腸道微生物代謝產物對畜禽腸黏膜屏障的影響及調控機制

鄧 雄 張云常 王文歡 劉 明*

(1.北京農學院動物科學技術學院,北京 102206;2.山東弘科福萊生物技術有限公司,濟南 250003)

腸黏膜介導動物營養物質的吸收、轉運和代謝,在維持畜禽腸道穩態和促進生長的過程中發揮重要作用[1]。動物腸道黏膜屏障由物理屏障、化學屏障、免疫屏障和生物屏障組成,是抵御外源抗原、有毒物質和維持腸道健康的重要防線。研究表明,動物機體攝入的營養物質除了用于自身的生長發育外,也可以作為信號分子,通過直接或間接的方式調控腸黏膜屏障功能[2]。直接調控是指營養物質調控與腸黏膜屏障相關基因和蛋白的表達,如飼糧中添加氨基酸等營養物質能夠通過提高腸道緊密連接蛋白表達來增強腸道物理屏障,也可以通過促進分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)的生成來增強腸道免疫屏障[3]。間接調控則是通過調節腸道微生物及其代謝產物來實現。

腸道微生物定植于動物胃腸道中,除占據主要地位的細菌外,還包括真菌、病毒和原蟲。細菌主要分為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門。其中,擬桿菌門和厚壁菌門占腸道微生物總量的90%以上[4]。腸道微生物與宿主之間存在著互利共生的關系,宿主可以為腸道微生物提供營養物質與棲息場所;反之,腸道微生物可以利用未能在小腸中消化吸收的抗性淀粉、膳食纖維及蛋白質等營養物質,代謝生成短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)、次級膽汁酸(secondary bile acids,SBAs)、吲哚及其衍生物、維生素、多胺、多酚及其衍生物等代謝產物,這些代謝產物可以作為宿主的能量底物,也可以作為胞內信號通路的調節因子,參與調節腸道黏膜屏障[5-6]。

隨著現代微生物和代謝物等高通量測序技術的不斷發展,以及腸道微生物體外培養技術的成熟,當前對腸道微生物代謝產物以及其對腸黏膜屏障功能調控作用的研究也越發深入?；谀c道微生物代謝產物在調控腸道黏膜免疫中的重要作用,本文總結了SCFAs、SBAs和色氨酸代謝物這3類主要的微生物代謝產物對腸黏膜屏障的調節作用及相關機制,旨在為探明微生物代謝產物改善動物腸道健康與實際應用提供參考。

1 腸道微生物主要代謝產物

1.1 SCFAs

SCFAs由微生物代謝小腸中未消化的抗性淀粉、膳食纖維和支鏈氨基酸產生,包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸及異戊酸。研究表明,擬桿菌門和厚壁菌門是代謝抗性淀粉、膳食纖維和支鏈氨基酸的主要細菌。SCFAs通過氫離子依賴單羧酸轉運蛋白(monocarboxylate transporter,MCT)和鈉離子偶聯單羧酸轉運蛋白1(sodium-coupled MCT1,SMCT1)介導的主動轉運吸收進入結腸上皮細胞[7]。SCFAs被結腸上皮細胞吸收后,一部分作為能量底物參與三羧酸循環,另一部分則進入血液經門靜脈循環到達肝臟,通過糖異生途徑轉化為乙酰輔酶A,作為肝糖原貯存在肝臟中[8]。除提供能量外,SCFAs還具有多種生物學功能,包括調節葡萄糖和脂質合成代謝、維持機體能量穩定以及參與機體免疫反應預防炎癥等。

