KED碰撞模式-電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)法測定血液、尿液中8種重金屬和準金屬元素

吳澤清 張成龍 國 菲 劉番番 畢文姬 楊瑞琴* 李 鵬*

(1.中國人民公安大學 偵查學院,北京 100038;2.淄博市公安局 刑偵支隊,山東 淄博 255022)

重金屬和準金屬元素常被不法分子用于投毒犯罪活動,涉及重金屬和準金屬的中毒案件時有發生。相關案件中的血液、尿液取樣便捷且在人體內含量豐富,能夠反映不同途徑元素暴露的體內負荷信息[1-2]。血液、尿液中重金屬和準金屬元素常見的檢測方法主要包括原子發射光譜(AES)、原子吸收光譜(AAS)、電感耦合等離子體發射光譜(ICP-AES)和電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)法。ICP-MS是20世紀80年代以來發展最快的多元素分析技術,與AES、AAS和ICP-AES相比,檢出限更低、線性范圍更寬、分析速度更快,被廣泛應用于環境監測、食品分析、醫學診斷和法庭科學等領域。然而,ICP-MS在檢測血液、尿液中的重金屬和準金屬元素時會受到基質干擾、多原子離子干擾等因素的干擾,影響分析結果的準確性,這就要求檢測復雜基質樣品時選擇適當的前處理方法和校準方法。血液、尿液樣品常用的前處理方法包括微波消解法和直接稀釋法等。微波消解法消解完全,密閉環境能夠有效避免揮發性元素的損失,避免外界污染[3],但樣品處理時間長、操作復雜,不適合批量測定;直接稀釋法操作簡單快速且無需前處理設備,能夠減少可能引入的污染。稀釋能有效降低樣品基質效應,避免樣品中的有機物和較高濃度的無機鹽堵塞進樣毛細管[4],減少因霧化器和錐口上的固體沉積而引起的儀器漂移[5]。

由于血液、尿液樣品的基質復雜且具有個體差異性,無法配制與血液、尿液樣品成分相似的標準溶液,難以獲得較好的準確度[6]。外標法、同位素稀釋法和標準加入法是定量分析中常用的校準方法[7]。外標法通過扣除本底值有效減少系統偏差,但不同樣品間基質效應的差異仍會顯著影響定量的準確性;同位素稀釋法是校正ICP-MS中基質效應和信號漂移最有效的方法,但該方法耗時長、成本高,要求目標元素至少有兩個不受光譜干擾的同位素,不適用于Co、As、Sb、Tl等只有一個同位素或者單同位素的元素[5];標準加入法應用成本低,無需另外引入空白基質,克服了基質效應且被證明在生物基質中具有極高的準確性[8]。本實驗在直接稀釋前處理方法的基礎上,通過標準加入法和稀釋劑改善血液、尿液樣品的基質效應和個體元素差異造成的誤差,再應用動能歧視(KED)檢測模式減少樣品中生物分子對測定產生的質譜和非質譜干擾,實現血液、尿液樣品中多元素的精準和高通量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

iCAP Qc ICP-MS儀器(美國Thermo Fisher公司)、去離子純水處理系統(法國Merck公司)、HY-5 渦旋振蕩器(常州恒睿儀器設備制造有限公司)、CF16RN 落地式多功能離心機(日本日立公司)、AUW220D 電子天平(日本島津公司)、移液器(德國Eppendorf公司)。

去離子水(18.2 MΩ·cm),1 g/L Cr、As、Cd、Pb單元素標準溶液(山東省冶金科學研究院),1 g/L Co、Ni、Sb單元素標準溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心),1 g/L Tl單元素標準溶液(AccuStandard?),1 g/L In單元素標準溶液(壇墨質檢,BW30046-100-N-50),超純濃硝酸(德國Merck公司),1 g/L Ba、Bi、Ce、Co、In、Li、U調諧液(美國Thermo公司),Triton X-100 試劑(Sigma-Aldrich?),99.9%乙醇溶液(德國Merck公司),志愿者血液、志愿者尿液各1份。

1.2 儀器參數

用美國Thermo公司儀器調諧液(S55602)調節儀器至最優狀態,并滿足氧化物產率CeO+/Ce+<3%,雙電荷離子Ba2+/Ba+<3%。通過調諧優化后的儀器參數條件為:射頻(RF)功率1 550 W、載氣流速12 L/min、蠕動泵轉速40 r/min、掃描次數20次、積分時間0.02 s、掃描方式跳峰、每個樣品連續重復測量3次,檢測模式KED模式、碰撞氣體He。

