于顆粒物在腦部的生物學效應評估多是基于高暴露濃度的研究結果，無法準確發應真實環境中低劑量、偶發性暴露的效應特征.

腦部顆粒態污染物的識別與追蹤研究是科學認識顆粒物健康風險的重點.基于準確的腦部顆粒物識別與追蹤的研究結果，才能開發設計可評估真實環境劑量、環境暴露的敏感毒理學模型等，這也是未來厘清顆粒物腦部生物學效應的關鍵.為此，未來在以下幾個方面有待開展更多的研究：第一，繼續圍繞臨床隊列開發更廣譜的非靶向識別技術.比如提高質譜電離效率，豐富二級譜圖數據庫等；第二，需要針對生物樣本建立高空間分辨的原位成像技術；第三，開發適用于健康人群隊列腦部外源性顆粒物的識別與追蹤方法.比如，優化的生物電成像技術，有效的顆粒物標志物.第四，開發更靈敏、更真實的毒理學模型.第五，需要進一步結合人工智能技術，如完善腦部外源性顆粒物化學指紋信息及生化反應數據庫.