基于Meta分析的黃酮類化合物對奶牛生產性能和血清免疫指標影響的研究

王琳瑋 趙小博 王 靖 蔣林樹

(北京農學院,奶牛營養學北京重點實驗室,北京 102206)

黃酮類化合物(flavonoids,FLAs)作為一種天然植物功能組分,具有抗菌、抗炎、抗氧化、增強免疫力、改善機體健康等多種生物學特征[1-3]。在畜牧行業中,FLAs作為飼料添加劑在改善反芻動物生產性能和機體免疫的應用中具有巨大潛力[4-7]。但飼糧中添加FLAs的研究重復性較少,缺乏系統性評價。研究表明,在飼糧中添加FLAs可降低奶牛腹瀉的發生率,但在改善奶牛代謝和生長性能方面卻沒有顯著效果[8-9]。Liu等[10]研究發現,在飼糧中添加FLAs可顯著提高奶牛的產奶量和乳脂率。而郭玉新[11]研究發現,FLAs雖能夠提高奶牛的奶產量,但對乳蛋白率和乳脂率沒有顯著影響。也有研究并未觀察到添加FLAs對奶牛產奶量及乳成分產生影響[12]。在FLAs對奶牛血清免疫指標的影響方面,有研究表明,提取自大豆的FLAs可以增加奶牛血清和乳汁中免疫球蛋白A(IgA)含量[13],而提取自蜂膠的FLAs則會降低奶牛血清中免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量[14]。由此可見,由于試驗條件、試驗動物個體差異、飼糧組成以及添加FLAs的種類、飼喂時長、添加劑量等條件差異,所得的研究結果并不一致。采用傳統的文獻定性分析方法很難準確地評價奶牛飼糧中添加FLAs的影響,難以揭示FLAs對奶牛生產性能及血清免疫指標的影響。

Meta分析作為一種可以對前人發表的一系列研究的原始數據進行收集、合并和統計的定量分析方法[15],在動物科學領域,尤其是動物營養學方向逐漸被接受和應用[16],但在研究天然植物飼料添加劑對反芻動物影響方面的應用較少[17]。因此,本文搜集了2000年至今國內外相關文獻,旨在通過Meta分析方法,系統地評價FLAs對奶牛生產性能及血清免疫指標的影響,同時進行敏感性分析(sensitivity analysis)和亞組分析(sub-group analysis),比較FLAs的不同種類、不同飼喂時長、不同添加劑量的作用效果,以期為FLAs在奶牛生產中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 文獻檢索

為確保Meta分析質量、減少發表偏倚,本研究遵循Moher等[18]提出的《系統評價和Meta分析首選報告項目》,通過計算機檢索從2000年1月至2023年6月發表在Web of Science、PubMed、Scopus、中國知網(CNKI)、維普(CQVIP)、萬方(Wanfang)等數據庫中FLAs對奶牛生產性能及血清免疫指標影響的相關文獻。在數據庫中的檢索關鍵詞如下:奶牛(dairy cattle or dairy cow)、黃酮(flavonoids)、大豆黃酮(daidzein)、柚皮苷(naringin)、葛根素(puerarin)、花青素(anthocyanin)、槲皮素(quercetin)[19]、生產性能(production performance)、產奶量(milk yield)、乳成分(milk component or milk composition)、免疫指標(immune indexes or immune indices)。檢索策略如表1所示。

1.2 文獻納入標準

納入標準:1)研究主題為FLAs對奶牛生產性能和血清免疫指標的影響;2)已發表的隨機對照試驗且試驗對象均為處于泌乳期的健康荷斯坦奶牛;3)試驗飼糧中不含抗生素等其他添加劑;4)研究結果中包含奶牛生產性能、血清免疫指標數據,包括試驗組和對照組的樣本量、平均值、標準差(standard deviation,SD)或標準誤(standard error,SE)。

1.3 文獻排除標準

排除標準:1)綜述性研究、會議和論文摘要等非試驗性文章;2)重復發表和使用同次試驗數據的文章;3)處于應激或攻毒等狀態下的健康狀況異常的荷斯坦奶牛;4)試驗結果數據不完整的研究,如缺失平均值、標準差、標準誤等關鍵數據或通過換算仍無法得到數據的研究;5)非中文和英文文獻。

1.4 文獻篩選和數據提取

首先對文獻進行初步篩選。通過閱讀題目與摘要,剔除與納入標準不相符的研究,隨后進行全文閱讀,再剔除數據不完整的研究,最后將確定納入的研究進行數據提取。

每個研究提取的數據包括:1)第一作者姓名、文獻發表時間和發表國家;2)試驗動物數量;3)試驗周期;4)添加FLAs的種類;5)對照組和試驗組的FLAs添加劑量;6)飼糧組成;7)測定指標:奶牛產奶量、乳成分、血清免疫球蛋白含量;8)測定指標數據(試驗樣本量或重復次數、平均值、標準差或標準誤)。