1.2 SBAs

膽汁酸(bile acids,BAs)是由膽固醇合成的甾體酸,是膽汁的主要成分。在肝臟中,膽固醇結合?；撬峄蚋拾彼嵘沙跫壞懼?primary bile acids,PBAs),隨后運輸至膽囊中儲存。PBAs通過膽管分泌進入十二指腸后,約95%的PBAs通過肝腸循環被重吸收進入肝臟,而未被重吸收的BAs進入結腸,經膽鹽水解酶水解氨基酸基團后,在微生物的作用下轉化生成SBAs[9-10]。腸道中的PBAs主要有膽酸(cholic acid,CA)和鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA);SBAs主要有脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)、石膽酸(lithocholic acid,LCA)、熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)和?；悄懰?taurocholic acid,TCA),以及由CDCA和UDCA分別產生的?；?α-鼠膽酸(tauro-α-muricholic acid,T-α-MCA)和?；?β-鼠膽酸(tauro-β-muricholic acid,T-β-MCA)等[11]。研究表明,BAs的功能是促進脂肪和脂溶性營養素的吸收。此外,BAs還可以通過激活膽汁酸受體來調節葡萄糖和脂質代謝以及機體免疫功能[12]。

1.3 色氨酸代謝產物

色氨酸是芳香族氨基酸,屬于必需氨基酸。膳食色氨酸在小腸中被吸收,到達結腸的色氨酸主要由大腸桿菌、梭菌、擬桿菌、葡萄球菌、真細菌、乳桿菌以及瘤胃球菌等細菌分解代謝[13]。色氨酸有3種微生物代謝主途徑,即犬尿氨酸途徑、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)途徑和吲哚途徑;其中95%的色氨酸通過犬尿氨酸途徑代謝,生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+),而5-HT和吲哚途徑主要產生5-HT和吲哚及其衍生物,如吲哚-3-甲醛、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙醛和吲哚-乳酸等[14-15]。研究表明,腸道微生物可通過編碼犬尿氨酸酶或產生犬尿氨素衍生物來調控犬尿氨酸途徑[16]。也有研究表明,腸道微生物可以通過調節5-HT的產生,結腸中的產孢梭菌、瘤胃球菌等微生物可以表達細菌脫羧酶和色氨酸酶A;色氨酸可以在這2種酶的作用下脫羧生成吲哚,再經其余微生物的氧化還原反應轉化成吲哚衍生物[17]。色氨酸代謝產物具有顯著的免疫調節功能,可以促進上皮細胞更新、調節黏膜免疫和維持屏障完整性,是腸道穩態的關鍵調節因子[14]。微生物代謝產物及代謝菌見表1[14,18-24]。

表1 微生物代謝產物及代謝菌群

2 腸黏膜屏障

腸黏膜屏障由物理屏障、化學屏障、免疫屏障和生物屏障組成。物理屏障是一道選擇性透過屏障,在阻止病原菌和抗原入侵的同時調節水、離子和營養物質的吸收。物理屏障由腸上皮細胞及細胞間的緊密連接組成。腸上皮細胞主要包括吸收型腸上皮細胞、杯狀細胞和潘氏細胞。細胞間的緊密連接蛋白包括閉鎖小帶蛋白(zonula occludens,ZO)、閉鎖蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudin)、橋粒以及連接黏附分子等[25]?；瘜W屏障指位于上皮層上方的黏液層,主要成分是水、高度糖基化的黏蛋白、抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)和sIgA。黏蛋白由杯狀細胞產生,α-防御素、溶菌酶和組織蛋白酶以及其他AMPs則由潘氏細胞分泌[26]。免疫屏障由免疫細胞及其分泌的炎性因子與活性氧介導。動物機體通過先天性免疫和適應性免疫來抵御病原體的侵襲。先天性免疫由樹突狀細胞和巨噬細胞介導:樹突狀細胞通過高效攝取、加工處理和呈遞抗原發揮作用;巨噬細胞通過吞噬或分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)發揮作用[27]。介導適應性免疫的免疫淋巴細胞為T淋巴細胞、B淋巴細胞、漿細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞。T淋巴細胞分泌白細胞介素來調節機體的免疫應答;B淋巴細胞在抗原刺激下可分化為漿細胞;漿細胞合成和分泌免疫球蛋白,參與機體的體液免疫[28-29]。生物屏障主要由腸道共生菌組成,能夠抵御病原菌的入侵。病原菌的入侵會導致腸道微生物結構和功能的改變,引起菌群失調。腸道共生菌通過定植抵抗作用抵御外源病原菌入侵[30]。

