不同碳源下共存細菌對銅綠微囊藻生長的影響

孫華龍, 陳國煒, 吳雪菲, 方志鵬, 賈 偉, 劉 麗

(合肥工業大學 土木與水利工程學院,安徽 合肥 230009)

藍藻有害藻華對水資源和人類健康的影響已成為21世紀全球關注的主要問題[1-2]。在過去的幾十年里,由于藍藻的存在,我國經歷了幾次水危機事件[3]。當水體中藻華開始腐爛時,耗氧量增加,水體中的生物大量死亡,進而加劇水體污染[4]。因此,對藻類的生長控制一直是水體富營養化及藻華治理的主要目標[5]。

藻類在大量繁殖的同時,會與其他細菌發生相互作用[6-7],兩者可能為爭奪營養物質及生存空間發生相互抑制的競爭關系[8],也會進行營養互補的有益相互作用[9],這些關系會隨環境中生物因素或非生物因素的變化而改變。其中,碳源對微生物的生長與競爭具有重要作用[10]。然而,對碳源等條件如何影響菌藻關系仍需深入研究。

文獻[11]表明,許多微藻體內的二氧化碳濃縮機制(carbon concentrating mechanism,CCM)已進化為一種適應機制,可以幫助微藻提高碳同化效率,以克服其自然環境中經常出現的二氧化碳可利用性有限的挑戰。在大多數情況下,污水廠對污水的處理僅僅聚焦于有機碳的去除,往往忽略了無機碳的存在,而銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)既是藍藻水華的主要優勢藻種[12-13],也通過CCM利用水環境中的無機碳進行光合作用固碳來促進自身的生長[14]。因此本文選取藻銅綠微囊藻作為研究藻種,菌種選自含有與銅綠微囊藻有作用菌屬的活性污泥。

本文將從不同碳源組合下的菌藻互作機制出發,以菌藻體系為研究對象,選取銅綠微囊藻和活性污泥細菌,探究在不同碳源組合下共存細菌對銅綠微囊藻生長的影響,研究結果將為淡水藻華的治理提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種

實驗采用藻種為銅綠微囊藻(FACHB-905),購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫(武漢),培養于BSG400人工氣候培養箱(博訊,上海)中,設置培養箱溫度為(25±1) ℃,光照強度為2 000 lux,光暗比為12 h/12 h,接種后瓶口用已滅好菌的透氣膜進行封口處理。銅綠微囊藻的接種與培養均采用BG11液體培養基,培養時每天搖動2～3次,使藻細胞充分吸收營養物質,并避免微藻的沉積[15]。

1.2 實驗菌種

實驗中采用活性污泥混合菌為實驗菌種,活性污泥取自合肥工業大學市政工程系SBR反應器。原始污泥群落中氣單胞菌屬Aeromonas數量最多,其次是噬氫菌Hydrogenophaga鐵桿菌屬Ferruginibacte和裝甲菌綱uncultured-bacterium-f-Fimbriimonadaceae[16],由于活性污泥一直處于曝氣狀態,初始活性污泥的群落也會隨之變化,經LB培養后群落以氣單胞菌屬Aeromonas、鄰單胞菌屬Plesiomonas、克雷白氏桿菌屬Klebsiella為主[17]。

取出0.5 mL活性污泥混合液接種至含有250 mL經過滅菌的LB培養基的500 mL錐形瓶中,在培養箱中37 ℃恒溫培養16 h;培養完成后各取40 mL加入到6個50 mL離心管中,在5804高速離心機中(Eppendorf,德國)3 600 r/min離心10 min后,棄去上清液并使用磷酸鹽緩沖液重懸清洗,再次以3 600 r/min離心10 min,重復2次以完全去除LB培養基;最后將每個離心管的底物溶解定容到40 mL,各取1 mL細菌懸液分別稀釋1 000、2 000、5 000、10 000倍,用活死染色法進行細菌計數,確定污泥細菌的密度[18]。