數據處理時,默認數據服從正態分布,分析方法均為參數檢驗。若同一研究中含有2個及以上的試驗組采用不同添加劑量或不同飼喂周期,則將各試驗組的信息進行合并處理[20]。若文獻中未給出標準差,則通過聯系文章作者以請求得到原始數據,或通過標準誤、P值、t值或置信區間(confidence interval,CI)估算標準差[21]。標準差估算具體計算公式如下:

式中:SD為標準差;SE為標準誤;MD為均值差;N為試驗樣本量或重復次數;t為t統計量的值(若已知P值和各組樣本量,可通過查t界值表獲得相應的t值),CI為置信區間。

亞組數據計算公式如下:

式中:SD為標準差;SD1、SD2分別為A、B 2個亞組的標準差;N1、N2分別為A、B 2個亞組的樣本量;M1、M2分別為A、B 2個亞組的平均值。如果有多個亞組的數據需要合并,可以按照上述公式,將其中2個亞組的數據進行合并,再將得到的數據與第3個亞組進行合并,以此類推。

1.5 統計學方法

使用Excel 2013表格工具進行數據的錄入與換算,使用Review Manager 5.4與Stata/MP 17.0軟件進行Meta分析。由于不同研究間結局指標的測量方法、測量單位并不一致,所以本研究采用標準均值差(standardized mean difference,SMD)作為效應尺度指標(effect-size indices,ESI)。各效應量均以95%CI表示,將0值作為無效值。

使用P值和I2表示異質性檢驗的結果,當P<0.10時,表明研究存在異質性,I2可對異質性大小進行定量分析,當I2>50%時,說明異質性顯著,反之則不顯著,I2值越大則表明研究間的異質性越大。本研究采用隨機效應模型(randomized effect model,REM)計算合并統計量,當納入的文獻少于5篇時則采用固定效應模型(fixed effect model,FEM)[22]。在合并效應量的檢驗(test for overall effect)中,若P≤0.05,則說明多個研究的合并統計量具有統計學意義。

分析結果用森林圖進行描述,并進行敏感性分析以確定結果是否穩健,通過對結果進行亞組分析,以探究異質性來源或亞組因素與結論的相關性。如果研究個數超過10個,需進行發表偏倚分析(publication bias analysis),通過繪制漏斗圖以檢驗納入文獻的發表偏倚[23],文獻是否存在實質的偏倚與漏斗圖的對稱性有關。

2 結果與分析

2.1 文獻檢索與篩選

本研究通過閱讀文獻題目和摘要后從3個中文數據庫(CNKI、CQVIP、Wanfang)、3個英文數據庫(Web of Science、PubMed、Scopus)中共檢索文獻620篇,無其他來源的研究。去重后得到文獻587篇,根據篩選標準進一步剔除后,對62篇文獻進行全文閱讀,最后共有16篇納入Meta分析,篩選流程如圖1所示。

圖1 Meta分析文獻篩選流程圖

2.2 納入文獻的基本特征

本研究納入的16篇文獻中,有10篇中文文獻和6篇英文文獻,分別來自中國(13篇)、德國(2篇)、巴西(1篇)。試驗研究對象均為泌乳期的健康荷斯坦奶牛,共計300頭。對照組為空白組,試驗組均為在基礎飼糧中添加FLAs,以全混合日糧(total mixed ration,TMR)形式飼喂。16篇研究中涉及了10種不同種類的FLAs。在試驗設計方法的選擇上,12篇研究采用隨機區組設計,4篇研究采用拉丁方設計。所納入的結局指標有:產奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、體細胞數、IgA含量、IgG含量、IgM含量。納入研究的基本特征如表2所示。

2.3 結局指標的Meta分析

2.3.1 添加FLAs對奶牛產奶量影響的森林圖、敏感性分析及亞組分析

所納入的16篇文獻中,均報道了添加FLAs對奶牛產奶量的影響。使用Review Manager 5.4軟件繪制森林圖,如圖2所示,結果表明,納入的研究間存在異質性,但異質性不顯著[P=0.04<0.10,自由度(df)=15,I2=43%<50%],奶牛產奶量與添加FLAs具有相關性(SMD=0.75,95%CI:0.37～1.12,P<0.000 1)。

Experimental:試驗組 experimental group;Control:對照組 control group;Std. Mean Difference:標準均值差 standardized mean difference;Study or Subgroup:研究或亞組 study or subgroup;Mean:平均值;SD:標準差 standard deviation;Total:樣本數 sample number;Weight:權重;IV:逆方差 inverse variance;Random:隨機;95%CI:95%置信區間 95% confidence interval;Heterogeneity:異質性;df:自由度 degree of freedom;Test for overall effect:合并效應量的檢驗;Favours [experimental]:試驗組獲益;Favours [control]:對照組獲益。圖7、圖12、圖17、圖22、圖27、圖30、圖35同 the same as Fig.7, Fig.12, Fig.17, Fig.22, Fig.27, Fig.30 and Fig.35。

