LncRNA CDC6通過抑制c-Myc表達調節肺癌細胞增殖、凋亡和上皮間質轉化

張燕 張紅蕊 孟丹丹 弋振營 李寧 徐志巧

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因之一,其中臨床檢測到的肺癌患者中81%的人群生存期少于5年[1, 2]。由于疾病早期階段通常無癥狀,大多數病例是在晚期被診斷出來的[3]。目前,手術和化療藥物是治療肺癌的主要手段,但許多患者由于治療效果不佳和診斷晚期而在短時間內復發和死亡[4]。LncRNA主要在細胞核中具有活性,參與蛋白質功能的轉錄、翻譯和調節。此外,許多LncRNA被發現在癌癥中異常表現,并在促進腫瘤發生中起關鍵作用[5, 6]。LncRNA CDC6被報道在乳腺癌中表達上調,沉默LncRNA CDC6抑制乳腺癌的增殖和轉移[7]。然而,LncRNA CDC6是否在肺癌發生與發展中發揮作用尚不清楚。Myc原癌基因作為癌癥治療的潛在靶點近年來被深入研究[8]。c-Myc異常表達是癌變過程中較早出現的分子改變,與腫瘤的啟動及癌性增生密切相關[9, 10]。已有研究表明,在胃癌、結腸癌、卵巢癌和子宮內膜癌等多種腫瘤中c-Myc均過度表達[8, 10]。此外,c-Myc在肺癌中顯著高表達,被認為是肺癌發生的一個關鍵的癌基因[11, 12]。在本研究中,我們檢測了肺癌中CDC6和c-Myc的表達,并分析其與患者臨床指標的相關性。此外,通過CDC6和c-Myc的過表達載體或siRNA轉染肺癌細胞,觀察其對肺癌細胞增殖、凋亡等生物學行為的影響。探究LncRNA CDC6和c-Myc在肺癌發生過程中的作用,并探究其具體的作用機制。

資料與方法

一、實驗主要材料

人正常肺上皮細胞BEAS-2B,人肺腺癌細胞SPC-A-1和人非小細胞肺癌細胞系A549、H1650購自中國科學院ATCC細胞庫;RPMI 1640 培養基以及DMEM培養液購自美國Gibco公司;MTT細胞檢測試劑盒購自上海碧云天生物有限公司;Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;pcDNA-CDC6、CDC6-siRNA和pcDNA-c-Myc購自Takara公司;LipofectamineTM2000試劑盒、TRIzol試劑均購自Invitrogen;PrimeScript RT-PCR試劑盒購自Takara公司;SYBR Green試劑盒購自Takara公司;BCA蛋白含量測定試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司;Cyclin D1、Survivin、N cadherin、E cadherin、Bcl-2、Bax、c-Myc抗體購自美國Abcam 公司。

實時熒光定量PCR儀購自德國Eppendorf公司;Thermo VarioskanTMLUX多功能酶標儀購自美國的Thermo Fisher Scientific公司;倒置普通光學顯微鏡購自日本 OLYMPUS公司;免疫印記系統購自美國BioRad公司;凝膠成像分析系統購自Bio-Imaging Systems公司。

二、方法

1. 臨床標本收集

選取2018年1月至2020年1月在開封市中心醫院腫瘤診療中心收住的40例行肺癌根治術的手術患者,其中男性27例,女性13例,年齡31-71歲,平均年齡59歲;取肺癌及癌旁組織標本,且癌旁組織距離腫瘤組織邊緣在5 cm以上。樣本收集后放置于凍存管,置于-80℃超低溫冰箱中保存。本研究已經獲得開封市中心醫院倫理委員會批準(HKF-H-17136),所有患者及其家屬同意并已簽署知情同意書。

2. 細胞培養與轉染

BEAS-2B、SPC-A-1、A549、H1650細胞用RPMI-1640培養基(含 10% 胎牛血清,1% 青鏈霉素)在37℃,5% CO2恒溫培養箱中培養,每隔2～3天換一次培養液。待細胞融合到80%用胰酶進行消化,之后進行傳代培養。

