白玉菇多糖理化性質及免疫活性研究

唐方媛, 張婭娣, 劉 詠, 王軍輝,3

(1.合肥工業大學 農產品生物化工教育部工程研究中心,安徽 合肥 230601; 2.合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601; 3.合肥工業大學 安徽省農產品精深加工重點實驗室,安徽 合肥 230601)

0 引 言

食用菌指子實體碩大、可供食用的大型真菌[1],因獨特的風味、營養及保健功能受到研究人員的廣泛關注。多糖是真菌發揮生理活性的重要活性物質[2],是細胞壁的組成、能量儲備的細胞內包涵體和細胞外用于保護細胞的附著物[3],在增強免疫、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等方面具有顯著的藥理學功效[4-7]。多糖作為天然免疫調節劑,通過激活補體系統和免疫細胞,促進多種細胞因子的釋放從而誘導免疫調節活性[8],成為功能食品和藥物領域的研究熱點。巨噬細胞是參與機體免疫的一種重要效應細胞,在先天性和適應性免疫反應中可發揮吞噬、呈遞抗原和分泌細胞因子等作用[9]。

白玉菇又名白玉蕈(whiteHypsizygusmarmoreus),屬擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬,是真姬菇的一種穩定白色變異體菌株[10]。其色澤剔透,口感優越,深受消費者青睞。白玉菇富含多種維生素和礦物質,多糖質量分數達7.50%,高于其他食藥用菌(如香菇、猴頭菇、竹蓀、金耳、豬苓等),是一種高蛋白、低脂肪的功能性食品[11]。研究表明,具有較好生物活性的真菌提取物大多來自擔子菌綱和子囊菌綱[12]。因此,對白玉菇多糖進行生物活性的研究具有重要意義。

本文對白玉菇子實體多糖進行多層次提取,在分離純化的基礎上通過藥理學模型,研究白玉菇多糖對巨噬細胞增殖、吞噬能力和NO釋放量的影響,評價其對機體的免疫活性,篩選出較優的活性組分,為深入研究白玉菇多糖免疫調節機制以及開發多糖資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白玉菇子實體購于安徽省合肥市某大型市場;無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、三氟乙酸、硼氫化鈉、氯仿等均為分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司;DEAE-Cellulose購于索萊寶科技有限公司;DMEM培養基、脂多糖、胎牛血清購于Hyclone公司;NO檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司);旋轉蒸發儀(上海申勝生物技術有限公司);冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司);氣相色譜儀(Agilent公司);CO2培養箱(日本三洋電機株式會社)。

1.3 白玉菇多糖的提取

新鮮白玉菇子實體經冷凍干燥后,使用高速藥品粉碎機粉碎,過200目篩后置于索氏提取器中在90 ℃無水乙醇脫色脫脂24 h,烘干備用。

白玉菇粉末以1∶20的料液比在0.9%氯化鈉溶液常溫提取12 h,重復提取3次。提取液離心去除不溶物,上清液濃縮后用Sevag試劑脫蛋白,重復數次后取分液漏斗上層溶液減壓蒸餾,除去有機溶液。濃縮液用30% H2O2脫色后于流水和去離子水中分別透析3 d,透析液凍融離心后冷凍干燥得到白玉菇常溫水提多糖(WHN)。

常溫提取殘渣以1∶20的料液比在0.9%氯化鈉溶液100 ℃提取2 h,離心除去不溶物,重復提取2次。上清液經濃縮、脫蛋白、脫色、透析和凍融后冷凍干燥得到白玉菇沸水浸提多糖(WHB)。

稱取120 mg白玉菇多糖溶解于10 mL去離子水中,離心后用移液管將上清液緩慢滴加到預裝完成的DEAE-Cellulose陰離子交換層析柱(3.0 cm×40 cm)中,依次用不同濃度的氯化鈉溶液(0、0.1、0.2 mol/L)逐步洗脫,流速2 mL/min。自動收集洗脫液(10 mL/管),并通過苯酚-硫酸法測定多糖質量分數。收集多糖質量分數高的峰,凍干得到純化多糖。