本研究采用逐一剔除文獻的方法進行敏感性分析。使用Stata/MP 17.0軟件繪制敏感性分析圖,如圖3所示,可知在剔除任一個研究后的合并效應量的點估計仍落在總的合并效應量95%CI內,說明本項結局指標的合并結果是穩健的。

Meta-analysis estimates, given named study is omitted:Meta分析中忽略敏感分析圖命名;Lower CI Limit:置信區間下限 lower limit of confidence interval;Estimate:估計值 estimated value;Upper CI Limit:置信區間上限 upper limit of confidence interval。圖8、圖13、圖18、圖23、圖28、圖31、圖36同 the same as Fig.8, Fig.13, Fig.18, Fig.23, Fig.28, Fig.31 and Fig.36。

為進一步探究異質性來源或亞組因素與結論的相關性,分別根據FLAs種類、飼喂時長和添加劑量作亞組分析,使用Stata/MP 17.0軟件繪制亞組分析圖。

對不同種類FLAs的亞組分析結果如圖4所示。將納入文獻中涉及的11種FLAs按照不同種類分為3個亞組:槲皮素亞組(Quercetin亞組)、大豆黃酮亞組(Daidzein亞組)與混合物亞組(Blend亞組),將所納入研究中的2篇研究納入Quercetin亞組,包括蘆丁、槲皮素;7篇研究納入Daidzein亞組,包括大豆黃酮與大豆異黃酮;7篇研究納入Blend亞組,包括沙棘黃酮、竹葉提取物、辣木葉黃酮、柑橘黃酮、綠茶提取物、苜蓿黃銅與蜂膠提取物。結果顯示,Quercetin亞組I2=0,P=0.892;Blend亞組I2=38.9%,P=0.133;Daidzein亞組I2=18.0%,P=0.292,3個亞組的異質性均不顯著且低于42.7%,說明FLAs的不同種類可能是異質性來源之一。結果表明,在飼糧中添加的FLAs的主效成分為大豆黃酮或槲皮素時可提高奶牛產奶量(Quercetin亞組:SMD=1.58,95%CI:0.50～2.66;Blend亞組:SMD=0.33,95%CI:-0.18～0.85;Daidzein亞組:SMD=0.98,95%CI:0.52～1.44;組間異質性:P=0.058)。

Subgroup and study:亞組和研究;Effect:影響;95%CI:95%置信區間 95% confidence interval;Weight:權重;Quercetin:槲皮素亞組 quercetin subgroup;Blend:混合物亞組 blend subgroup;Daidzein:大豆黃酮亞組 daidzein subgroup;Subgroup:亞組;Heterogeneity between groups:組間異質性;Overall:總體;DL:Dersimonian-Laird隨機效應模型 Dersimonian-Laird random effect model。圖9、圖14、圖19、圖24、圖32同 the same as Fig.9, Fig.14, Fig.19, Fig.24 and Fig.32。

對FLAs不同飼喂時長的亞組分析結果如圖5所示。分為飼喂時長<30 d亞組和飼喂時長≥30 d亞組。結果顯示,飼喂時長<30 d亞組I2=0,P=0.523;飼喂時長≥30 d亞組I2=64.8%,P=0.006。飼喂時長≥30 d亞組的異質性顯著,說明FLAs的不同飼喂時長不是異質性的來源。結果表明,以不同時長飼喂奶牛FLAs都可提高奶牛的產奶量,且飼喂時長≥30 d的效果更佳(飼喂時長<30 d亞組:SMD=0.71,95%CI:0.31～1.10;飼喂時長≥30 d亞組:SMD=0.77,95%CI:0.13～1.42;組間異質性:P=0.864)。

Subgroup and study:亞組和研究;Effect:影響;95%CI:95%置信區間 95% confidence interval;Weight:權重;<30d:飼喂時長<30 d亞組 feeding time <30 d subgroup;≥30d:飼喂時長≥30 d亞組 feeding time≥30 d subgroup;Subgroup:亞組;Heterogeneity between groups:組間異質性;Overall:總體;DL:Dersimonian-Laird隨機效應模型 Dersimonian-Laird random effect model。圖10、圖15、圖20、圖25、圖33同 the same as Fig.10, Fig.15, Fig.20, Fig.25 and Fig.43。