3 微生物代謝產物調節腸黏膜屏障功能的作用及機制

3.1 SCFAs對腸黏膜屏障功能的調節作用及分子機制

SCFAs不僅作為結腸上皮細胞的能量來源,也參與調節腸道物理屏障。研究表明,飼糧中添加2 000 mg/kg丁酸鈉可緩解斷奶仔豬腹瀉,進一步研究表明,丁酸鈉與通過與結腸上皮細胞中的G蛋白偶聯受體109A(G protein-coupled receptor 109A,GPR109A)結合,隨后激活蛋白激酶B(Akt)信號通路,從而促進緊密連接蛋白的表達[31]。另一項研究表明,肉雞飼糧中添加丁酸鈉可以顯著提高空腸occludin基因表達[32]。體外研究發現,2 mmol/L的戊酸鈉可以提高Caco-2單層細胞電阻,表明戊酸鈉具有降低細胞通透性的功能;研究還表明,戊酸鈉的這種作用與單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信號通路的激活和緊密連接蛋白的重組裝相關,而與調控細胞間的緊密連接蛋白表達無關[33]。此外,丁酸鈉可以有效減輕感染輪狀病毒的IPEC-J2細胞緊密連接蛋白結構損傷,上調緊密連接蛋白相關基因的表達;丁酸鈉可通過激活受體GPR109A介導的AMPK-核因子E2相關因子(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)信號通路來維持腸黏膜機械屏障功能[34]。

SCFAs還可以調控畜禽腸免疫屏障,并且是通過激活G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor,GPCR)來實現。據文獻報導,飼糧中添加丁酸鈉可減輕泌乳山羊盲腸黏膜的炎癥損傷,丁酸鈉通過表觀遺傳修飾下調GPCR41/43和白細胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)、TNF-α等相關炎癥細胞因子的表達[35]。研究表明,在仔豬飼糧中補充丁酸鈉可降低空腸黏膜中肥大細胞的百分比,降低TNF-α、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等促炎因子水平,這一過程可能與激活c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號通路有關[36]。也有研究表明,SCFAs通過激活小鼠腸上皮細胞上的GPCR41和GPCR43,進一步激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK),促進趨化因子和細胞因子的分泌,從而介導機體免疫反應和結腸炎[37]。除此之外,SCFAs還可以作為組蛋白去乙?；?histone deacetylase,HDAC)抑制劑發揮作用。SCFAs作為HDAC抑制劑可以抑制核苷酸結合NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體的激活,從而減輕脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導的畜禽腸道屏障損傷[38]。也有研究表明,丙酸鈉通過直接作用于γδT細胞,以HDAC依賴性方式減少白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)的分泌[39]。

SCFAs可以調控腸道黏液分泌。斷奶仔豬飼糧補充1 kg/t丁酸鈉可以增加回腸杯狀細胞數量[40]。雞飼糧中補充1 g/kg丁酸鈉顯著增加了空腸中的黏蛋白2(Muc2)基因表達水平[41]。此外,丁酸鈉可以通過激活MAPK信號通路,調節Muc2基因的表達,進而促進結腸黏蛋白的生成[42]。也有研究發現,丁酸鈉處理的IPEC-J2細胞豬β-防御素2和β-防御素3等防御肽基因表達顯著增加[43]。研究表明,這一過程由Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)/表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號通路介導,與SCFAs的HDAC抑制作用無關[44]。此外,丁酸也能通過誘導潘氏細胞分泌α-防御素增強腸化學屏障[45]。

