獼猴桃細菌性潰瘍病菌的分離鑒定與致病性分析

吳仲秋, 牛向麗, 汪雯靜, 李 璇, 劉駿菲, 鄔杰濤

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

獼猴桃(Actinidiaspp.)是一種多年生落葉藤本果樹隸屬于猴桃科獼猴桃屬[1],因其果實獨特的口感風味和豐富的營養成分而深受消費者喜愛。獼猴桃原產于中國,但其馴化卻始于19世紀末20世紀初獼猴桃種質資源從中國流出后。在20世紀30年代新西蘭馴化開發了綠果美味獼猴桃品種‘海沃德’(A.deliciosa‘Hayward’),并逐漸在世界各地引種。較大規模的商業化生產在20世紀80年代開始興起[2],隨后培育的中華獼猴桃(A.chinensis)‘Hort16A’、黃果品種‘金桃’、紅果品種‘紅陽’也被商業化,在中國、新西蘭及歐亞等地廣泛種植[3]。

在獼猴桃馴化和農業化種植早期,并未報道有嚴重病害。但伴隨單一克隆品種的規?；N植,1984年在日本發現潰瘍病,1989年分離丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae,Psa)[4]。Psa是一種革蘭氏陰性菌,通過氣孔、皮孔、脫落疤痕、修剪切口等自然開口或傷口,可進入所有類型獼猴桃組織,并通過在維管系統中定植而實現系統性傳播,危害獼猴桃的葉、芽、枝干等部位,出現葉斑壞死、枝干腐爛、嫩枝枯死、果斑結痂等潰瘍病癥狀[5-7]。2008—2010年強致病性Psa在不同國家的不同品種獼猴桃種植區快速傳播,導致潰瘍病大爆發,對全球范圍獼猴桃產區造成了持續的經濟損失,也嚴重影響了我國獼猴桃產業的發展[8-10]。

目前,國內外對獼猴桃潰瘍病的研究已取得顯著進展,尤其是在潰瘍病起源和傳播方式、鑒定方法以及各獼猴桃種質資源的感病性等方面[11-16],而對Psa致病基因及其分子機制仍有待深入研究。因此,分離鑒定具有致病性差異的Psa菌株成為探討其病原-宿主植物互作機制的一個重要切入點。

本研究利用采集于四川省(獼猴桃重要產區之一)不同種植區的潰瘍病染病枝條,對Psa病原菌進行分離、鑒定,并通過植物接種對其致病性進行檢測,以獲取更具多樣性的Psa國內菌株,用于后續遺傳差異分析及致病機制研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

獼猴桃種植區的潰瘍病染病枝條采集于四川省都江堰市、雅安市、宜賓市、馬邊彝族自治縣,用于本研究中分離Psa病菌;獼猴桃品種‘紅陽’(Actinidiachinensiscv.‘Hongyang’)、煙草(Nicotianabenthamiana)植株均由本實驗室繁育種植, 用做潰瘍病菌接種植物材料。

FastPfu DNA Polymerase購于北京全式金生物技術有限公司;Silwet L-77、a-萘乙酸、蛋白胨、6-芐氨基嘌呤、氯化鎂、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、無水乙醇、甘油、蔗糖、瓊脂粉、瓊脂糖等,均為國外原裝或國產分析純試劑。

KB(King’s B)培養基:取蛋白胨20.0 g、磷酸氫二鉀1.5 g、硫酸鎂1.5 g、瓊脂15.0 g、甘油10 mL,溶于1 L去離子水中,121 ℃高壓滅菌15 min;MS(Murashige and Skoog)培養基:取MS粉4.43 g、蔗糖20 g、瓊脂6 g,溶于1 L去離子水中,調節pH值至5.8;獼猴桃組培苗繼代培養基:取1 L MS培養基,高溫高壓滅菌后,冷卻至55 ℃左右加入1 mg/mL 6-芐氨基嘌呤溶液1 mL、1 mg/mL a-萘乙酸溶液300 μL,分裝于組織培養瓶備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 獼猴桃潰瘍病菌的分離純化與鑒定