1.4 白玉菇多糖的理化性質測定

總糖質量分數采用苯酚-硫酸法[13]測定其在490 nm處的吸光度,以葡萄糖為標準品,根據建立的標準曲線計算樣品中總糖質量分數。

蛋白質質量分數采用考馬斯亮藍法[14]測定其在595 nm處的吸光度,以牛血清白蛋白為標準品,根據標準曲線計算樣品中蛋白質質量分數。

糖醛酸質量分數采用間羥基聯苯法[15]測定其在520 nm處的吸光度,以半乳糖醛酸作為標準品,根據標準曲線計算樣品中糖醛酸質量分數。

根據文獻[13]的方法稍作修改進行單糖組成分析。取5 mg待測樣品置于安瓿管中,加入三氟乙酸110 ℃水解4 h后,減壓蒸干。將完全水解后的樣品在NaBH4水溶液中還原3 h,25%的醋酸溶液中和后減壓蒸干,于115 ℃烘箱中干燥20 min。加入等體積的乙酸酐和吡啶,在密封條件下100 ℃反應1 h。減壓蒸干至有粉末物質出現,加入適量的氯仿和去離子水,萃取至水層澄清。用無水硫酸鈉除去有機相中水分,過有機濾膜(孔徑為0.22 μm)后將樣品溶液裝入瓶中于氣相色譜儀中進行檢測。根據標準品的出峰時間判定多糖中的單糖成分,以峰面積計算單糖的摩爾分數。

1.5 多糖的免疫活性研究

小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞于DMEM培養基(含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)中,37 ℃和5% CO2培養箱條件下培養。

采用MTT法測定白玉菇多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7的增殖活性的影響。用DMEM培養液將對數生長期細胞密度稀釋至1.0×105個/mL,等量接種150 μL于96孔板中,孵育24 h。加入50 μL不同質量濃度的多糖溶液(終質量濃度為0、50、100、200、500 μg/mL),繼續培養24 h后分別加入20 μL MTT試劑(5 mg/mL),繼續培養4 h。吸除孔板中的液體,快速加入200 μL DMSO,室溫振蕩10 min,使用酶標儀在570 nm處測定吸光度?？瞻讓φ战M為DMEM培養基,陽性對照組為脂多糖LPS。增值指數計算公式如下:

增值指數=A1/A0,

其中:A1為樣品在570 nm處的吸光度;A0為空白對照在570 nm處的吸光度。

通過NO檢測試劑盒測定白玉菇多糖對 LPS 誘導的RAW264.7細胞中NO產生的影響。按照上述方法培養48 h后,吸取100 μL培養液于新板中,加入Griess試劑,靜置10 min;酶標儀540 nm處測定吸光度?？瞻讓φ战M為DMEM培養基,陽性對照組為LPS。根據標準品NaNO2繪制的標準曲線計算NO釋放量。

按照上述方法培養48 h后移除培養液,PBS清洗2次,加入100 μL中性紅溶液,培養4 h后移除多余溶液;PBS清洗2次,加入細胞裂解液,室溫放置1 h;酶標儀540 nm下測量吸光度?？瞻讓φ战M為DMEM培養基,陽性對照組為LPS。

1.6 數據處理

實驗至少重復3次,實驗數據以(平均值 ± 標準差)形式表示。采用Origin 8.0軟件繪制圖表,利用SPSS 21.0軟件進行數據統計學處理,使用t檢驗法進行數據比較。*表示P<0.05差異顯著,**表示P<0.01差異極顯著。

2 結果分析

2.1 白玉菇多糖的分離純化

白玉菇子實體粉末經脫色脫脂后,常溫提取液濃縮、脫蛋白、脫色、透析后得到多糖WHN。常溫提取殘渣經沸水浸提、離心、濃縮、脫蛋白、脫色、透析后得到多糖WHB。WHN和WHB分別通過DEAE-Cellulose 離子交換層析柱進行分離純化,如圖1所示。經0、0.1、0.2 mol/L NaCl溶液洗脫后共獲得6個洗脫片段,濃縮、透析和冷凍干燥后,分別命名為WHN1、WHN2、WHN3、WHB1、WHB2、WHB3。

