痛風散對急性痛風性關節炎小鼠模型干預作用的機制研究

★ 張奎 鄧向亮 陳佳 傅南琳（.廣東藥科大學中醫學院 廣州 50006；.南方醫科大學中西醫結合醫院 廣州 5035）

急性痛風性關節炎（acute gouty arthritis，AGA）是一種炎癥相關的關節性疾病，是單鈉尿酸鹽在關節沉積而誘發的關節局部炎性反應，主要表現為患者關節出現紅腫疼痛，甚至部分患者可見關節活動障礙以及并發腎臟損傷［1］。最新研究表明，T 細胞在痛風發病中也發揮重要作用，其中Th1/Th2、Th17/Treg 失衡可能參與了痛風性關節炎的發?。?］。

中醫認為AGA 是濕熱蘊結證，因此采用清熱通絡、祛風除濕的復方治療。例如，國醫大師朱良春的臨床經驗方由土茯苓、萆薢等組成，對AGA有顯著療效［3］。中醫專家根據自身臨床經驗自擬的治療AGA 的方藥，也含土茯苓、萆薢、銀花（或銀花藤）、知母等清熱解毒除濕之藥［4-7］?？梢?，現代中醫名家對AGA 的認識和治療頗為一致，為中醫藥防治痛風的現代研究提供了參考。傅南琳教授采用自擬痛風散治療AGA 療效顯著，該方包括土茯苓30 g，萆薢15 g，澤瀉15 g，赤芍20 g，金銀花30 g，連翹15 g，石膏30 g，知母10 g，生地黃15 g，甘草10 g。全方由清熱解毒、祛風除濕藥物組成，可明顯緩解AGA 患者關節紅腫熱痛的臨床癥狀。為了闡明自擬痛風散治療AGA 的現代藥理機制，進一步促進該方的臨床應用，本研究旨在探討傅教授的經驗效方痛風散對小鼠AGA 的治療作用，并從調節免疫角度探討該方的作用機制。

1 材料與儀器

36 只Balb/c 雄性小鼠，8 周齡，體質量（20±2）g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，合格證號為SCXK（遼）2020-0001。土茯苓（批號19120371）、萆薢（批號20020861）、澤瀉（批號20060181）、赤芍（批號20041241）、金銀花（批號20040571）、連翹（批號20031181）、石膏（批號20041701）、知母（批號20010751）、生地黃（批號19122641）、甘草（批號20041501）均為顆粒劑，由廣東一方制藥有限公司提供；氧嗪酸鉀（potassium oxonate，PO，上海麥克林公司批號C10976408）；尿酸鈉（南通宇飛生物科技有限公司批號FY28362R1116）；秋水仙堿（西雙版納藥業有限責任公司批號20010）；尿酸（UA）試劑盒（批號20190927）、谷草轉氨酶（AST）測試盒（批號20190928）、谷丙轉氨酶（ALT）測試盒（批號20191008）、肌酐（CRE）測定試劑盒（批號20191008）、尿素氮（BUN）測試盒（批號20190927）由南京建成生物工程研究所提供。

主要儀器包括BDFACSCanto Ⅱ流式細胞儀（美國BD 公司）；EL×800 全自動酶標儀（美國BioTek 公司）；GFL-230 烤箱（天津市萊玻瑞儀器設備有限公司）；JJ-12J 脫水機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016 病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；JB-P5 包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；KD-P 組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；JB-L5 凍臺（武漢俊杰電子有限公司）。

2 實驗方法

2.1 動物模型復制、分組及給藥方法

采用隨機數表法，將 36 只Balb/c 雄性小鼠分為6 組，即空白對照組、模型組、秋水仙堿陽性藥組、痛風散低劑量組、痛風散中劑量組、痛風散高劑量組。

將Balb/c 雄性小鼠飼養于SPF 級環境中，明暗周期12 h/12 h，溫度保持在（23±1.5）℃，相對濕度為（45±15）%，以保證小鼠處在舒適的環境中。用標準飼料將小鼠適應性飼養1 周后，腹腔注射PO 溶液及踝關節腔注射尿酸鈉晶體混懸液進行AGA 造模［8］。每只小鼠每日腹腔注射0.25 g/kg 的PO 溶液，連續15 d，第9 d 后每隔2 d 在小鼠右踝關節腔配合注射1 次50 μL 濃度為25 mg/mL 的尿酸鈉晶體混懸液［9］。在踝關節注射尿酸鈉晶體混懸液后，小鼠關節出現明顯腫脹，液體未完全吸收，表明造模成功。因PO 與尿酸鈉難溶于水，采用0.5%CMC-Na 進行助溶配制，尿酸鈉晶體混懸液則用生理鹽水及吐溫80（9∶1）配制。

