黃芩苷對犬抗氧化能力和免疫功能的影響

謝留威 翟 翯* 宋明強 趙云龍 陳方園 常耀文 楊 洋

(1.中國刑事警察學院警犬技術學院,沈陽 110034;2.沈陽醫學院,沈陽 110031;3.北京市公安局,北京 100000;4.內蒙古自治區公安廳,呼和浩特 010000)

在犬精細化喂養的背景下,通過天然藥物成分改善機體抗氧化能力和免疫功能是目前犬飼養行業降低疾病發生的有效途徑。然而,現階段行業內缺少從天然藥用植物中提取的可有效促進犬免疫系統發育的飼料添加劑或獸藥產品。因此,積極尋求預防或治療效果顯著且無副作用的天然藥物成分來提高犬的整體性能具有重要意義。黃芩苷(baicalin)是唇形科多年生草本植物黃芩根部的主要活性成分,隨著藥理學研究的不斷深入,發現其具有抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、調節血糖的藥理活性[1-4]。張順芬[5]和柴守宏等[6]研究發現,黃芩苷能夠顯著提升生長豬腸道黏膜損傷的修復能力和抗氧化能力,并且黃芩苷還具有降低炎癥因子表達和提高優勢菌群相對豐度的效果。許海健等[3]研究也表明,黃芩苷具有抗炎、提高免疫和抗氧化等藥理活性,在治療炎癥性腸病方面有很好的功效。然而,黃芩苷作為一種具有優質功效的天然藥物成分在犬的飼養中卻鮮有研究。因此,基于黃芩苷作為飼料添加劑或獸藥產品在飼料中應用的廣闊前景,本研究以成年泰迪犬作為試驗對象,探究不同劑量的黃芩苷對犬抗氧化能力、肝臟和腎臟功能以及腸道免疫功能的影響,評價其對犬抗氧化能力和免疫功能等方面的調節作用,并確定黃芩苷的適宜添加劑量及實用安全性,為黃芩苷在犬處方類飼料的科學應用提供理論依據和重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

黃芩苷標準試劑(B9520,純度≥98%)購自某生物技術有限公司。試驗采用單因素完全隨機設計,將18只2周年的成年雄性泰迪犬[購自長春市豐隆生物技術有限公司,體重(5.62±0.53) kg]隨機分為3個組,每組6個重復,每個重復1只。對照組(CON組)飼喂基礎飼糧,低劑量黃芩苷組(Baicalin-L組)和高劑量黃芩苷組(Baicalin-H組)分別在基礎飼糧中添加10和20 mg/kg的黃芩苷?；A飼糧組成及營養水平見表1,試驗飼糧滿足NRC(2006)[7]犬營養需要量。試驗期為30 d,其中預試期7 d,正試期23 d。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.2 飼養管理

試驗犬采用單籠飼養,并在試驗開始前對試驗犬按標準程序進行防疫、驅蟲并進行標號。預試期所有試驗犬均飼喂基礎飼糧,正試期各試驗犬分別飼喂對應的試驗飼糧。試驗期間自由采食和飲水,超過10 min不再進食的情況下結束本次飼喂。每次進食結束40 min后進行自由活動,每次自由活動時間不少于60 min[8]。試驗期間定期對試驗場所進行沖洗、消毒。

1.3 樣品采集及指標測定

1.3.1 飼糧營養水平檢測

飼喂前采集飼糧樣品200 g,于65 ℃鼓風干燥箱中烘干,全部粉碎后過0.42 mm篩(60目)。測定飼糧干物質(GB/T 6435—2006)、粗蛋白質(GB/T 6432—1994)、粗脂肪(GB/T 6433—2006)、粗灰分(GB/T 6438—2007)、粗纖維(GB/T 6434—2006)、總膳食纖維(NY/T 1594—2008)以及淀粉(GB 5009.9—2016)含量,每個指標測定2個平行,取平均值。

1.3.2 血清生化和抗氧化指標檢測

試驗期第30天,飼喂前經前肢頭靜脈采集所有犬的血液,將5 mL血液置于促凝管中靜置30 min后于2 500 r/min離心10 min,分離血清于-20 ℃保存。采用全自動生化分析儀(7600-020,日本日立公司)測定血清肌酐(Cr)、尿素氮(UN)、總蛋白(TP)含量和谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)活性;按酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海聯邁生物工程有限公司)操作說明測定血清腎損傷分子-1(KIM-1)含量;采用免疫比濁法測定血清免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)含量(免疫球蛋白檢測試劑盒)。采用比色法測定血清抗氧化指標,包括總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量,試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3.3 流式細胞術檢測

試驗期第30天,每組隨機選取2只試驗犬,獲取其腸道淋巴結樣品,對其進行研磨,提取單細胞,取100 μL單細胞懸液,分別加入CD3、CD4、CD8抗體,混勻后于冰上避光孵育20 min,加入1 mL細胞染色緩沖液洗滌2次,100 μL細胞染色緩沖液重懸,通過流式細胞儀檢測細胞分群比例?？乖惲蚯杷釤晒馑?fluorescein isothiocyanate,FITC)-CD3、別藻藍蛋白(allophycocyanin,APC)-CD4、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)-CD8購自美國Biolegend公司。

