酶法提取草莓中白藜蘆醇及其抗氧化性研究

唐 功

(阿壩師范學院 資源與環境學院 , 四川 汶川 623002)

科學研究已經證實,在草莓果實中,既含有豐富的糖類、脂肪、蛋白質、維生素等營養物質,還含有白藜蘆醇等活性成分,具有增強機體抗氧化力和免疫力以及減緩皮膚衰老等保健作用。白藜蘆醇是強大的抗氧化劑,是天然優良的自由基清除劑,對人類健康和預防疾病具有非常高的作用[1]。

白藜蘆醇提取方法主要有溶劑提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法、超聲波提取法、酶解法等[2-5]。有機溶劑提取法試劑用量大,提取效率不高,且提取法提取時間長;超聲波提取和微波提取這兩種方法雖然提取時間快,操作方便,但安全性和產物性質的穩定性還不能得到有效的保證;超臨界CO2萃取法對原料粒度要求高,設備維護費高。因此,本實驗擬采用纖維素酶解法。纖維素酶解法具有作用條件溫和,不易造成污染的特點。

目前野生的白藜蘆醇資源稀缺,市場的需求量很大。在我國草莓中白藜蘆醇的提取工藝研究甚少,因此本實驗以草莓為原料,采用纖維素酶法提取草莓中白藜蘆醇。在單因素實驗的基礎上,借助正交試驗優化草莓中白藜蘆醇的最佳提取條件。通過對DPPH自由基和·OH自由基清除率的測定,評價該條件下所得草莓中白藜蘆醇的抗氧化活性,以期為白藜蘆醇的提取、研究和開發相關保健產品提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

草莓,汶川縣水磨鎮市售,烘干粉碎后備用;白藜蘆醇標準品,≥98%,合肥博美生物科技有限責任公司;纖維素酶10 000 U/g,無錫高潤杰科技有限公司;抗壞血酸、無水乙醇,四川西隴科學有限公司;DPPH,Scientific PHygene,含量>97.0%,上海吉至生化科技有限公司;3,5二硝基水楊酸,成都市科龍化工試劑廠;檸檬酸,天津市博迪化工有限公司。

1.2 實驗儀器

UV-1800PC型紫外分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;TDZ6B-WS臺式低速自動平衡離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司;DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱,上海齊欣科學儀器有限公司;JJ324BC型電子天平,常熟市雙杰測試儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1原料預處理

將草莓洗凈、晾干,60 ℃烘干后用高速粉碎機粉碎,過篩,得到草莓粉末,最后放置棕色瓶內保存備用。

1.3.2樣品中白藜蘆醇的提取

稱取1.0 g草莓粉末,加入10 mL的緩沖溶液,按料液比加入一定濃度的乙醇溶液以及一定量的纖維素酶,在一定溫度的恒溫水浴鍋內水浴數分鐘后將提取液離心10 min;取1 mL上清液加乙醇溶液稀釋50倍后在n=306 nm處測其吸光值,計算其提取量(mg/g)[6]。

白藜蘆醇提取量=cV/m

(1)

式中：c,粗提液中白藜蘆醇濃度,mg/L;V,粗提液體積,L;m,草莓粉質量,g。

1.3.3單因素實驗設計

依據1.3.2的方法,考察提取劑濃度、pH值、酶添加量以及料液比對草莓中白藜蘆醇提取量的影響。參數具體設置如下：提取劑濃度為40%、50%、60%、70%、80%;pH值為3、4、5、6、7;酶添加量為10、15、20、25、30 mg;料液比(g/mL)為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。

1.3.4正交試驗設計

為了使提取方案達到最佳的優化效果,在單因素實驗的基礎上,設計四因素三水平正交試驗,如表1所示。

表1 正交試驗設計

1.3.5DPPH自由基清除率測定

分別取不同濃度草莓白藜蘆醇粗提液、Vc各2 mL,具體梯度設置為1.0、1.4、1.8、2.2、2.6 mg/L。再加入2 mL的40 mg/L DPPH溶液,搖勻,在室溫黑暗環境下反應20 min;反應完成后,以Vc為對照,在n=517 nm處測其吸光值(Ai);并分別對草莓白藜蘆醇粗提液、Vc設置3組平行實驗,最終結果取3組平均值。無水乙醇替代粗提液,測得空白吸光度吸光度(A0),重復3次。將吸光度值帶入下面公式(2)中,計算出草莓中白藜蘆醇以及Vc對 DPPH 自由基的清除率。

1.3.6·OH自由基清除率測定

分別取不同濃度草莓白藜蘆醇、Vc各2 mL,具體梯度設置為1.0、1.4、1.8、2.2、 2.6 mg/L,加入6 mmol/L水楊酸溶液和FeSO4溶液各2 mL,再加入0.2%H2O2溶液2 mL反應30 min。反應完成后在n=510 nm下測其吸光值(Ai),分別對草莓白藜蘆醇粗提液、Vc設置3組平行實驗;蒸餾水替代樣品溶液,測得空白吸光度(A0),設置3組平行實驗,最終結果取3組平均值。將吸光度值帶入公式(2)中,計算出草莓白藜蘆醇以及Vc對·OH自由基的清除率[7]。