圖1 DEAE-Cellulose離子交換層析柱洗脫曲線

2.2 白玉菇多糖化學組成分析

各組分的單糖組成及其成分分析結果見表1所列。從表1可以看出,WHN和WHB的總糖質量分數分別為67.72%、80.54%,蛋白質質量分數分別為28.65%、15.63%,糖醛酸質量分數分別為2.13%、0.41%。隨著提取溫度的增加,更有益于多糖的溶出。2種粗多糖經分離純化后得到6種組分,總糖質量分數為93.48%～98.77%,同時蛋白質、糖醛酸得到有效洗脫,質量分數較小。

表1 白玉菇粗多糖和分級組分的理化性質分析 %

單糖組成分析結果顯示2種粗多糖均為含有6種單糖的雜多糖。WHN中半乳糖的摩爾分數最大,達到49.8%。WHB的單糖組成以葡萄糖為主,摩爾分數為79.8%。組分間差異可能是由于WHN是在溫和條件下提取到的胞外多糖,WHB為劇烈條件下提取到的不同部位多糖。常溫水提多糖WHN的半乳糖隨著DEAE-Cellulose 離子交換層析柱的洗脫逐漸減少,WHN1、WHN2、WHN3中半乳糖的摩爾分數分別為39.4%、35.6%、26.5%,同時各組分間葡萄糖的摩爾分數增加到34.3%、25.8%、25.4%。WHB的各分級組分的單糖組成以葡萄糖為主,摩爾分數分別為78.5%、90.8%、100.0%。結果顯示WHB3為葡聚糖,WHB1和WHB2為含有葡萄糖和少量的甘露糖、半乳糖或阿拉伯糖的雜多糖。比較8種多糖組分發現,單糖組成差異可能與提取溫度及純化方法有關。

2.3 白玉菇多糖的免疫活性分析

多糖WHN及其3種分級組分對多巨噬細胞增殖活性的影響如圖2a所示。從圖2a可以看出:在實驗質量濃度范圍內,與空白對照組相比,WHN及其3種分級組分對RAW264.7細胞均無毒性,表現為促進細胞增殖且增殖指數隨多糖質量濃度的增大呈劑量依賴性減小;WHN1、WHN2、WHN3在實驗質量濃度范圍內極顯著地提高了細胞增殖指數(P<0.01),20 μg/mL處理時增殖指數最大,分別達到1.48、1.25、1.27,3種分離組分對細胞增殖活性的促進作用均高于WHN,其中WHN1最優。

圖2 白玉菇多糖對巨噬細胞增殖活性的影響

WHB及其3種分級組分對巨噬細胞增殖活性的影響如圖2b所示。從圖2b可以看出,在實驗質量濃度范圍內,與空白對照組相比,4種組分對RAW264.7無細胞毒性,均顯著促進細胞增殖(P<0.01)。其中,WHB在質量濃度為100 μg/mL時增殖指數達到最大值1.50。WHB1處理的細胞增殖活性隨著多糖質量濃度的增大呈劑量依賴性減小,20 μg/mL處理時增殖指數最大為1.32。50 μg/mL WHB2和WHB3處理時細胞增殖指數最大,分別為1.37和1.53,其中WHB3在實驗質量濃度范圍內表現出最佳的增殖活性。比較8種多糖片段,多糖對細胞增殖活性的影響可能與葡萄糖的摩爾分數有關。

研究表明,巨噬細胞的吞噬作用在免疫反應中起重要作用,是免疫反應中的第1個關鍵步驟[16]。8種多糖組分對RAW264.7細胞吞噬作用的影響如圖3所示。從圖3a可以看出,WHN及其分級組分均在不同程度上刺激提升了巨噬細胞RAW264.7的吞噬能力。在多糖質量濃度為20～50 μg/mL,與空白對照相比,WHN和WHN3極顯著地促進細胞吞噬作用(P<0.01)。在實驗質量濃度范圍內,WHN1促進巨噬細胞RAW264.7吞噬的活性隨著質量濃度的增加而減小,20 μg/mL時,吞噬能力最佳,與空白對照組相比,差異極顯著(P<0.01)。結果表明,WHN1在各質量濃度下促進巨噬細胞RAW264.7吞噬作用的活性優于其他2種組分。