按照體表面積法將正常成人用藥量換算成痛風散中劑量，痛風散高劑量設定為中劑量的2 倍量，痛風散低劑量則設定為中劑量的1/2 倍量。每天造模完成后，GPLDG、GPMDG、GPHDG 小鼠分別灌胃12.35、24.70、49.40 g/（kg·d）劑量的痛風散溶液，連續15 d，CG 及MG 小鼠給予藥物等量的蒸餾水，CPDG 小鼠灌胃0.40 mg/kg 劑量的秋水仙堿溶液。第16 天處死小鼠，取血檢測相關指標。

2.2 檢測指標與方法

2.2.1 腫脹度測定 第16 天用游標卡尺測量小鼠雙踝關節的最大直徑并計算關節腫脹度，每組重復測量3 次，并求取平均值。踝關節腫脹度=（小鼠右踝關節周徑-左踝關節周徑）/左踝關節周徑。

2.2.2 踝關節組織學觀察 對小鼠踝關節進行組織學觀察（HE 染色法），首先剪取踝關節，用10%福爾馬林溶液固定72 h，然后經脫鈣處理，再制備石蠟切片，最后按HE 染色試劑盒使用說明書進行染色、封片。在光學顯微鏡下觀察經HE 染色的組織，主要是觀察踝關節滑膜上皮細胞結構和炎癥細胞浸潤數量。

2.2.3 血清代謝指標檢測 第16 天早上摘除小鼠眼球取血，全血立即放入離心機中，常規分離血清。分別取各只小鼠的血清，測定血清中尿酸（UA）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、肌酐（CRE）及尿素氮（BUN）的水平。

2.2.4 免疫組化指標檢測 取每只實驗小鼠右踝關節組織，放入10%福爾馬林溶液中固定72 h，經脫鈣、包埋、切片后做踝關節免疫組化指標檢測。嚴格按照試劑盒說明書，對得到的切片依次進行石蠟切片脫蠟至水、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉、加一抗、加二抗、DAB 顯色、復染細胞核、脫水封片、顯微鏡鏡檢的操作，檢測踝關節組織內IL-6、IL-17A、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β、TNF-α、EMR1 的表達。采集圖像，采用Image J 測量法進行量化分析［10-11］，通過測量出每張圖片的累積光密度以及陽性表達的范圍大小，計算出平均光密度，即可反映圖片中目標蛋白的單位面積濃度，平均光密度越高則說明陽性表達越顯著。最后對各組小鼠踝關節免疫組化的結果進行分析比較。

2.2.5 流式細胞術檢測Treg 細胞 取小鼠外周血，利用紅細胞裂解液處理后（樣品經過破除紅細胞、離心洗滌）得到淋巴細胞懸液。取淋巴細胞懸液，按照Treg 細胞流式檢測試劑盒說明書對細胞進行標記，用于標記的流式抗體包括熒光標記的CD3、CD4 和CD25 單抗，最后采用流式細胞術檢測CD3+CD4+CD25+Treg 比例。

2.3 統計學方法

實驗結果使用GraphPad prime 8 軟件進行處理分析，各組數據以平均值±標準差（）表示。2 組間數據采用t檢驗，多組間數據采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 一般狀態比較

造模前各組小鼠的毛發有光澤、精神狀態良好、攝食攝水正常，體重增加，造模干預后模型組各組小鼠毛發變黃，攝食量減少，不喜動。

3.2 腫脹度比較

實驗結果顯示，造模后無論是模型組還是秋水仙堿組或痛風散低、中、高劑量組小鼠踝關節腫脹度明顯高于空白對照組（P＜0.01）。痛風散低、中、高3 個劑量組以及秋水仙堿組小鼠的踝關節腫脹度均比模型組的低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組小鼠造模踝關節的腫脹度

3.3 踝關節組織病理比較

模型組小鼠造模后踝關節HE 染色結果出現異常，包括組織腫脹、滑膜增生、局部浸潤的炎性細胞增加。秋水仙堿組與模型組比較，滑膜增生情況得到改善，局部的炎性細胞數量也減少。痛風散低、中、高劑量組小鼠踝關節局部的炎性細胞數量和滑膜增生情況也較模型組有所改善，其中痛風散中、高劑量組的組織病理改善最為明顯。見圖2。