SCFAs也能調節腸道微生物組成。據文獻報導,在飼糧中添加丁酸鈉會提高斷奶仔豬腸道中益生菌的豐度和多樣性,如回腸與結腸中的乳桿菌屬、鏈球菌屬、巨球型菌屬、布勞特氏菌屬以及盲腸中的鏈球菌屬和巨球型菌屬[46-47]。在感染大腸桿菌的斷奶仔豬飼糧中添加3%的丁酸鈉能夠提高結腸普雷沃氏菌屬的豐度[48]。沙門氏菌是引起仔豬腹瀉的主要病原菌之一。研究表明,感染沙門氏菌的仔豬腸道中,產生丁酸和丙酸的梭狀芽胞桿菌、Turicibacter、擬桿菌屬和乳桿菌屬數量降低[49]。飼糧中添加丁酸鈉能夠減少沙門氏菌的定植,這可能是由于丁酸鈉改變了其腸道微生物組成,形成了更有效的定植抵抗[50]。

3.2 SBAs對腸黏膜屏障功能的調節作用及分子機制

研究表明,飼糧中添加CDCA顯著提高了斷奶仔豬空腸和回腸的絨毛高度和隱窩深度比例、杯狀細胞數量以及緊密連接蛋白的表達,同時提高了斷奶仔豬腸道益生菌普雷沃氏菌屬9和普雷沃氏菌科TCG-001的豐度,降低了致病菌Dorea的豐度[51]。DCA通過調節微生物群組成來抵抗空腸彎曲桿菌在雞腸道中的定植,這表明微生物群與微生物代謝物之間存在相互作用[52]。飼糧中添加0.15%DCA還可以減少壞死性腸炎肉雞的腸道炎癥反應并阻止產氣莢膜梭菌的入侵[53]。體外研究發現,LCA可增強Caco-2細胞通透性和細胞間緊密連接蛋白的表達,促進沉默信息調節因子2相關酶1(silent information regulator factor 2-related enzyme 1,Sirt1)、Nrf2和血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的表達,并抑制TNF-α誘導的p65和核因子-κB抑制因子α(nuclear factor-κB inhibitor α,IκBα)的磷酸化水平升高,從而減輕TNF-α誘導的腸屏障功能損傷[54]。

SBAs通過調節適應性和先天免疫反應來維持屏障功能[55]。補充UDCA、LCA等SBAs可緩解機體結腸炎,這種抗炎作用與法尼醇X受體(farnesoid X receptor,FXR)、G蛋白偶聯膽汁酸受體1(G protein-coupled bile acid receptor 1,GPBAR1)、鞘氨醇-1-磷酸受體2(shingosine-1-phosphate receptor 2,S1PR2)、孕烷X受體(pregnane X receptor,PXR)、組成型雄甾烷受體(constitutive androstane receptor,CAR)、維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)以及視黃酸受體相關孤兒受體γt(retinoic acid receptor-related orphan receptor γt,RORγt)有關[56-58]。FXR與GPBAR1在維持膽汁酸穩態和調節膽汁酸代謝中發揮重要作用,也有研究證實FXR激活抑制小鼠結腸黏膜組織的促炎細胞因子產生和不同免疫細胞群的分化,GPBAR1激活可抑制樹突狀細胞中核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)相關促炎細胞因子產生[59-60]。敲除S1PR2的小鼠葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導的結腸炎更嚴重[61],補充DCA會加劇DSS誘導的結腸炎,但用S1PR2拮抗劑JET-013治療會減輕機體腸黏膜炎癥細胞浸潤的增加[62]。LCA可通過激活腸道PXR降低Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)的表達,進而減輕機體的壞死性腸炎;也能通過激活VDR抑制Th1激活來調控適應性免疫[63-64]。CAR能夠調控CD4+效應T細胞中外源性轉運蛋白——多重抗性蛋白1(multiple resistance protein 1,MDR1)的表達和促進白細胞介素-10(interleukin,IL-10)的表達來減輕腸炎[65]。據文獻報導,SBAs通過與RORγt結合抑制TH17細胞的分化,調節TH17和Treg細胞的平衡,進而控制機體免疫反應[66]。