1.3 樣品前處理

將存儲于-22 ℃環境下的空白血液和尿液取出解凍,渦旋儀混勻后處理。血樣和尿液分別取5 mL空白樣品各自置于8個10 mL試管內,留1份空白樣品,向其余試管中分別添加0.05 mL的25、100、500、1×103、2×103、5×103、1×104μg/L梯度濃度溶液。移取200 μL血液至10 mL離心管,加入30 μL內標溶液后向內加入稀釋劑(0.1%HNO3+0.05%Triton X-100)稀釋50倍至10 mL,渦旋1 min后4 500 r/min離心5 min,移液槍移取上清液后使用ICP-MS檢測;移取200 μL尿液至2 mL離心管,加入30 μL內標溶液后向內加入稀釋劑(0.1% HNO3+1%乙醇)稀釋10倍至2 mL,渦旋1 min直接使用ICP-MS檢測。

1.4 數據處理與分析

Microsoft Excel 2019和IBM SPSS Statistics 26.0對樣品數據進行處理和分析。

2 結果與討論

2.1 碰撞氣流量和載氣流速的優化

檢測前通過自動調諧達到儀器最佳實驗狀態,但為了提高儀器對檢材中單個目標元素定性定量時的靈敏度,對能顯著影響元素響應值的碰撞氣和載氣流速進行了考察。KED模式下碰撞氣He流量的大小影響進入質量分析器中待測離子的數目,從而影響檢測靈敏度[9];進樣過程中在霧化器處引入載氣,其流速大小能夠影響等離子體中樣品氣溶膠的電離效率和停留時間[10]。本實驗通過考察1 μg/L的Cr、Co、Ni、As、Cd、Sb、Pb、Tl標準品溶液,分別研究He流量在1～6 mL/min,載氣流速0.4～1.3 L/min時各元素響應值的變化,結果如圖1所示。由圖1可知,隨He流量的增大,Co、Cd、Sb、Pb元素的響應值呈現先增大后減小然后再增大的趨勢,Cr、Ni、Tl元素的響應值呈現整體增大的趨勢,As的響應值呈現先增大后減小的趨勢;隨載氣流速的增加,更多均勻的樣品氣溶膠顆粒進入等離子體中,整體呈現先增大后減小的趨勢。75As、208Pb的最佳He流量分別為4.0、2.0 mL/min,其余元素的響應值在He流量為6.0 mL/min時最大;75As的最佳載氣流速為1.1 L/min,其余元素的最佳載氣流量為1.2 L/min。

圖1 He流量和載氣流速對8種重金屬和準金屬元素響應值的影響Figure 1 Effects of He flow rate and carrier gas flow rate on the response values of 8 heavy metals and quasi metallic elements.

2.2 稀釋劑的選擇

血液、尿液基質成分復雜[11-12],稀釋能夠有效降低樣品基質效應。相對于堿性稀釋劑,Mn、As等元素在酸性條件下更加穩定。HNO3對大多數金屬及痕量元素的溶解性好且譜圖干擾小[6],是目前常用的稀釋劑,但過高濃度HNO3可能導致樣品中的蛋白質變性,使得儀器進樣管和霧化器堵塞[13],因此選擇低濃度HNO3(0.1%)作為基本稀釋劑,同時對不同體積分數ICP-MS增敏劑Triton X-100和乙醇的效果進行考察。不同體積分數的Triton X-100、乙醇對8種重金屬和準金屬元素信號響應的影響見圖2。

圖2 不同體積分數的Triton X-100和乙醇溶液對8種重金屬和準金屬元素信號響應的影響Figure 2 Effects of Triton X-100 and ethanol solutions with different volume fractions on signal response of 8 heavy metals and quasi metallic elements.

未經消解的血液中基質成分復雜,大約含有60～80 g/L蛋白質和10 g/L無機鹽。非離子型表面活性劑Triton X-100具有溶血作用,經常應用于生化以溶解蛋白質[14],相比于乙醇更適合作為血液稀釋劑。由圖2可知,同質量濃度的Cr、As、Sb標準溶液在體積分數為0.1%的Triton X-100溶液中獲得最高信號,但其他元素信號響應值均較低;在0.05%Triton X-100溶液中,Co、Ni、Cd和Pb標準溶液的信號響應最高,同時其他元素也具有較高的信號響應值。故實驗選用0.05% Triton X-100溶液作為增敏劑,采用0.1% HNO3-0.05% Triton X-100混合溶液作為血液稀釋劑。

乙醇簡單易得,對工作環境及人員無毒害,適合作為大批量樣品的ICP-MS增敏劑[6]。由圖2可知,Cr、Co、Ni等低質量數元素的標準溶液在體積分數為1%乙醇溶液中獲得最高信號,As、Cd、Sb、Tl和Pb等高質量數元素的標準溶液在體積分數為4%乙醇溶液中獲得最高信號,其余體積分數乙醇溶液對元素信號的增強和抑制不明顯,響應值差別較小。樣品離子束進入提取透鏡后受空間電荷效應的影響,輕質量數離子受影響偏轉甚至逃逸,導致輕質量數元素的靈敏度偏低[7]。因此在同等濃度下,Cr、Co、Ni元素標準溶液信號響應相對As、Cd、Sb、Tl和Pb元素更低,1%乙醇溶液能夠有效提高低質量數元素的信號響應,同時其他元素也具有較高的信號響應值。實驗選用1%乙醇溶液作為增敏劑,采用0.1% HNO3-1%乙醇混合溶液作為尿液稀釋劑。