選取對數生長期的A549細胞,以1×105個/孔接種到96孔板中,當細胞生長至70%左右后進行轉染。實驗一:將細胞分為NC-siRNA組、CDC6-siRNA組、Vector組和pcDNA-CDC6組,按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書分別用NC-siRNA、CDC6-siRNA、空載體(Vector)、pcDNA-CDC6轉染細胞48 h。接下來將細胞置于37℃孵育24 h,以備后續實驗。實驗二:將細胞分為NC-siRNA組、CDC6-siRNA組和CDC6-siRNA+pcDNA-c-Myc組,按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書分別用NC-siRNA、CDC6-siRNA轉染細胞,或用CDC6-siRNA和pcDNA-c-Myc共轉染細胞48 h。接下來將細胞置于37℃孵育24 h,以備后續實驗。

3. RT-qPCR分析

使用Trizol提取組織或細胞的總RNA,使用分光光度計測定提取的RNA濃度及純度,若A260 nm/A280 nm處于1.8～2.0范圍,可進行后續實驗。隨后使用PrimeScript RT-PCR試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板,使用SYBR Green進行PCR擴增。反應條件為95℃預變性3 min,之后在95℃變性30 s,58℃ 退火30 s,72℃延伸30 s,進行35個循環;接下來,72℃保溫10 min。GAPDH作為內參,采用2-ΔΔCt計算基因的相對表達水平。引物序列如下:LncRNA CDC6 F:5′‐CTC TGA AAT GAA CAC TAC CCA C‐3′,R: 5′-CCA TCA GCC TTC GGA CA-3′;c-Myc F:5′-AAT GAA AAG GCC CCC AAG GTA GTT ATC C-3′,R:5′-GTC GTT TCC GCA ACA AGT CCT CTT C-3′;GAPDH F: 5′-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3′,R: 5′-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3′。

4. Western Blotting分析

用RIPA裂解液提取組織和細胞中的總蛋白,BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品在SDS-PAGE膠中分離后轉移至PVDF膜。接下來,用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,加入一抗4 ℃孵育過夜。膜洗滌后,加入二抗室溫孵育1 h,TBST洗滌。最后,采用ECL試劑盒使條帶可視化,使用Image J軟件進行灰度值分析。

5. MTT法檢測細胞增殖

將濃度為2×104個/mL的細胞以每孔200 μL接種于96孔板,在37℃、5% CO2的培養箱中培養。分別于鋪管后24、48、72 h,每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,繼續培養4 h,離心,吸棄孔內培養基上清液,若有懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加入100 μL DMSO。低速搖晃10 min,使晶體充分溶解。用分光光度計在490 nm處測定各孔的吸光度。

6. 流式細胞術檢測細胞凋亡

用1×Binding Buffer緩沖液制備1×106個/mL的懸液。在Falcon試管中吸取100 μL的細胞懸液,加入凋亡試劑盒中Annexin V和PI使之充分混合,在室溫避光處孵育15 min。隨后在每個試管中分別加入400 μL 1×Binding Buffer緩沖液?；靹蚝笤? h內使用流式細胞儀進行檢測。

三、統計學分析

結 果

一、CDC6和c-Myc在肺癌組織和細胞中的表達

與癌旁組織相比,CDC6在肺癌組織中的表達顯著升高(P<0.01)(見圖1A)。與人正常肺上皮細胞BEAS-2B相比,肺癌細胞系SPC-A-1、A549、H1650中LncRNA CDC6的表達均顯著升高(P<0.05),其中在A549細胞中表達最高(見圖1B)。此外,CDC6和c-Myc mRNA在鱗癌中的表達均高于腺癌;在TNM Ⅲ-Ⅳ 期的表達均高于Ⅰ-Ⅱ 期;肺癌分化程度越高,CDC6和c-Myc mRNA的表達水平越高,有淋巴結轉移者CDC6和c-Myc mRNA的表達較無淋巴結轉移者升高,差異有統計學意義(P<0.05)。CDC6和c-Myc mRNA的表達與性別、年齡和吸煙史沒有明顯的關系(P>0.05)(見表1)。