1.3.4 犬腸道切片檢測

試驗期第30天,每組隨機選取2只試驗犬,獲取其腸道組織樣品,進行甲醛固定(時長1周),雙面切取2 cm左右的腸段進行包埋,使用石蠟切片機(KD-3358,浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)對包埋好的組織樣進行連續切片(厚度4～5 μm),對切片組織進行蘇木精-伊紅(HE)染色及Toll樣受體4(TLR4)蛋白免疫組化染色。

1.4 數據分析

數據采用SAS 9.4的MEANS模塊對基本統計量進行分析,采用GLM模塊對各組試驗犬血清生化和抗氧化指標進行方差分析,以Duncan氏法進行多重比較。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,使用GraphPad Prism 8.0軟件制作統計圖。

2 結果與分析

2.1 黃芩苷對犬血清生化和抗氧化指標的影響

由圖1可見,與對照組相比,高劑量黃芩苷組的血清T-AOC、SOD活性極顯著升高(P<0.01),且呈現出劑量依賴性趨勢;而血清MDA含量極顯著降低(P<0.01)。這表明飼糧中添加20 mg/kg的黃芩苷可以有效提高犬的機體抗氧化能力。在血清生化指標中,各組之間反映肝臟(TP含量和ALT、AST活性)、腎臟功能的指標(Cr、UN、KIM-1含量)沒有顯著差異(P>0.05)。這表明黃芩苷在增強機體抗氧化能力的同時不會對犬的肝臟、腎臟功能造成影響。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05),**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01),ns表示差異不顯著(P>0.05)。圖2同。

2.2 黃芩苷對犬血清免疫指標和腸道淋巴結細胞數量的影響

由圖2可見,與對照組相比,高劑量黃芩苷組的血清IgA含量顯著升高(P<0.05),血清IgM含量極顯著升高(P<0.01),并且二者隨著黃芩苷添加劑量的升高而升高。通過比較各組之間腸道淋巴結細胞數量發現,與對照組相比,低劑量黃芩苷組和高劑量黃芩苷組的淋巴結細胞中CD3、CD4、CD8細胞數量增加,且高劑量黃芩苷組的腸道淋巴結細胞中CD4/CD8極顯著升高(P<0.01)。這表明黃芩苷可以有效增強犬的腸道免疫功能。

SSC-H:側向角散射-高度 side scatter-height;FSC-H:前向角散射-高度 forward scatter-height;FSC-A:前向角散射-面積 forward scatter-area;APC-H:APC染料-高度 APC dye-height;PerCP-H:PerCP染料-高度 PerCPdye-height。

2.3 黃芩苷對犬腸道巨噬細胞富集和TLR4蛋白表達的影響

由圖3可見,比對犬的腸道組織切片發現,與對照組相比,飼糧中添加黃芩苷可以提升犬腸道巨噬細胞的富集程度,且高劑量黃芩苷組的腸道巨噬細胞富集程度的提升效果最好;通過對犬腸道切片進行免疫組化染色發現,飼糧中添加黃芩苷可以促進犬腸道的TLR4蛋白表達。

圖3 黃芩苷對犬腸道巨噬細胞富集和TLR4蛋白表達的影響

3 討 論

在犬疾病的治療方案中,使用抗生素等藥物治療會產生抗藥性,長期使用不利于機體的健康生長?，F階段,通過天然藥物成分增強機體抗氧化能力和免疫功能是犬飼養行業從根源途徑預防或降低疾病發生的有效途徑。因此,積極尋求預防或治療效果顯著且無副作用的天然藥物成分來提高犬的整體性能具有重要意義。黃芩苷作為一種來源廣泛、價格相對低廉且具有抗病毒、消炎、無耐藥性作用的黃酮類化合物,在預防和治療腸道炎癥、提高免疫力等方面具有較好的藥理特性[2-3,5-6]。柴守宏等[6]研究發現,飼糧中添加200～600 mg/kg的黃芩苷能夠有效提高育肥豬的免疫功能和抗氧化能力。在肉仔雞的研究中也呈現出類似的結果,飼糧中添加10 mg/kg的黃芩苷能夠顯著提高肉仔雞免疫器官發育和免疫功能,并且能夠有效地抑制腸道中大腸桿菌、沙門氏菌的繁殖[9]。因此,本研究選用黃芩苷作為研究對象,根據藥物代謝原理及上述案例,以試驗動物代謝體重為參考依據,將飼糧中黃芩苷的添加劑量設定為0～20 mg/kg,探討其對犬抗氧能力和免疫功能等方面的調節作用。