2.3 干擾來源與消除

ICP-MS測定血液和尿液樣品中元素時受多原子離子干擾、雙電荷干擾、拖尾干擾等影響,此外空白樣品和檢材樣品間基質的差異也會對檢測結果造成干擾。血液、尿液樣品中含有的生物分子、有機物和鹽類物質,使得樣品基質更加復雜,容易在離子化過程中與氬氣結合形成如40Ar14N+、ArCl+、40Ar12C+等復雜的干擾物[15],這是造成多原子離子干擾的原因之一。KED模式在四極桿濾質器中的四極桿上形成電勢柵欄,從而區分動能有所差別而質荷比相同的離子,通入碰撞氣He抑制多原子離子干擾以達到減低質譜干擾的目的[15-16]。雙電荷干擾在ICP-MS中并不是主要的干擾類型,同時對生物樣品檢測的影響較小,在檢測開始前使用含有Ce2+或Ba2+的調諧液檢測雙電荷離子的形成[5]。拖尾干擾的大小取決于儀器的豐度靈敏度,血液等液體檢材中的55Mn容易受54Fe和56Fe的影響導致不真實的高響應值。檢測中標準加入法的引入避免了使用空白樣品量化檢材中的目標物,使得樣品基質保持一致[17]。

此外,儀器在分析高濃度樣品后對低濃度樣品的測定會出現記憶效應,應當按照濃度升序檢測樣品,同時設置合適的清洗時間以降低記憶效應。根據上述儀器條件測定8種元素的50 μg/L高濃度樣品溶液,分別將樣品測定完成后的清洗時間設定為10、30、60和120 s,當清洗時間為60 s時,各元素響應值已經接近空白樣品水平的響應值,有效消除了各元素測定過程中引入的記憶效應。

2.4 標準加入法測定樣品中重金屬和準金屬

表1 血液和尿液樣品中8種元素的線性關系及含量Table 1 Linear relationship and contents of 8 elements in blood and urine samples

2.5 方法學驗證

2.5.1 檢出限及定量限

通過對空白溶劑的測量,計算出檢出限和定量限。使用ICP-MS連續檢測11次,檢出限LOD=3SD,其中SD表示測量的標準偏差。根據IUPAC指南計算定量限,定量限LOQ為標準偏差的10倍,即LOQ=10SD,結果如表2所示。

表2 8種元素的檢出限和定量限Table 2 Detection limits and quantification limits of 8 elements

2.5.2 加標回收率及精密度

表3 標準加入法下8種元素的低、中、高濃度溶液在血液和尿液中的回收率Table 3 Recoveries of low,medium and high concentration solutions of 8 elements in blood and urine under the standard addition method /%

選取血液、尿液樣品的低、中、高(血液:10、50、100 μg/L;尿液:5、50、100 μg/L)濃度消解后溶液,連續測定11次,連續測定3 d,得到8種元素的日內和日間精密度。如表4所示,血液中各元素的日內和日間精密度為0.90%～8.7%和0.73%～1.9%;尿液中各元素的日內和日間精密度為0.30%～3.0%、1.5%～7.7%,說明該方法對血液和尿液中重金屬和準金屬元素的測定值準確可靠。

表4 血液和尿液中8種元素的日內和日間精密度Table 4 Intra-day and inter-day precision of 8 elements in blood and urine(n=11) /%

3 結論與展望

建立了采用直接稀釋方法對血液、尿液樣品進行前處理,并應用標準加入法和KED模式定量的ICP-MS檢測方法,靈敏準確、快速便捷、準確性高,適用于血液、尿液中多種重金屬和準金屬元素的檢測。本文比較了不同濃度和種類的ICP-MS增敏劑的效果,調整了清洗時間,有效避免了測定過程中的記憶效應,引入內標元素In調節儀器信號漂移并補償基體干擾,同時KED模式使用He作為碰撞氣與多原子離子碰撞裂解,利用電壓差過濾低動能離子,有效抑制了檢測過程中的多原子離子干擾,相關方法驗證結果均能滿足測定要求。應注意為避免樣品中未消解的有機物在霧化器和錐口上沉積導致儀器信號漂移,使用時應當在靈敏度允許的范圍內,根據實際情況和相關文獻報道盡量以大倍數稀釋樣品,以減少樣品基質對儀器的影響。