將有明顯潰瘍病癥狀的獼猴桃采集枝條進行韌皮部取樣,加入無菌水充分研磨,取上清,涂布于KB培養基,28 ℃培養36～48 h。選取具有丁香假單胞菌形態的細菌單菌落,進行多次KB平板劃線培養,并將所獲得的純化菌落與已鑒定的Psa菌株(ScMcH、ScPzH)[17]進行形態學比較。

利用已報道的Psa病原菌特異引物[18]Psa-F1(TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT)、Psa-R2(CACGCACCCTTCAATCAGGATG),對純化菌株進行菌落聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)。

分別對所擴增16S-23S DNA片段進行測序,然后將測序序列在美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數據庫進行比對。

1.2.2 ‘紅陽’ 獼猴桃組織培養

取獼猴桃嫩莖為外植體材料,無菌處理后,將外植體置于MS培養基中生長,獲得無菌苗。每隔約20 d進行1次繼代培養,獲得獼猴桃組培苗。組培室培養條件如下:溫度為22 ℃,光照為3 500 lux,12 h光照/12 h黑暗。

1.2.3 潰瘍病菌致病性檢測

將分離純化的Psa菌株劃線于KB培養基,28 ℃培養36～48 h,以10 mmol/L MgCl2溶液分別稀釋成2×1010CFU(colony forming units)的細菌懸浮液,向其中添加Silwet L-77(體積分數為0.025%)。取長勢健康的獼猴桃組培苗浸沒于上述細菌懸浮液中3 min[19],取出獼猴桃組培苗,于培養基中培養10～12 d,觀察發病情況。以10 mmol/L MgCl2溶液平行處理的組培苗為負對照,實驗獨立重復3次,每個菌株侵染3～5株獼猴桃組培幼苗。

在侵染1 d后取出獼猴桃組培苗,進行拍照和菌落計數。按植株質量加入相應體積10 mmol/L MgCl2溶液,充分研磨,吸取上清液。將上清液以10 mmol/L MgCl2溶液進行梯度稀釋。取稀釋后菌液5 μL涂布于KB培養基表面,28 ℃培養36～48 h,進行平板菌落計數。實驗獨立重復3次,計數結果利用SPSS軟件進行統計學分析。

1.2.4 煙草葉片超敏反應

將KB培養基活化的Psa菌株以10 mmol/L MgCl2溶液分別稀釋為1×107、5×108CFU的細菌懸液。以無針頭的1 mL無菌注射器將Psa菌液進行煙草葉片注射,并以MgCl2為負對照,對Psa菌株在煙草葉片中的超敏反應進行觀察和拍照記錄。實驗獨立重復3次,每個菌株注射3個煙草葉片。

2 結果分析

2.1 獼猴桃潰瘍病菌分離分析

利用不同采集點獲得的具有潰瘍病癥的獼猴桃枝條,按1.2.1所述實驗方法進行病原分離。經多次劃線純化,初步獲得了6個具有Psa形態特征的菌株。按照采樣地點及樣品植株品種,將所分離菌株分別命名為ScDjyH2、ScDjyH3(分離于四川都江堰種植區‘紅陽’獼猴桃30°99′N,103°65′E)、ScMbJ1(分離于四川馬邊彝族自治縣種植區‘金桃’獼猴桃 29°01′N,103°48′E)、ScYaH2(分離于四川雅安市種植區‘紅陽’獼猴桃30°15′N,102°95′E)、ScYbH1 (分離于四川宜賓市種植區‘紅陽’獼猴桃 28°76′N,104°40′E)、ScYbH2(分離于四川宜賓市種植區‘紅陽’獼猴桃 28°75′N,104°64′E)。

純化菌株在KB培養基上生長時,呈現為白色、圓形、光滑、微凸起、半透明狀菌落,與已測序鑒定的Psa菌株ScMcH[17]具有相同形態學特征,如圖1所示。圖1中:左側為Psa菌株ScDjyH2;右側為Psa菌株ScMcH。

圖1 分離菌株在KB培養基生長形態

2.2 分離菌株的PCR鑒定

利用Psa病原菌特異引物Psa-F1、Psa-R2,分別以6個分離菌株的單克隆培養菌液為模板,進行PCR鑒定,結果如圖2所示。圖2中:M為DNA marker;1～6依次為ScYbH1、ScYbH2、ScMbJ1、ScDjyH2、ScDjyH3、ScYaH2菌落擴增產物;+為正對照,ScMcH菌落擴增產物;-為負對照,未加入Psa的擴增產物。