機體內環境中活性氧的動態平衡狀態與代謝健康有著密切聯系。研究表明,免疫活性增強劑可以增強對蝦的免疫功能和抗氧化能力,有效降低疾病的發生[10]。在機體防御體系中,T-AOC的作用主要是清除過高的活性氧,使機體的氧化還原處于相對穩定的狀態[11],且SOD、抗超氧陰離子活性的高低可反映出機體內氧自由基的代謝情況及機體的抗氧化能力[12]。在本研究中,高劑量黃芩苷組的試驗犬血清T-AOC、SOD活性分別是對照組的1.34、1.42倍,這表明飼糧中添加20 mg/kg的黃芩苷能夠有效提高犬的抗氧化能力。其次,血清MDA是脂質過氧化作用的標志性產物之一,其含量的變化既可用作脂質過氧化程度的衡量指標,也可間接反映機體內活性氧的積累[13-14]。本研究中,飼糧中添加高劑量的黃芩苷顯著降低了犬血清MDA含量,其降低幅度達到了30.1%。柴守宏等[6]和Jia等[15]也得到了類似的結果,黃芩苷可以提高生長育肥豬和羅非魚體內T-AOC、SOD活性,降低MDA含量。這進一步表明黃芩苷在提高機體抗氧化能力方面具有明顯的藥理特性和動物普適性。

動物體內B淋巴細胞和T淋巴細胞共同組成了機體的免疫系統[16]。其中,B淋巴細胞分化產生免疫球蛋白,在致病菌或者病毒等抗原入侵時,可轉化為抗體產生各類免疫反應抵抗抗原[17]。在一定范圍內,體內免疫球蛋白含量越高,則表明機體抵抗抗原的能力越強。在本試驗中,飼糧中添加黃芩苷提高了犬血清IgA、IgM含量,并且血清IgA、IgM含量與黃芩苷的添加劑量呈現出二次增加趨勢。這與Hu等[18]研究結果一致,即黃芩苷顯著提高了犢牛體內免疫球蛋白含量。T淋巴細胞作為調節機體免疫應答中適應性免疫的主要效應細胞[19],按表型不同可分為CD4細胞與CD8細胞兩大亞群,CD4細胞可協助B細胞進行分化,參與細胞免疫,CD8細胞則對病原體具有殺傷和抑制作用。研究表明,在一定范圍內,CD4/CD8與免疫功能呈正相關[20]。本研究利用流式細胞術標記了免疫細胞膜上的特異性受體,以此來區別淋巴細胞中CD4和CD8細胞數量,結果顯示,黃芩苷能夠促進犬T淋巴細胞的分化,且呈現出免疫細胞偏向CD4細胞分化的趨勢。由此可見,黃芩苷在機體免疫調節方面具有明顯的藥理特性。此外,腸道作為機體與外界環境接觸最為密切的部位,不僅是消化和吸收的主要部位,也是體內最大的免疫器官[21]。楊智仁等[22]研究發現,提高腸道免疫細胞數量和免疫球蛋白含量可以增加腸道的免疫功能,維護腸道健康。其中,巨噬細胞作為機體免疫細胞的重要組成部分,具有吞噬病原體、呈遞抗原的作用[23]。TLR4廣泛分布于腸道免疫細胞內,并在腸道固有免疫和適應性免疫系統中扮演著重要的角色,可在多種免疫細胞中表達[24]。本研究腸道切片結果顯示,黃芩苷提高了腸道組織中巨噬細胞的富集以及促進了免疫細胞中TLR4蛋白的表達。這與Chen等[4]研究結果類似,黃芩苷與TLR4結合可直接抑制直腸癌細胞中的低氧誘導因子-1α(HIF-1α)/血管內皮生長因子(VEGF)信號通路,降低腸道癌癥轉移性復發的幾率。由此可見,黃芩苷在預防和治療腸道炎癥方面具有顯著的免疫功能。

安全性高且副作用小是藥物成分能夠滿足商業化推廣的前提。本研究測定了犬的肝臟、腎臟功能指標,發現飼喂補充黃芩苷飼糧的犬血清反映肝臟(TP含量及ALT、AST活性)、腎臟功能的指標(Cr、UN、KIM-1含量)與對照組沒有顯著差異。由此可見,在本試驗條件下,飼糧中添加20 mg/kg黃芩苷不會對犬的肝臟、腎臟代謝過程產生額外負擔,這與近年來藥理試驗證明黃芩苷具有良好的生物活性和低不良反應結果[1,25]一致。此外,本研究結果表明犬血清中抗炎(T-AOC、SOD活性)、免疫功能(IgA、IgM含量和CD4/CD8)等指標均呈現出劑量依賴性趨勢,但本文并未針對更高劑量(>20 mg/kg)的黃芩苷在犬的健康與免疫方面展開研究。從目前的研究結果推測,高劑量的黃芩苷在犬腸道炎癥的治療方面會有所幫助,但具體的添加劑量有待進一步研究。

4 結 論

① 飼糧中添加20 mg/kg的黃芩苷能夠提高犬血清T-AOC、SOD活性,抑制MDA的產生,從而提高犬的抗氧化能力,且不會對犬的肝臟、腎臟代謝產生額外負擔。

② 飼糧中添加20 mg/kg的黃芩苷能夠提高犬血清IgA、IgM含量,增加腸道淋巴結細胞中CD3、CD4、CD8數量和巨噬細胞富集以及TLR4蛋白表達,從而有效地增強犬的腸道免疫功能。