對FLAs不同添加劑量的亞組分析結果如圖6所示,D1、D2、D3表示同一研究中FLAs的不同添加劑量。將各研究的試驗組與對照組分為添加劑量<20 mg/kg亞組、添加劑量≥20 mg/kg且<50 mg/kg亞組、添加劑量≥50 mg/kg且<100 mg/kg亞組以及添加劑量≥100 mg/kg亞組。結果顯示,添加劑量<20 mg/kg亞組I2=0.3%,P=0.426;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組I2=61.4%,P=0.005;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組I2=8.3%,P=0.359;添加劑量≥100 mg/kg亞組I2=0,P=0.520。添加劑量≥20且<50mg/kg亞組的異質性顯著,說明FLAs的不同添加劑量不是異質性的來源。結果表明,以不同添加劑量飼喂奶牛FLAs都可提高奶牛的產奶量,其中添加劑量在20～50 mg/kg時效果更佳(添加劑量<20 mg/kg亞組:SMD=1.03,95%CI:0.60～1.46;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組:SMD=1.04,95%CI:0.38～1.70;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組:SMD=0.60,95%CI:0.07～1.13;添加劑量≥100 mg/kg亞組:SMD=0.61,95%CI:0.27～0.94;組間異質性:P=0.344)。

Subgroup and study:亞組和研究;Effect:影響;95%CI:95%置信區間 95% confidence interval;Weight:權重;<20:添加劑量<20 mg/kg亞組 adding does <20 mg/kg subgroup;≥20,<50:添加劑量≥20 mg/kg且<50 mg/kg亞組 adding does ≥20 mg/kg and <50 mg/kg subgroup;≥50,<100:添加劑量≥50 mg/kg且<100 mg/kg亞組 adding does ≥50 mg/kg and <100 mg/kg subgroup;≥100:添加劑量≥100 mg/kg亞組 adding does ≥100 mg/kg subgroup;Heterogeneity between groups:組間異質性;Overall:總體;DL:Dersimonian-Laird隨機效應模型 Dersimonian-Laird random effect model;D1、D2、D3表示同一研究中FLAs的不同添加劑量 D1, D2 and D3 represent different adding does of FLAs in the same study。圖11、圖16、圖21、圖26、圖29、圖34、圖37同 the same as Fig.11, Fig.16, Fig.21, Fig.26, Fig.29, Fig.34, Fig.37。

2.3.2 添加FLAs對奶牛乳脂率影響的森林圖、敏感性分析及亞組分析

所納入的16篇文獻中,有15篇報道了添加FLAs對奶牛乳脂率的影響。如圖7所示,結果表明,納入的研究間存在異質性且異質性顯著(P<0.000 1,df=14,I2=78%>50%),添加FLAs的奶牛的乳脂率與對照組無顯著差異(SMD=-0.27,95%CI:-0.87～0.34,P=0.390 0)。

圖7 FLAs對奶牛乳脂率影響的森林圖

采用逐一剔除文獻的方法進行敏感性分析。如圖8所示,可知在剔除任一個研究后的合并效應量的點估計仍落在總的合并效應量95%CI內,說明本項結局指標的合并結果是穩健的。

圖8 FLAs對奶牛乳脂率影響的敏感性分析圖

對不同種類FLAs的亞組分析結果如圖9所示。結果顯示,Quercetin亞組I2=65.7%,P=0.088;Blend亞組I2=72.2%,P=0.003;Daidzein亞組I2=84.7%,P<0.001。3個亞組的異質性均顯著,說明FLAs種類不是異質性的來源,且飼喂FLAs的種類對奶牛乳脂率的影響無統計學意義(Quercetin亞組:SMD=-1.05,95%CI:-2.84～0.74;Blend亞組:SMD=-0.06,95%CI:-0.86～0.73;Daidzein亞組:SMD=-0.29,95%CI:-1.37～0.79,組間異質性:P<0.001)。

圖9 FLAs的不同種類對奶牛乳脂率影響的亞組分析圖

對FLAs不同飼喂時長的亞組分析結果如圖10所示。結果顯示,飼喂時長<30 d亞組I2=75.3%,P<0.001;飼喂時長≥30 d亞組I2=80.1%,P<0.001。2個亞組的異質性均顯著,說明在飼喂FLAs情況下,不同飼喂時長不是異質性的來源,且以飼喂FLAs的時長對奶牛乳脂率的影響無統計學意義(飼喂時長<30 d亞組:SMD=-0.01,95%CI:-0.87～0.85;飼喂時長≥30 d亞組:SMD=-0.49,95%CI:-1.36～0.39,組間異質性:P<0.001)。

圖10 FLAs的不同飼喂時長對奶牛乳脂率影響的亞組分析圖

對FLAs不同添加劑量的亞組分析結果如圖11所示。結果顯示,添加劑量<20 mg/kg亞組I2=74.2%,P=0.001;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組I2=54.4%,P=0.020;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組I2=0,P=0.465;添加劑量≥100 mg/kg亞組I2=69.9%,P=0.001。3個亞組的異質性顯著,說明FLAs的不同添加劑量不是異質性的來源,且FLAs的添加劑量對奶牛乳脂率的影響無統計學意義(添加劑量<20 mg/kg亞組:SMD=-0.60,95%CI:-1.50～0.29;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組:SMD=-0.54,95%CI:-1.09～0.01;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組:SMD=-0.30,95%CI:-0.79～0.19;添加劑量≥100 mg/kg亞組:SMD=0.50,95%CI:-0.14～1.14,組間異質性:P<0.001)。