圖2 分離菌株的PCR鑒定

從圖2可以看出,6個分離菌株均顯現陽性擴增片段(約280 bp),片段大小與對照菌株ScMcH相同,而未加入Psa菌液的負對照則未顯示擴增條帶。

進一步將各分離菌株的PCR擴增產物進行測序,并將所測定序列在NCBI數據庫進行Blast比對。結果表明,所分離菌株的序列片段均與已登錄Psa菌株具有最高相似性。其中ScDjyH2菌株PCR擴增測序片段的Blast比對結果如圖3所示。

圖3 ScDjyH2菌株PCR擴增測序片段的Blast比對

本文所分離的ScDjyH2與已報道的Psa菌株FJ29(中國科學院植物病理學研究室福建省農業科學院植物保護重點實驗室分離)的16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer序列完全一致。通過分子鑒定可知,所分離6個菌株為丁香假單胞菌獼猴桃致病變種。

2.3 Psa菌株對獼猴桃的致病性檢測分析

為檢測本實驗所分離Psa菌株對宿主獼猴桃的致病能力,分別將6個菌株按1.2.3所述方法制備懸浮菌液后,進行‘紅陽’獼猴桃組培幼苗的侵染。約10 d后,ScYbH2侵染的幼苗出現大面積褐色病斑,部分葉片從莖上脫落;ScDjyH2、ScYbH1侵染植株也顯現感染癥狀,葉片有明顯病斑;而ScMbJ1、ScDjyH3、ScYaH2侵染獼猴桃與MgCl2溶液處理的對照植株整體表型相似,無明顯感染,僅在ScMbJ1侵染植株部分葉片出現小病斑,如圖4所示。

圖4 Psa菌株侵染‘紅陽’獼猴桃組培10 d幼苗

進一步將侵染處理10 d的獼猴桃植株按1.2.3所述方法進行組織取樣、研磨及菌落計數,結果如圖5所示。

1.MgCl2 2.ScDjyH2 3.ScDjyH3 4.ScMbJ1 5.ScYaH2 6.ScYbH1 7.ScYbH2

從圖5可以看出:MgCl2溶液處理植株中未有Psa菌落生長;顯示明顯病癥的ScYbH2、ScDjyH2、ScYbH1侵染植株組織中的Psa菌落數分別為188×104、79×104、63×104CFU/g;ScMbJ1接種植株中Psa菌落數平均值為23×104CFU,而ScDjyH3、ScYaH2接種獼猴桃體內僅檢測到很少量病原菌,與對照處理植株無顯著性差異。圖5中,不同字母表示有顯著差異(P<0.05)。

由Psa菌株侵染接種后植株癥狀及菌落計數結果可知,本實驗所分離菌株對宿主獼猴桃顯示不同的致病性,其中:ScYbH2、ScDjyH2、ScYbH1具有較強致病性,其致病能力從大到小依次為ScYbH2、ScDjyH2、ScYbH1,后兩者致病能力相差不大;ScDjyH3和ScYaH2則為弱致病菌株;ScMbJ1可使侵染植株體內有一定數目的病原菌增殖,具有一定致病性,雖與ScDjyH3和ScYaH2無統計學差異,但仍顯現與兩者不同。

2.4 Psa菌株的煙草葉片超敏反應

基于病原菌侵染細胞時所釋放毒性效應蛋白對植物免疫系統的激活作用,利用煙草葉片系統可以快速檢測植物對丁香假單胞病原菌的防御反應[20]。因此,除了如上述接種侵染宿主植物獼猴桃,還可通過將Psa菌液在煙草葉片中進行注射,進一步檢測其免疫超敏反應激活能力。

將6個Psa分離菌株、2個對照菌株ScMcH、ScPzH以及MgCl2對照分別制備溶液,在同一煙草葉片上進行注射,觀察注射部位植物組織的超敏反應,如圖6所示。

1.MgCl2 2.ScPzH 3.ScDjyH3 4.ScYaH2 5.ScYbH2 6.ScDjyH2 7.ScMbJ1 8.ScYbH1 9.ScMcH

從圖6可以看出,當注射Psa菌液(1×107CFU) 24 h后,開始在部分菌株的注射部位出現葉片組織壞死,至72 h時,注射接種ScYbH2、ScDjyH2、ScMbJ1的葉片區域顯現細胞壞死超敏反應,但ScYbH1、ScDjyH3、ScYaH2未激活超敏反應。當注射菌液菌落數升至5×108CFU,ScYbH1也在72 h出現注射區域細胞壞死,而ScDjyH3、ScYaH2即使在高濃度長反應時間仍未能激活煙草葉片免疫超敏反應。