表1 肺癌患者CDC6和c-Myc的表達水平與臨床特征的關系[n(%)]

圖1 CDC6在肺癌組織和細胞中的表達

二、沉默或過表達CDC6對肺癌細胞增殖和EMT的影響

與NC-siRNA組相比,CDC6-siRNA組的CDC6水平顯著降低(P<0.05);與Vector組相比,pcDNA-CDC6組的CDC6水平顯著升高(P<0.05)(見圖2A)。沉默CDC6抑制肺癌細胞增殖,而過表達CDC6顯著促進細胞增殖(P<0.05)(見圖2B)。CDC6-siRNA組的Cyclin D1、Survivin和N cadherin較NC-siRNA組均顯著降低,而E cadherin蛋白的水平顯著升高;pcDNA-CDC6組的Cyclin D1、Survivin和N cadherin蛋白的水平較Vector組均顯著升高,而E cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)(見圖2C,D)。

圖2 沉默和過表達CDC6對A549細胞增殖和EMT的影響

三、沉默或過表達CDC6對肺癌細胞凋亡的影響

與NC-siRNA組相比,CDC6-siRNA組的細胞凋亡率顯著升高,與Vector組比較,pcDNA-CDC6組的細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(見圖3A,B)。此外,與NC-siRNA組比較,CDC6-siRNA組的促凋亡蛋白Bax水平顯著升高,抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低(P<0.05);與Vector組比較,pcDNA-CDC6組的Bax蛋白水平降低, Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)(見圖3C,D)。

圖3 沉默和過表達LncRNA CDC6對肺癌細胞A549凋亡的影響

四、CDC6通過調控c-Myc影響肺癌細胞增殖和EMT

與NC-siRNA組比較,CDC6-siRNA組肺癌細胞中c-Myc mRNA表達降低(P<0.05);與Vector組比較,pcDNA-CDC6組肺癌細胞中c-Myc mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)(見圖4A)。此外,與CDC6-siRNA組相比,過表達c-Myc顯著增加了c-Myc mRNA的表達水平(P<0.05)(見圖4B)。與CDC6-siRNA組相比,CDC6-siRNA和pcDNA-c-Myc共轉染組細胞的增殖能力顯著增強(P<0.05)(見圖4C)。與CDC6-siRNA組相比,CDC6-siRNA和pcDNA-c-Myc共轉染的肺癌細胞中增殖相關蛋白Cyclin D1、Survivin以及N cadherin蛋白的水平明顯升高,E cadherin蛋白水平明顯降低(P<0.05)(見圖4D,E)。 以上的實驗結果表明c-Myc的過表達抵消了CDC6沉默對細胞增殖和EMT過程的影響。

圖4 LncRNA CDC6沉默通過調控c-Myc影響A549細胞增殖和EMT

五、CDC6通過調控c-Myc影響肺癌的凋亡

與CDC6-siRNA組比較,CDC6-siRNA和pcDNA-c-Myc共轉染的肺癌細胞凋亡率降低,促凋亡蛋白Bax水平降低,抗凋亡蛋白Bcl-2水平升高(P<0.05)(見圖5A-D)。