清除率(%)=(A0-Ai)×100/A0

(2)

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1提取劑濃度對草莓中白藜蘆醇提取量的影響

保持pH值=5,酶添加量25 mg,料液比1∶40(g/mL)不變,研究提取溶劑濃度對提取量的影響,結果見圖1。

圖1 提取溶劑濃度對白藜蘆醇提取量的影響

由圖1可知,當提取溶劑濃度在40%～60%時,提取溶劑濃度增大,白藜蘆醇的提取量也不斷升高,最大提取量為4.62 mg/g;此后,白藜蘆醇的提取量開始下降。分析原因,可能是乙醇濃度過高對白藜蘆醇的結構造成破壞。提取溶劑濃度為60%時有最大提取量,因此60%作為最適宜的提取溶劑濃度。

2.1.2pH值對草莓中白藜蘆醇提取量的影響

保持提取劑濃度60%,酶添加量25 mg,料液比1∶40(g /mL)不變,研究不同pH值對提取量的影響,結果見圖2。

圖2 pH值對白藜蘆醇提取量的影響

由圖2可知,當 pH值在3～5時,隨著pH值的不斷增大,白藜蘆醇的提取量也在不斷升高,當pH值=5時,最大提取量為2.47 mg/g;此后隨著pH值增加,白藜蘆醇的提取量下降。原因可能是pH值過高使酶的活性降低,從而影響白藜蘆醇的提取量。因此pH值=5最適宜。

2.1.3酶添加量對草莓中白藜蘆醇提取量的影響

控制提取劑濃度60%,pH值=5,料液比1∶40(g /mL)不變,研究酶的不同添加量對提取量的影響,結果見圖3。

圖3 酶添加量對白藜蘆醇提取量的影響

由圖3可知,當酶添加量在10～25 mg時,隨著加酶量的升高,在25 mg時曲線達到峰值,最大提取量為3.93 mg/g;由于過量的酶分子不利于分子定向運動,酶活性降低,導致提取量開始回降。酶添加量為25 mg時提取量最大,因此25 mg作為最適宜的酶添加量。

2.1.4料液比對草莓中白藜蘆醇提取量的影響

控制提取劑濃度60%,pH值=5,酶添加量25 mg不變,研究不同料液比對提取量的影響,結果見圖4。

圖4 料液比對白藜蘆醇提取量的影響

由圖4可知,增大料液比,提取量升高,1∶40(g/mL)時提取量最大為3.46 mg/g;此后提取量下降。若液料比適宜,則有利于白藜蘆醇進入到乙醇中,使白藜蘆醇充分溶解;但液料比達到一定程度后,白藜蘆醇大部分已被提取劑充分溶解,繼續增大液料比,就會造成溶質過少、溶劑過多的情況,草莓粉末所受的作用力就會減小,最后反而提取量減少。料液比為1∶40(g /mL)時有最大提取量,因此1∶40(g /mL)作為最適宜的料液比。

2.2 正交試驗

在單因素基礎上進行四因素三水平正交試驗,結果如表2所示。

表2 正交試驗結果表

由表2可知,四個因素對白藜蘆醇提取量的影響程度依次為A>C>B>D,即提取劑濃度>酶添加量>pH值>料液比。最佳提取工藝為：

A2B2C2D2,即提取劑濃度60%,pH值=5,酶添加量25 mg,料液比1∶40(g/mL)。在最佳實驗條件下,提取量最大,為5.23 mg/g。

2.3 抗氧化性實驗

2.3.1草莓白藜蘆醇DPPH自由基清除能力的測定

草莓白藜蘆醇的 DPPH 自由基清除活性見圖5。

圖5 草莓白藜蘆醇的 DPPH 自由基清除活性

由圖5可知,在1.0～2.6 mg/L內,隨著白藜蘆醇濃度的增加,草莓中白藜蘆醇對DPPH自由基的清除活性也相應增加;且草莓白藜蘆醇粗提液清除活性>Vc清除活性,白藜蘆醇濃度為2.6 mg/L時,對DPPH自由基清除率為77.1%。

2.3.2草莓白藜蘆醇·OH自由基清除能力的測定

由圖6可知,在1.0～2.6 mg/L內,隨著白藜蘆醇濃度的增加,草莓中白藜蘆醇對·OH自由基的清除活性也相應增加;且草莓白藜蘆醇粗提液清除活性>Vc清除活性,白藜蘆醇濃度為2.6 mg/L時,對·OH自由基清除率為70.2%。

圖6 草莓白藜蘆醇的·OH自由基清除活性

3 結論

本實驗采用酶法探究草莓中白藜蘆醇的提取工藝,同時采用正交試驗對白藜蘆醇的提取工藝條件進行優化。草莓白藜蘆醇提取的最佳工藝為提取劑濃度60%,pH值=5,酶添加量25 mg,料液比1∶40 (g /mL),提取量最高為5.23 mg/g?？寡趸詫嶒灲Y果表明：草莓白藜蘆醇對DPPH自由基和·OH自由基清除活性較強,最高清除率分別為77.1%和70.2%,表明白藜蘆醇的抗氧化活性較高。