圖11 FLAs的不同添加劑量對奶牛乳脂率影響的亞組分析圖

2.3.3 添加FLAs對奶牛乳蛋白率影響的森林圖、敏感性分析及亞組分析

所納入的16篇文獻中,有15篇報道了添加FLAs對奶牛乳蛋白率的影響。如圖12所示,結果表明,納入的研究間存在異質性,但異質性不顯著(P=0.06<0.10,df=14,I2=39%<50%),奶牛乳蛋白率與添加FLAs具有相關性(SMD=0.69,95%CI:0.33～1.06,P=0.000 2)。

圖12 FLAs對奶牛乳蛋白率影響的森林圖

采用逐一剔除文獻的方法進行敏感性分析。如圖13所示,可知在剔除任一個研究后的合并效應量的點估計仍落在總的合并效應量95%CI內,說明本項結局指標的合并結果是穩健的。

圖13 FLAs對奶牛乳蛋白率影響的敏感性分析圖

對不同種類FLAs的亞組分析結果如圖14所示。結果顯示,Quercetin亞組I2=0,P=0.370;Blend亞組I2=60.7%,P=0.026;Daidzein亞組I2=8.4%,P=0.364。Blend亞組的異質性顯著,說明FLAs的不同種類不是異質性的來源。結果表明,當添加的FLAs的主效成分為大豆黃酮或槲皮素時可以提高奶牛乳蛋白率(Quercetin亞組:SMD=1.19,95%CI:0.17～2.20;Blend亞組:SMD=0.49,95%CI:-0.22～1.19;Daidzein亞組:SMD=0.79,95%CI:0.37～1.20,組間異質性:P=0.529)。

圖14 FLAs的不同種類對奶牛乳蛋白率影響的亞組分析圖

對FLAs不同飼喂時長的亞組分析結果如圖15所示。結果顯示,飼喂時長<30 d亞組I2=40.5%,P=0.121;飼喂時長≥30 d亞組I2=45.5%,P=0.076。2個亞組的異質性均不顯著,但大于39.2%,說明FLAs的不同飼喂時長不是異質性的來源。結果表明,以不同時長飼喂奶牛FLAs都可提高奶牛的乳蛋白率,且飼喂時長≥30 d的效果更佳(飼喂時長<30 d亞組:SMD=0.69,95%CI:0.12～1.27;飼喂時長≥30 d亞組:SMD=0.70,95%CI:0.19～1.21,組間異質性:P=0.991)。

對FLAs不同添加劑量的亞組分析結果如圖16所示。結果顯示,添加劑量<20 mg/kg亞組I2=0,P=0.701;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組I2=72.8%,P<0.001;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組I2=78.4%,P=0.001;添加劑量≥100 mg/kg亞組I2=59.6%,P=0.011。3個亞組的異質性顯著,說明FLAs的不同添加劑量不是異質性的來源。結果表明,當FLAs的添加劑量在20～50 mg/kg時可以提高奶牛乳蛋白率(添加劑量<20 mg/kg亞組:SMD=0.18,95%CI:-0.22～0.59;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組:SMD=0.99,95%CI:0.19～1.79;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組:SMD=0.95,95%CI:-0.38～2.27;添加劑量≥100 mg/kg亞組:SMD=0.40,95%CI:-0.16～0.96,組間異質性:P=0.278)。

圖16 FLAs的不同添加劑量對奶牛乳蛋白率影響的亞組分析圖

2.3.4 添加FLAs對奶牛乳糖率影響的森林圖、敏感性分析及亞組分析

所納入的16篇文獻中,有9篇報道了添加FLAs對奶牛乳糖率的影響。如圖17所示,結果表明,納入的研究間存在異質性且異質性顯著(P=0.002<0.10,df=8,I2=67%>50%),添加FLAs的奶牛的乳糖率與對照組無顯著差異(SMD=-0.08,95%CI:-0.71～0.55,P=0.80)。

圖17 FLAs對奶牛乳糖率影響的森林圖

采用逐一剔除文獻的方法進行敏感性分析。如圖18所示,可知在剔除任一個研究后的合并效應量的點估計仍落在總的合并效應量95%CI內,說明本項結局指標的合并結果是穩健的。

圖18 FLAs對奶牛乳糖率影響的敏感性分析圖

對不同種類FLAs的亞組分析結果如圖19所示。結果顯示,Quercetin亞組I2=0,P=0.620;Blend亞組I2=75.3%,P=0.001,Blend亞組的異質性顯著,說明FLAs種類不是異質性的來源,且飼喂FLAs的種類對奶牛乳糖率的影響無統計學意義(Quercetin亞組:SMD=-0.58,95%CI:-1.49～0.34;Blend亞組:SMD=0.26,95%CI:-0.61～1.14,組間異質性:P=0.158)。