圖2 各組小鼠踝關節組織病理（HE×200）

3.4 血清相關指標比較

3.4.1 血清尿酸含量比較 實驗結果顯示，模型組小鼠經造模后血清尿酸水平明顯高于空白對照組（P＜0.01）。秋水仙堿組小鼠的血尿酸水平與模型組比較差異無統計學意義。痛風散低、中劑量組小鼠的血尿酸水平與模型組比較有所降低，其中痛風散低劑量組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 痛風散對急性痛風性關節炎小鼠血尿酸水平的影響（，n=3）

表1 痛風散對急性痛風性關節炎小鼠血尿酸水平的影響（，n=3）

注：與空白對照組比較，#P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05。

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3.4.2 血清肌酐、尿素氮含量比較 造模后無論是模型組還是秋水仙堿組小鼠，肌酐、尿素氮含量與空白對照組相比均明顯升高（P＜0.01）。秋水仙堿組小鼠血清中肌酐和尿素氮含量與模型組比較無明顯變化。但是痛風散的低、中、高劑量組小鼠的肌酐和尿素氮含量都低于模型組且都有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 痛風散對急性痛風性關節炎小鼠肌酐和尿素氮的影響（，n=6）

表2 痛風散對急性痛風性關節炎小鼠肌酐和尿素氮的影響（，n=6）

注：與空白對照組比較，#P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01。

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3.4.3 血清AST 和ALT 含量比較 造模后模型組小鼠血清AST 和ALT 含量均高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。秋水仙堿組小鼠血清AST 和ALT 含量均低于模型組，其中2 組小鼠ALT 含量的差異有統計學意義（P＜0.05）。痛風散低、中、高劑量組小鼠血清中AST 和ALT 含量與模型組比較都有不同程度的降低（P＜0.01），尤其是ALT 含量。見表3。

表3 痛風散對急性痛風性關節炎小鼠血清AST和ALT的影響（，n=6）

表3 痛風散對急性痛風性關節炎小鼠血清AST和ALT的影響（，n=6）

注：與空白對照組比較，#P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.5 免疫組化指標比較

模型組與空白對照組比較，IL-17A 呈上升趨勢，秋水仙堿組、痛風散低、中、高劑量組與模型組比較IL-17A 有下降趨勢，具有顯著性差異。模型組與空白對照組比較，IL-6、IFN-γ 呈上升趨勢，秋水仙堿、痛風散低、中、高劑量組與模型組比較，IL-6、IFN-γ 有下降趨勢，但沒有顯著性差異。模型組與空白對照組比較，TNF-α 呈上升趨勢，秋水仙堿組、痛風散低、中劑量組與模型組比較，有下降趨勢，但沒有顯著性差異，痛風散高劑量組與模型組比較，TNF-α 有下降趨勢，具有顯著性差異。模型組與空白對照組比較，EMR1呈上升趨勢，秋水仙堿組、痛風散高劑量與模型組比較，EMR1 有下降趨勢，但沒有顯著性差異，痛風散低、中劑量組與模型組比較，EMR1 無明顯變化。模型組與空白組比較，IL-4 沒有變化，秋水仙堿組、痛風散低、中、高劑量組與模型組比較，IL-4 無明顯變化。模型組與空白對照組比較，IL-10 呈上升趨勢，秋水仙堿組、痛風散低、中劑量組與模型組比較，IL-10 無明顯變化，痛風散高劑量組與模型組比較，IL-10 有下降趨勢，但沒有顯著性差異。模型組與空白對照組比較，TGF-β呈上升趨勢，秋水仙堿組與模型組比較，TGF-β有下降趨勢，具有顯著性差異，痛風散低、中、高劑量組與模型組比較，TGF-β 無明顯變化。見圖3、圖4、圖5。

圖3 小鼠踝關節IL-6、IL-17A、IFN-γ、TNF-α的表達量

圖4 小鼠踝關節IL-4、IL-10、TGF-β、EMR1的表達量

圖5 小鼠踝關節的相關炎癥因子表達量分析

3.6 Treg 細胞

為了探明痛風小鼠血液細胞 CD3+CD4+CD25+Treg 細胞的變化情況，對其采用流式細胞技術進行了檢測。經造模后，模型組小鼠血液細胞中CD3+CD4+CD25+Treg 細胞的比例明顯高于正常對照組（P＜0.01）。而秋水仙堿組、痛風散各劑量組小鼠的Treg 細胞比例與模型組比較均有不同程度的升高，其中秋水仙堿組、痛風散低劑量組、痛風散中劑量組與模型組比較差異都有統計學意義（P＜0.01）。見圖6、圖7。