然而,一些SBAs對腸黏膜屏障功能具有負面調控作用。有研究表明,HDCA通過FXR-磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxy kinase,PI3K)/Akt信號通路抑制IPEC-J2細胞增殖[67]。0.25 mmol/L的DCA降低Caco-2細胞中與緊密連接、縫隙連接和黏附連接相關的23個基因的表達,顯著降低occludin的蛋白水平[68]。同時DCA降低小鼠潘氏細胞中吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO-1)的表達和犬尿氨酸水平[69]。

3.3 色氨酸代謝物對腸黏膜屏障功能的調節作用及分子機制

色氨酸代謝物主要通過芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AhR)和PXR信號通路參與維持腸道屏障功能。有研究評估了11種微生物色氨酸代謝產物對AhR的組合效應發現,色氨酸代謝物組合中的吲哚濃度是影響腸道AhR活性的關鍵[70]。據文獻報導,飼糧補充吲哚-3-羧酸,可以減少雞空腸IL-1β、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和IL-10蛋白表達,提高AhR與營養物質轉運蛋白相關基因表達和雞腸上皮細胞中緊密連接蛋白的表達[71]。吲哚-3-甲醛能改善DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠的腸屏障功能并減輕其炎癥反應,這可能與TLR4/NF-κB/p38信號通路的抑制有關[72]。此外,吲哚-3-甲醇能提高小鼠腸道杯狀細胞數量,進一步的體外試驗證實吲哚-3-甲醇能夠顯著增加杯狀細胞Muc2和潘氏細胞溶菌酶的蛋白表達[73]。體外試驗研究表明,15 μmol/L吲哚甲酸顯著提高IPEC-J2細胞的增殖活性,并提高AhR和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)以及細胞周期蛋白D1的表達[74]。體外Caco-2與HT29共培養模型發現,吲哚-3-丙酸提高了claudin-1、occludin和ZO-1的基因和蛋白水平,進而增強物理屏障;吲哚-3-丙酸也可通過促進Muc2、黏蛋白4(Muc4)、三葉因子3(trefoil factor 3,TFF3)和抵抗素樣分子β(resistin-like molecule β,RELMβ)的分泌來增強化學屏障[75]。Muc2基因在腸道中的表達與PXR信號通路有關,敲除PXR導致機體腸道通透性增強,空腸和回腸Muc2表達水平下降,表明PXR是增強腸道化學屏障的重要調控靶點[64]。

色氨酸代謝物通過調控腸道先天免疫和適應性免疫以及微生物組成來維持腸黏膜屏障。羅伊氏乳桿菌代謝色氨酸產生的吲哚-3-甲醛通過激活AhR促進固有層淋巴細胞分泌白細胞介素-22(interleukin,IL-22),然后誘導信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)磷酸化以加速腸上皮增殖,從而恢復受損的腸黏膜[76]。吲哚-3-乙醛通過改變其對轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGFβ)的感知,減少體內Treg亞群和體外iTreg的發育,影響CD4+T細胞對自身菌群抗原的識別[77]。此外,吲哚-3-丙酮酸作為電子受體,在吲哚-3-乳酸脫氫酶的作用還原為吲哚-3-乙醛酸,可以平衡氧化還原電位進而增強宿主對致病菌的定植抵抗[15]。也有文獻報導,異位擬桿菌(Parabacteroidesdistasonis)通過促進吲哚丙烯酸生成、激活AhR信號通路,從而提高腸道屏障相關蛋白的表達[78]。

4 小 結

腸道是動物吸收營養物質和宿主防御的重要場所,對維持動物機體健康和促進動物的生長發育十分重要。在正常生理狀態下,動物腸道微生物與腸黏膜屏障相互作用,共同維持腸道健康。腸道微生物代謝產物種類繁多,而目前的研究多集中于SCFAs、SBAs和色氨酸代謝物等主要代謝產物及其代謝途徑和對動物腸道健康的影響與調控機制。對于其他代謝產物,如共軛脂肪酸、維生素等的研究相對較少,在生產應用上多視為能量底物和微量營養素。對于這類代謝產物,未來還需進一步探究其微生物的精確代謝途徑及其調控動物腸道健康的作用與相關機理。