圖19 FLAs的不同種類對奶牛乳糖率影響的亞組分析圖

對FLAs不同飼喂時長的亞組分析結果如圖20所示。結果顯示,飼喂時長<30 d亞組I2=64.4%,P=0.038;飼喂時長≥30d亞組I2=55.4%,P=0.062。2個亞組的異質性均顯著,說明FLAs的不同飼喂時長不是異質性的來源,且飼喂FLAs的時長對奶牛乳糖率的影響無統計學意義(飼喂時長<30 d亞組:SMD=0.42,95%CI:-0.58～1.42;飼喂時長≥30 d亞組:SMD=-0.49,95%CI:-1.19～0.20,組間異質性:P=0.140)。

圖20 FLAs的不同飼喂時長對奶牛乳糖率影響的亞組分析圖

對FLAs不同添加劑量的亞組分析結果如圖21所示。結果顯示,添加劑量<20 mg/kg亞組I2=86.9%,P<0.001;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組I2=0,P=0.393;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組I2=49.4%,P=0.115;添加劑量≥100 mg/kg亞組I2=79.3%,P<0.001。添加劑量<20 mg/kg亞組和添加劑量≥100 mg/kg亞組的異質性顯著,說明FLAs的不同添加劑量不是異質性的來源,且FLAs的添加劑量對奶牛乳糖率的影響無統計學意義(添加劑量<20 mg/kg亞組:SMD=-0.26,95%CI:-2.00～1.49;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組:SMD=-0.48,95%CI:-0.97～0.01;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組:SMD=0.70,95%CI:-0.14～1.55;添加劑量≥100 mg/kg亞組:SMD=0.81,95%CI:-0.12～1.75,組間異質性:P=0.026)。

圖21 FLAs的不同添加劑量對奶牛乳糖率影響的亞組分析圖

2.3.5 添加FLAs對牛奶體細胞數影響的森林圖、敏感性分析及亞組分析

所納入的16篇文獻中,有8篇報道了添加FLAs對牛奶體細胞數的影響。如圖22所示,結果表明,納入的研究間存在異質性且異質性顯著(P=0.03<0.10,df=7,I2=54%>50%),牛奶體細胞數與添加FLAs具有相關性(SMD=-1.22,95%CI:-1.87～-0.56,P=0.000 3)。

圖22 FLAs對牛奶體細胞數影響的森林圖

采用逐一剔除文獻的方法進行敏感性分析。如圖23所示,可知在剔除任一個研究后的合并效應量的點估計仍落在總的合并效應量95%CI內,說明本項結局指標的合并結果是穩健的。

圖23 FLAs對牛奶體細胞數影響的敏感性分析圖

對不同種類FLAs的亞組分析結果如圖24所示。結果顯示,Blend亞組I2=53.2%,P=0.058;Daidzein亞組I2=0,P=0.483。Blend亞組的異質性顯著,說明FLAs的不同種類不是異質性的來源。結果表明,在飼糧中添加FLAs可以降低牛奶體細胞數,且以大豆黃酮作為添加劑時的效果更佳(Blend亞組:SMD=-0.98,95%CI:-1.72～-0.23;Daidzein亞組:SMD=-1.89,95%CI:-2.77～-1.00,組間異質性:P=0.123)。

圖24 FLAs的不同種類對牛奶體細胞數影響的亞組分析圖

對FLAs不同飼喂時長的亞組分析結果如圖25所示。結果顯示,飼喂時長<30 d亞組I2=0,P=0.930;飼喂時長≥30 d亞組I2=78.9%,P=0.003。飼喂時長≥30 d亞組的異質性顯著,說明FLAs的不同飼喂時長不是異質性的來源。結果表明,FLAs的飼喂時長<30 d可以降低牛奶體細胞數,但飼喂時長≥30 d對牛奶體細胞數的影響無統計學意義(飼喂時長<30 d亞組:SMD=-1.28,95%CI:-1.91～-0.65;飼喂時長≥30 d亞組:SMD=-1.30,95%CI:-2.65～0.05,組間異質性:P=0.978)。

圖25 FLAs的不同飼喂時長對牛奶體細胞數影響的亞組分析圖

對FLAs不同添加劑量的亞組分析結果如圖26所示。結果顯示,添加劑量<20 mg/kg亞組I2=0,P=0.828;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組I2=15.1%,P=0.317;添加劑量≥50且<100mg/kg亞組I2=0,P=0.596;添加劑量≥100mg/kg亞組I2=77.6%,P<0.001。添加劑量≥100 mg/kg亞組的異質性顯著,說明FLAs的不同添加劑量不是異質性的來源。結果表明,以不同添加劑量飼喂奶牛FLAs都可降低奶牛的體細胞數,其中添加劑量在20～50 mg/kg時效果更佳(添加劑量<20 mg/kg亞組:SMD=-1.51,95%CI:-2.11～-0.91;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組:SMD=-1.94,95%CI:-2.73～-1.14;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組:SMD=-1.42,95%CI:-2.06～-0.78;添加劑量≥100 mg/kg亞組:SMD=-1.26,95%CI:-2.20～-0.32,組間異質性:P=0.696)。