圖6 流式細胞術檢測的各組CD3+CD4+CD25+的表達

4 討論

經驗方痛風散療效顯著且不良反應少，但作用機制尚不清楚。本實驗采用尿酸鈉混懸液踝關節注射配合腹腔注射氧嗪酸鉀溶液，進行急性痛風性關節炎模型造模，然后用痛風散干預，通過觀察各組小鼠的一般情況、造模踝關節的腫脹度、踝關節組織病理情況、小鼠血清相關生化指標的變化、踝關節免疫組化指標的檢測、小鼠血液Treg 細胞的流式檢測，探究經驗方痛風散治療痛風的療效及可能作用機制。

現代醫學普遍認為，高尿酸血癥和痛風性關節炎屬于痛風疾病的不同階段，高尿酸血癥是痛風性關節炎的前期病理過程，痛風性關節炎患者伴有血尿酸的升高，是尿酸沉積的結果。臨床上用秋水仙堿治療急性痛風性關節炎，主要是抗炎、減輕腫脹，無降尿酸的作用。但是在臨床上患者的血尿酸水平升高作為診斷痛風的重要標準，所以本研究采用腹腔注射氧嗪酸鉀誘導小鼠高尿酸，給予痛風散干預后，測定小鼠的血清尿酸，根據小鼠的血清尿酸水平判斷痛風散的療效。經過痛風散干預后，小鼠血尿酸明顯降低，其中以痛風散低劑量組的效果最佳，表明痛風散對急性痛風性關節炎小鼠有治療作用。

高尿酸血癥和痛風與代謝綜合征、脂肪肝、慢性腎病等疾病的發生發展密切相關，臨床上也常常注意相關指標的檢測，預防痛風的并發癥。故研究中檢測AST、ALT、CRE、BUN 指標，探討痛風散對肝腎功能的影響［12］。痛風散干預后，各劑量組小鼠血清中肌酐和尿素氮都有所降低，中劑量的效果相對更明顯。小鼠血清AST 和ALT 都明顯降低，且以痛風散低劑量為最佳，表明本實驗所用的痛風散對肝腎功能無不良影響，且對肝腎功能有較好的保護作用。

經痛風散的干預后，小鼠踝關節炎性細胞滲出浸潤明顯減少，滑膜增生減少，其中以痛風散中劑量組的效果為最佳。小鼠踝關節的促炎因子IL-6、IL-17A、IFN-γ、TNF-α 的表達有減弱趨勢，抑炎因子IL-4、IL-10、TGF-β 表達有增強趨勢。結果表明，痛風散對急性痛風性關節炎的治療，可能是通過抑制促炎因子的IL-6、IL-17A、IFN-γ、TNF-α 表達和促進抑炎因子IL-4、IL-10、TGF-β 的表達實現。研究表明，血尿酸持續增高超過飽和狀態，尿酸鹽晶體沉積于關節等處誘導炎癥反應的發生，炎癥因子的釋放受到多種信號通路和免疫細胞的調節［13］，其中Th17/Treg 細胞失衡在痛風性關節炎中起重要作用，痛風患者中介導炎癥的Th17 細胞表達增加而抑制炎癥的Treg 表達減少［14］。IL-17A 主要是Th17 細胞分泌的炎癥因子，而IL-10、TGF-β 主要由Treg 分泌［15］，由此推測痛風散可能具有調節Treg 和Th17 的作用。研究結果發現，經過痛風散的干預后，小鼠Treg 細胞的比例有所升高，為上述推測提供了可靠的證據。

在實驗結果中，低劑量比高劑量的實驗數據較好，推測可能由于高劑量藥物濃度過高，反而不利于藥物的吸收，而藥物的藥理作用不是劑量越高越好，而是在一定范圍內呈劑量依賴性，超過一定的劑量反而藥效較差。

綜上，本研究通過建立急性痛風性關節炎小鼠模型，評價了痛風散的抗痛風作用。結果顯示，痛風散可以降尿酸，保護肝腎功能，緩解關節炎癥腫脹，可以通過抑制炎癥因子的生成發揮抗痛風的作用，其作用機制可能歸因于痛風散促進Treg 介導的抑炎作用，進而抑制了促炎因子的表達。研究結果表明，痛風散對動物模型的作用與陽性對照藥秋水仙堿相比，具有類似或更強的效果。本實驗在動物水平上研究了痛風散作為抗痛風性關節炎的可行性，并初步探討了其作用機制，為痛風散在臨床使用提供一定的實驗依據，同時也為新型抗痛風藥物的開發提供思路。由于本研究只探討了痛風散對急性痛風性關節炎的作用，而復方成分復雜，作用具有多成分多靶點的特點，對痛風散作用的有效組分和內在機制研究將是下一步研究的方向。