煙草免疫系統的激活反應狀態與病原菌的致病性有一定關聯,提示丁香假單胞病原菌是否向感染細胞釋放植物可識別的毒性致病因子,從而導致植物激活免疫系統,誘導感染部分細胞壞死超敏反應,限制病原菌的定植與傳播。檢測結果表明,本實驗所分離Psa菌株具有不同的超敏反應激活能力。同時,注射于同一葉片的對照菌株ScPzH、ScMcH分別顯示未激活、激活超敏反應表型[17],MgCl2對照注射處理部位也無超敏反應發生,標示煙草葉片免疫超敏反應的穩定性和靈敏性。

3 討 論

獼猴桃是一種重要的新興經濟作物,由于果實品質優異,隨市場需求其種植面積和產量也在不斷增加。目前,全世界每年生產(150～160)×104t獼猴桃,其中中國、新西蘭和意大利占全球獼猴桃產量的90%[21-22]。我國是獼猴桃屬植物的起源分布中心,野生資源豐富,具有獨特的育種和栽培優勢,也逐漸成為世界主要獼猴桃種植區[3]。但近年來,由Psa導致的潰瘍病害已成為世界范圍獼猴桃產業發展的主要威脅[23-24],尤其是近期田間新分離Psa菌株已顯示對防治潰瘍病最常用的銅殺菌劑、鏈霉素產生抗性,迫切需要研發基于致病機制的新的防治措施。

本文利用不同種植區染病獼猴桃進行Psa病原菌分離純化與鑒定,獲得了6個新的菌株。雖然形態學特征一致,但這些菌株顯示了不同的致病能力。在致病性檢測中選用中華獼猴桃紅果品種‘紅陽’的組培幼苗,‘紅陽’是我國近年培育的優良紅肉品種,但它對潰瘍病菌不具抗性。利用幼苗浸泡進行病原接種,操作便捷,并可在較短時間內觀察到染病癥狀,適用于Psa致病性或獼猴桃種質抗性的快速檢測。獼猴桃為雌雄異株植物,利用雜交種子獲取幼苗時可能會由于授粉雄株不同而導致實生苗遺傳背景差異。通過組織培養營養繁殖則可保證實驗植物材料的遺傳一致性,且組培苗的無菌培養特性,也可避免病原接種實驗中其他細菌或真菌的干擾。

在對本文所分離Psa菌株的檢測中,ScYbH2、ScDjyH2、ScYbH1顯示較強致病性,ScMbJ1具有一定的植株體內增殖能力,而ScDjyH3和ScYaH2則為弱致病菌株。在國外分離的2個弱致病菌株,發現其可能由于丁香假單胞菌Ⅲ型分泌系統調控基因hrpR/hrpS的插入突變,抑制了毒性效應蛋白的表達[25]。本課題組前期在我國獼猴桃種植區鑒定了另一獨立突變事件:在hrpR基因內插入1 662 bp 的DNA移動元件,可使其讀碼框提前終止于插入序列中的終止密碼,從而影響病原菌致病力[17]。在本文中,新分離菌株在宿主獼猴桃致病性、煙草免疫超敏反應中的多程度差異表型,提示Psa在快速傳播中進化形成了豐富的遺傳多樣性。其中,分離于都江堰、雅安兩地的ScDjyH3、ScYaH2菌株不具有明顯的獼猴桃致病性,也不能激活煙草超敏反應;分離于馬邊彝族自治縣的ScMbJ1顯示較弱的獼猴桃致病力,但可在低濃度條件下激活煙草超敏反應;而ScYbH1具有較強獼猴桃致病性,但卻在較高濃度下才激活煙草超敏反應。這些田間來源不同、表型多樣的變異株將為后續潰瘍病菌致病基因及其機制研究提供重要基礎。