1.3 實驗設置

為探究細菌及碳源對銅綠微囊藻生長的影響,實驗設置無機碳源、有機碳源和混合碳源3種不同的碳源,選用NaHCO3作為無機碳源,葡萄糖作為有機碳源,初始總碳(total carbon,TC)質量濃度設為25 mg/L,并設置4種不同的初始菌藻比(0、1∶2、1∶1、5∶1),實驗組別依次為1、2、3、4,探究不同碳源對銅綠微囊藻生長的影響;對照組是體系不加入任何外源碳源僅與大氣進行氣體交換的實驗。各組還可探究相同碳源的不同初始菌藻比對銅綠微囊藻生長的影響。實驗在人工氣候箱中進行,人工氣候箱設置條件與藻種培養條件一致。

實驗組1。使用4個500 mL玻璃錐形瓶作為反應器,向4個錐形瓶中各加入300 mL培養液重懸稀釋生長至對數期的藻液,使得微藻初始生物量約為4.1×106個/mL(A680=0.18)。向其中3個錐形瓶中分別加入NaHCO3(52.5 mg)、葡萄糖(18.75 mg)、NaHCO3(26.25 mg)+葡萄糖(9.375 mg)3種碳源。

實驗組2。向每個錐形瓶中加入1.5 mL的菌液(細菌生物量為4×108個/mL),使得初始菌藻比為1∶2。其余實驗設置均與實驗組1相同。

實驗組3。除初始菌藻比為1∶1外,其余實驗設置均與實驗組2相同。

實驗組4。除初始菌藻比為5∶1外,其余實驗設置均與實驗組2相同。

對照組。以不加入任何外源碳源在上述4種不同初始菌藻比的培養液中培養。各組實驗設置3個平行樣,以減小實驗誤差。

實驗時所用培養液及組分A、B的成分分別見表1、表2所列。

表2 組分A和組分B的成分

1.4 分析方法

1.4.1 藻細胞數量的測定

藻細胞數量的測定用血細胞計數法[19]。從錐形瓶中取搖勻的樣品藻液3 mL于離心管中。取適量的藻液滴入血球計數板上的計數池,并置于顯微鏡下,通過顯微鏡觀察計數池內的藻細胞數量,計算得出藻液中的藻細胞密度。

1.4.2 葉綠素a質量濃度的測定

葉綠素a質量濃度使用可見光分光光度計比色法測定[20]。首先,從錐形瓶中取搖勻的藻液10 mL以4 000 r/min的轉速離心10 min,去掉上清液;其次,將微藻重新懸浮在90%丙酮(10 mL)中,在4 ℃黑暗中保存24 h;最后,將懸浮液在4 000 r/min下離心15 min。收集上清液,用于測定葉綠素a質量濃度。使用紫外分光光度計測定波長為630、645、663、750 nm下收集的上清液的吸光度A。使用90%丙酮溶液作為空白對照。葉綠素a的質量濃度公式為:

ρa=[11.64(A663-A750)-2.16(A645-

A750)+0.10(A630-A750)]V′/V

(1)

其中:V′為丙酮體積;V為樣品體積。

1.4.3 碳酸鹽體系的測定

實驗采用滴定法測定微藻培養液中碳酸鹽體系(CO32-和HCO3-)的質量濃度[19]。從錐形瓶中取搖勻樣品藻液5 mL于離心管中,使用0.22 μm的濾膜過濾收集上清液于250 mL錐形瓶中,加入45 mL超純水稀釋水樣。滴加2滴酚酞指示劑,振蕩均勻,如出現紅色,繼續使用0.005 mol/L的鹽酸標準溶液滴定至溶液紅色剛剛消失,記錄鹽酸標準溶液的用量V1。然后在此無色溶液中滴加2滴甲基橙指示劑,振蕩均勻,溶液呈黃色,繼續使用0.005 mol/L的鹽酸標準溶液滴定至橙色,記錄鹽酸標準溶液的用量V2。水樣中CO32-和HCO3-的質量濃度公式為:

(2)

(3)