圖26 FLAs的不同添加劑量對牛奶體細胞數影響的亞組分析圖

2.3.6 添加FLAs對奶牛血清中IgA含量影響的森林圖、敏感性分析及亞組分析

所納入的16篇文獻中,有4篇文獻報道了添加FLAs對奶牛血清中IgA含量的影響,因為報道的篇數少于5篇,不足以對FLAs的種類與飼喂時長作亞組分析,且采用固定效應模型計算合并統計量[22]。森林圖如圖27所示。結果表明,納入的研究間存在異質性,但異質性不顯著(P=0.21>0.10,df=3,I2=34%<50%),奶牛血清中IgA含量與添加FLAs具有相關性(SMD=0.68,95%CI:0.12～1.24)。

圖27 FLAs對奶牛血清中IgA含量影響的森林圖

采用逐一剔除文獻的方法進行敏感性分析。如圖28所示,可知在剔除任一個研究后的合并效應量的點估計仍落在總的合并效應量95%CI內,說明本項結局指標的合并結果是穩健的。

圖28 FLAs對奶牛血清中IgA含量影響的敏感性分析圖

對FLAs不同添加劑量的亞組分析結果如圖29所示。結果顯示,添加劑量<20 mg/kg亞組I2=0,P=0.818;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組I2=40.4%,P=0.195;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組I2=11.0%,P=0.325;添加劑量≥100mg/kg亞組I2=66.9%,P=0.029。添加劑量≥100 mg/kg亞組的異質性顯著,說明FLAs的不同添加劑量不是異質性的來源。結果表明,當FLAs的添加劑量在50～100 mg/kg時可以提高奶牛血清中IgA含量(添加劑量<20 mg/kg亞組:SMD=0.37,95%CI:-0.26～0.99;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組:SMD=1.03,95%CI:-0.26～2.31;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組:SMD=1.73,95%CI:0.80～2.65;添加劑量≥100 mg/kg亞組:SMD=0.33,95%CI:-0.89～1.56,組間異質性:P=0.098)。

圖29 FLAs的不同添加劑量對奶牛血清中IgA含量影響的亞組分析圖

2.3.7 添加FLAs對奶牛血清中IgG含量影響的森林圖、敏感性分析及亞組分析

所納入的16篇文獻中,有5篇文獻報道了添加FLAs對奶牛血清中IgG含量的影響。如圖30所示,結果表明,納入的研究間存在異質性且異質性顯著(P=0.01<0.10,df=4,I2=70%>50%),添加FLAs的奶牛血清中IgG含量與對照組無顯著差異(SMD=0.71,95%CI:-0.40～1.82,P=0.21)。

圖30 FLAs對奶牛血清中IgG含量影響的森林圖

采用逐一剔除文獻的方法進行敏感性分析。如圖31所示,可知在剔除任一個研究后的合并效應量的點估計仍落在總的合并效應量95%CI內,說明本項結局指標的合并結果是穩健的。

圖31 FLAs對奶牛血清中IgG含量影響的敏感性分析圖

對不同種類FLAs的亞組分析結果如圖32所示。結果顯示,Blend亞組I2=77.5%,P=0.012;Daidzein亞組I2=0,P=0.843。Blend亞組的異質性顯著,說明FLAs的不同種類不是異質性的來源。結果表明,在飼糧中添加的FLAs的主效成分為大豆黃酮時可提高奶牛血清中IgG含量(Blend亞組:SMD=0.45,95%CI:-1.30～2.19;Daidzein亞組:SMD=1.26,95%CI:0.38～2.13,組間異質性:P=0.415)。

對FLAs不同飼喂時長的亞組分析結果如圖33所示。結果顯示,飼喂時長<30 d亞組I2=10.1%,P=0.329;飼喂時長≥30 d亞組I2=46.2%,P=0.173。2個亞組的異質性均不顯著,說明FLAs的不同飼喂時長可能是異質性的來源之一。結果表明,FLAs的飼喂時長≥30 d可以提高奶牛血清中IgG含量,但飼喂時長<30 d對IgG含量的影響無統計學意義(飼喂時長<30 d亞組:SMD=-0.17,95%CI:-0.96～0.62;飼喂時長≥30 d亞組:SMD=1.83,95%CI:0.37～3.28,組間異質性:P=0.018)。