圖5 CDC6沉默通過調控c-Myc影響A549細胞凋亡

討 論

已有越來越多的研究證實LncRNA在多種腫瘤類型中異常表達,在腫瘤診斷、監測、預后或治療方面具有應用前景[6]。到目前為止,在肺癌的研究中發現了大量的LncRNA,為探索肺癌發病的分子途徑提供了新的視角[13-15]。LncRNA CDC6是一種新發現的LncRNA,CDC6負責復制起始階段MCM蛋白的加載,是DNA復制的重要調節因子[16]。有研究表明LncRNA CDC6在乳腺癌組織中高表達,并通過LncRNA CDC6/miR-251/CDC6軸調控乳腺癌的增殖和轉移[17]。在本研究中,我們發現LncRNA CDC6在肺癌組織和細胞中顯著上調,并且在肺癌患者中CDC6表達與肺癌的病理分型、TNM分期、分化程度以及淋巴結轉移具有顯著的相關性。因此,我們推測LncRNA CDC6的過表達可能參與了肺癌的惡性行為。為了驗證我們的假設,我們首先敲除LncRNA CDC6并檢測其對肺癌細胞增殖、EMT和細胞凋亡的影響。結果顯示敲除LncRNA CDC6導致肺癌細胞系A549增殖能力下降,增殖相關蛋白Cyclin D1和Survivin水平降低,猜測這可能是由于細胞周期G1期阻滯所致。EMT的一個重要分子特征是E cadherin 蛋白的下調。在我們的研究中發現,敲除LncRNA CDC6后的肺癌細胞EMT相關蛋白E cadherin的表達顯著上調,而N cadherin蛋白的表達下調。與此同時,發現敲除LncRNA CDC6促進肺癌細胞系A549的凋亡。為了進一步評估LncRNA CDC6的功能,我們采用CDC6的過表達載體轉染肺癌細胞,功能實驗顯示過表達LncRNA CDC6時E cadherin 蛋白下調,N cadherin蛋白上調,同時促進了A549細胞的增殖及增殖相關因子表達,抑制凋亡及促凋亡相關蛋白表達。因此,我們確定LncRNA CDC6可能是促進肺癌增殖及EMT過程的關鍵調節因子。

c-Myc是一種人類致癌基因,與多種癌癥特征有關[8]。早期研究發現,c-Myc作為一種轉錄因子,參與代謝、細胞生長、細胞周期調控、細胞凋亡等多種生物學過程[18, 19]。此外,c-Myc表達失調導致雙鏈斷裂(DSBs)、DDR的產生,從而促進基因組不穩定性[20, 21]。在本研究中我們發現c-Myc的表達與肺癌組織的病理分型、TNM分期、分化程度以及淋巴結轉移密切相關,因此我們進一步研究了CDC6與c-Myc對肺癌調控的關系。有研究發現c-Myc直接刺激DNA復制的不同機制,不依賴于其轉錄靶點[20]。CDC6過表達可能增加復制效率和c-Myc基因表達。最近的研究表明CDC6與c-Myc復制起始點結合,并且結合增強了c-Myc復制起始點的活性[22]。在我們的研究中發現過表達CDC6時c-Myc的表達上調,這一現象可能與以上的研究機制有關。此外,有研究表明CDC6與c-Myc相互作用,通過干擾c-Myc/Max復合物的形成抑制E-box依賴性轉錄;它通過抑制編碼E cadherin的INK4/ARF和CDH1位點來發揮其致癌活性[22]。但在肺癌模型中,CDC6是否通過調控c-Myc誘發EMT以及是否影響腫瘤的增殖與凋亡尚不清楚。因此我們推測CDC6是通過調控c-Myc影響肺癌的進展,為了驗證這個假設,我們將CDC6-siRNA和pcDNA-c-Myc共轉染到肺癌細胞A549中,檢測EMT相關蛋白表達,以及細胞增殖、凋亡的能力,結果c-Myc過表達抵消了CDC6沉默對A549細胞增殖、凋亡,以及E cadherin、N cadherin表達的影響,這些結果提示CDC6是通過調控c-Myc在肺癌EMT、增殖和凋亡等過程中發揮重要作用。

綜上所述,本研究發現LncRNA CDC6在肺癌組織和細胞中高表達,并且LncRNA CDC6通過c-Myc來調控肺癌的進展。這些結果提示LncRNA CDC6可能是肺癌發生與進展中有價值的診斷和預后新靶點。