圖3 白玉菇多糖對巨噬細胞吞噬活性的影響

從圖3b可以看出,隨著多糖WHB質量濃度的增加,細胞吞噬作用增強,在質量濃度為200 μg/mL時,巨噬細胞RAW264.7的吞噬活性顯著提高(P<0.01),質量濃度超過200 μg/mL后,吞噬活性隨之減小。WHB1對吞噬作用的促進作用隨著多糖質量濃度的增加先增大后減小,在50 μg/mL時,吞噬活性達到最大,差異極顯著(P<0.01);WHB2對巨噬細胞RAW264.7吞噬能力的促進作用與WHB有相似的趨勢,在多糖質量濃度為200 μg/mL時,細胞吞噬能力最佳,與空白對照組相比,顯示出極顯著差異(P<0.01)。WHB3對RAW264.7細胞吞噬能力的作用隨著多糖質量濃度的增加顯示出劑量依賴性減弱,20 μg/mL時,吞噬活性達到最大2.40,與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)。在實驗范圍的各質量濃度下,WHB3的吞噬活性優于其他組分。

NO是巨噬細胞攻擊異物時釋放的主要活性氧(reactive oxide species,ROS)之一[17]。8種組分對巨噬細胞NO釋放量的影響如圖4所示。從圖4a可以看出,在實驗質量濃度范圍內,實驗組與空白對照組相比均表現為促進NO產生。其中水提組分WHN、WHN2、WHN3對NO釋放量的影響隨著多糖質量濃度的增大呈劑量依賴性增大,質量濃度為500 μg/mL時NO釋放量達到最大值,分別為2.89、4.12、2.16 μmol/L。WHN1刺激RAW264.7細胞釋放的NO釋放量呈先增大后降低的趨勢,在200 μg/mL時達到最大值4.64 μmol/L,促進NO產生效果優于其他組分。

圖4 白玉菇多糖對巨噬細胞NO釋放量的影響

熱水提組分WHB、WHB1、WHB2刺激RAW264.7細胞NO釋放的效果與多糖質量濃度成正比。在各實驗質量濃度下,WHB3刺激RAW264.7細胞釋放NO與空白對照組相比均差異極顯著(P<0.01),與多糖WHB1和WHB2相比,WHN3顯示出最佳的刺激活性,在500 μg/mL時達到最大值4.11 μmol/L。

3 結 論

本文對白玉菇常溫水提多糖WHN和沸水浸提多糖WHB分離純化出6種分級組分WHN1、WHN2、WHN3、WHB1、WHB2、WHB3,并對這8種組分進行理化性質和免疫活性的篩選。6種分級組分總糖質量分數為93.48%～98.77%,高于粗多糖,且蛋白質和糖醛酸的質量分數明顯降低。受提取溫度影響,單糖組成結果顯示8種組分的單糖摩爾分數均不相同,其中WHN及其分級組分是以半乳糖和葡萄糖為主的雜多糖,WHB、WHB1、WHB2是以葡萄糖為主的雜多糖,WHB3為葡聚糖。體外免疫實驗中,各組分對RAW264.7均無細胞毒性,表現為促進細胞增殖和吞噬,其中WHN1和WHB3處理的巨噬細胞表現出優異的免疫調節活性。WHN1在200 μg/L時NO釋放量為4.64 μmol/L,500 μg/L WHN3處理時NO釋放量為4.11 μmol/L,較好的免疫活性可能與高摩爾分數的葡萄糖有關。

研究結果從理化性質和免疫活性2個方面篩選出2種活性較好的白玉菇多糖,為其在藥物和功能性食品的應用提供理論基礎。文獻[1]指出,具有1,3-β-Glc和1,6-β-Glc連接方式的香菇多糖和平菇多糖,通過促進細胞吞噬及上調NO釋放來發揮較好的免疫調節活性,白玉菇多糖結構對免疫發生機制與信號通路調控的關系有待進一步研究。