其中:c為鹽酸標準溶液的濃度;V0為所取水樣的體積;60.01 g/mol為CO32-的摩爾質量;61.017 g/mol為HCO3-的摩爾質量。

2 結果與分析

2.1 不同菌藻比下銅綠微囊藻的生長情況

初始菌藻比對銅綠微囊藻在不同營養條件下的生長有不同程度的影響,如圖1所示。

圖1 細菌對銅綠微囊藻生長的影響

由圖1a可知,在無外源碳源的加入時,初始菌藻比從0增加到1∶1,銅綠微囊藻生長速度也隨之加快。當初始菌藻比為1∶1時,銅綠微囊藻可預測的最大生物量為2.1×107個/mL,相較于純藻體系提升33.84%;其次在初始菌藻比為1∶2和5∶1時,可預測的最大生物量分別為1.8×107個/mL和1.7×107個/mL,比純藻體系分別提升12.81%、8.67%。

由圖1c可知,加入25 mg/L的葡萄糖時,在有細菌加入的情況下,隨著初始菌藻比的增大,銅綠微囊藻生長速度逐漸降低。初始菌藻比為1∶2時,銅綠微囊藻有最大預測生物量,培養周期內可預測的最大生物量為4.0×107個/mL;初始菌藻比為1∶1時,培養周期內可預測的最大生物量為3.3×107個/mL;當初始菌藻比增大到5∶1時,培養周期內可預測的最大生物量為1.5×107個/mL。而純藻對照組,實驗周期內可預測的最大生物量為2.0×107個/mL。3組加入了細菌的最大生物量分別是對照組的2.05、1.70、0.76倍。

2.2 葉綠素a的質量濃度

銅綠微囊藻葉綠素a質量濃度如圖2所示。各組的葉綠素a質量濃度隨著時間的延長而增加,并且在無有機碳源存在的情況下,隨著初始菌藻比的升高,葉綠素a質量濃度也隨之增大;而在有有機碳源存在的情況下,隨著初始菌藻比的升高,葉綠素a質量濃度隨之降低。

圖2 不同菌藻比下銅綠微囊藻葉綠素a的質量濃度

各組葉綠素a質量濃度均在第2 天后快速升高,并在第11 天獲得最大葉綠素a質量濃度。

由圖2a可知:在無外源碳源加入時,初始菌藻比為1∶1組的葉綠素a質量濃度最大,實驗末期時為1.70 mg/L,最小的是純藻對照組,實驗末期時為1.41 mg/L。各組之間無顯著差異。

2.3 碳源的吸收

圖3 不同菌藻比下的質量濃度變化情況

圖4 不同菌藻比下質量濃度的變化情況

3 討 論

本文研究在不同初始菌藻比下,3種碳源營養條件對銅綠微囊藻生長的影響。結果表明,不同碳源條件下初始細菌的出現會極大地影響銅綠微囊藻生長。一方面不同菌屬對銅綠微囊藻生長的影響不同,如Rhizobium可以通過固氮作用為微藻提供氮源,促進微藻生長[21];Bacillus、Sphingomonas等可以刺激微藻分泌更多微量營養素代謝物來刺激藻類代謝[22],如維生素B12、植物激素(如IAA、脫落酸、細胞分裂素、乙烯和赤霉素)來刺激銅綠微囊藻的生長[23-24]。但許多鏈霉菌屬Streptomyces,(如S.achromogenes[25]、S.phaeofaciens[26]、S.jiujiangensis[27]等可以分泌含氨基的抑藻物質如蛋白質[28]、賴氨酸[26]和含有賴氨酸的多肽[29])抑制銅綠微囊藻的生長。另一方面,不同碳源對微藻的生長也不相同。

在無機碳源和混合碳源的營養條件下,細菌的出現會極大促進銅綠微囊藻的生長繁殖。這由于細菌與銅綠微囊藻之間存在互利共生的關系,細菌可利用銅綠微囊藻光合作用產生的氧氣參與細胞內的物質能量代謝[24],還可防止培養液內的溶解氧過高而抑制銅綠微囊藻的生長。銅綠微囊藻可以利用細菌呼吸作用產生的CO2作為自身光合作用的無機碳源,同時細菌分泌的一些信號分子(如IAA)也會促進銅綠微囊藻的生長[30]。

而當有外源無機碳源碳酸氫鹽的加入時,因碳酸氫鹽在水中溶解度較高,且與HCO3-相比CO32-對光合作用沒有明顯的促進或抑制作用,故而HCO3-易被微藻大量吸收利用[31]。在加入碳酸氫鈉后,微藻的生物量隨著初始碳酸氫鈉的質量濃度增加而增大,細菌與銅綠微囊藻之間的物質交換增大了銅綠微囊藻的光合作用效率[32],促進了葉綠素a的合成[33],使得銅綠微囊藻生長變快。因此,在適宜的質量濃度下,細菌的加入有利于銅綠微囊藻的生長。

不同有機碳對銅綠微囊藻生長的影響不同。文獻[34]研究了不同濃度有機碳源(葡萄糖、丙酮酸、乙酸、α-酮戊二酸)對銅綠微囊藻產毒的影響,研究表明,碳濃度較低尤其是葡萄糖及α-酮戊二酸處理時毒性水平下降,而當碳濃度提高時,毒性則降到最低。藻類體內的特殊運送系統能主動吸收不同有機碳源[35]。藻細胞對于利用何種有機碳化合物以及利用的程度也具有偏愛性[36]。文獻[37]表明,可溶性有機碳對銅綠微囊藻生長更有利。適當濃度的葡萄糖能夠促進銅綠微囊藻生長,過高濃度則會抑制[38]。

實驗中在有機碳源的營養條件下,適量初始細菌比(如菌藻比為1∶2和1∶1)會促進銅綠微囊藻生長,但細菌數超過一定閥值便會抑制銅綠微囊藻的生長。這是由于細菌與銅綠微囊藻之間不僅是互利共生的關系,更在某些方面也存在著競爭[6]。在有外源有機碳源的加入且細菌的質量濃度過大時,細菌快速增殖,一方面壓榨了銅綠微囊藻的生存空間,遮擋光照,阻礙了銅綠微囊藻對于光能的固定利用[39];另一方面,細菌的質量濃度過大時,銅綠微囊藻為細菌提供營養物質的壓力也隨之變大,銅綠微囊藻的生長相對變慢[40]。本實驗中N和P元素在實驗周期內基本不受限制,因此對銅綠微囊藻葉綠素a的合成沒有影響。

4 結 論

1) 在不同初始菌藻比下,外源碳源的存在均會影響銅綠微囊藻的生長。在TC質量濃度為25 mg/L條件下,外源無機碳和混合碳源對銅綠微囊藻生長的促進較作用較為明顯,經11 d培養銅綠微囊藻生物量可達(1.97～3.98)×107個/mL,顯著高于對照組的(1.44～1.74)×107個/mL,細菌的加入顯著促進了銅綠微囊藻的生長。而當外源碳源為葡萄糖時,隨著初始菌藻比的增大,細菌的大量增殖,微藻的生長逐漸受到抑制。初始菌藻比從1∶2增大到5∶1,經過11 d培養銅綠微囊藻生物量從2.75×107個/mL降低到1.32×107個/mL,甚至小于純藻對照組。

2) 在外源無機碳源和混合碳源組經11 d的培養后,葉綠素a質量濃度(2.26～3.94) mg/L,均明顯高于對照組(1.41～1.70) mg/L,其中對葉綠素a合成影響最大的是HCO3-。無機碳源是銅綠微囊藻光合作用的重要原料,其明顯影響了葉綠素的合成。在純無機碳條件培養下,隨著初始菌藻比的升高,銅綠微囊藻的葉綠素a質量濃度越高。當外源碳源為葡萄糖時,隨著初始菌藻比的升高,銅綠微囊藻葉綠素a質量濃度越低,其質量濃度從2.72 mg/L降低至1.29 mg/L。在混合碳源條件培養下,初始菌藻比過高也會相對抑制銅綠微囊藻葉綠素a的合成。