圖33 FLAs的不同飼喂時長對奶牛血清中IgG含量影響的亞組分析圖

對FLAs不同添加劑量的亞組分析結果如圖34所示。結果顯示,添加劑量<20 mg/kg亞組I2=0,P=0.716;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組I2=44.1%,P=0.147;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組I2=78.2%,P=0.010;添加劑量≥100 mg/kg亞組I2=76.5%,P=0.005。添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組與添加劑量≥100 mg/kg亞組的異質性顯著,說明FLAs的不同添加劑量不是異質性的來源。結果表明,當FLAs的添加劑量<20 mg/kg時可以提高奶牛血清中IgG含量(添加劑量<20 mg/kg亞組:SMD=1.09,95%CI:0.46～1.73;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組:SMD=0.82,95%CI:-0.21～1.85;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組:SMD=1.00,95%CI:-0.84～2.83;添加劑量≥100 mg/kg亞組:SMD=0.93,95%CI:-0.62～2.47,組間異質性:P=0.977)。

圖34 FLAs的不同添加劑量對奶牛血清中IgG含量影響的亞組分析圖

2.3.8 添加FLAs對奶牛血清中IgM含量影響的森林圖、敏感性分析及亞組分析

所納入的16篇文獻中,有4篇文獻報道了添加FLAs對奶牛血清中IgM含量的影響,因為報道的篇數少于5篇,不足以對FLAs的種類與飼喂時長作亞組分析,且采用固定效應模型計算合并統計量。如圖35所示,結果表明,納入的研究間存在異質性且異質性顯著(P=0.105>0.10,df=3,I2=51%>50%),添加FLAs的奶牛血清中IgM含量與對照組無顯著差異(SMD=-0.05,95%CI:-0.59～0.50,P=0.87)。

圖35 FLAs對奶牛血清中IgM含量影響的森林圖

采用逐一剔除文獻的方法進行敏感性分析。如圖36所示,可知在剔除任一個研究后的合并效應量的點估計仍落在總的合并效應量95%CI內,說明本項結局指標的合并結果是穩健的。

圖36 FLAs對奶牛血清中IgM含量影響的敏感性分析圖

對FLAs不同添加劑量的亞組分析結果如圖37所示。結果顯示,添加劑量<20 mg/kg亞組I2=0,P=1.000;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組I2=0,P=0.072;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組I2=75.3%,P=0.017;添加劑量≥100 mg/kg亞組I2=30.3%,P=0.230。添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組的異質性顯著,說明FLAs的不同添加劑量不是異質性的來源,且FLAs的添加劑量對奶牛血清中IgM含量的影響無統計學意義(添加劑量<20 mg/kg亞組:SMD=0.10,95%CI:-0.52～0.72;添加劑量≥20且<50 mg/kg亞組:SMD=-0.03,95%CI:-0.78～0.71;添加劑量≥50且<100 mg/kg亞組:SMD=0.08,95%CI:-1.49～1.64;添加劑量≥100 mg/kg亞組:SMD=0.31,95%CI:-0.43～1.06)。

圖37 FLAs的不同添加劑量對奶牛血清中IgM含量影響的亞組分析圖

2.4 發表偏倚評價

對結局指標中的奶牛產奶量、乳脂率和乳蛋白率進行發表偏倚評估,如圖38所示。評估結果顯示,乳脂率的漏斗圖存在一定程度的不對稱性,說明乳脂率的Meta分析結果存在發表偏倚,可能是由于納入文獻量較少或樣本量不足導致的。產奶量與乳蛋白率的評價結果中代表研究結果的圓點較為集中,且基本對稱,說明Meta分析納入的研究同質性較好,沒有觀察到顯著的發表偏倚,證實了研究結果的穩定性。

Funnel plot with pseudo 95% confidence limits:95%置信區間漏斗圖;Effect size:效應量;Standard error of effect size:效應量的標準誤差。A:產奶量 Milk yield;B:乳脂率 Milk fat rate;C:乳蛋白率 Milk protein rate。

3 討 論

目前,在針對飼糧中添加FLAs對奶牛生產性能和血清免疫指標的研究中,受諸多相關因素影響,各研究結果并不一致。因此,本研究以健康荷斯坦奶牛為研究對象,納入2001年以來的相關文獻進行Meta分析,全面系統評價FLAs對奶牛的應用效果。

3.1 FLAs對奶牛生產性能的影響

產奶量是評定奶牛生產性能的重要指標[40]。本研究Meta分析結果表明,飼糧中添加FLAs可以有效提高奶牛產奶量。在單獨觀測不同的FLAs種類、飼喂時長與添加劑量方面,亞組分析結果表明,FLAs主效成分為大豆黃酮、飼喂時長≥30 d、添加劑量在20～50 mg/kg的單個亞組對產奶量的提高效果優于其他分組。沈菲[25]研究發現,補飼30 mg/kg的大豆異黃酮60 d,能夠使奶牛日平均產奶量提高20.77%,而占今舜等[41]分別飼喂40 mg/kg與200 mg/kg苜蓿黃酮24 d,產奶量分別提高了7.96%與6.49%,均低于20.77%。近年來,FLAs對奶牛產奶量影響的研究主要圍繞天然植物提取物展開,不同提取物中FLAs在不同劑量與飼喂時長下對產奶量影響的效果也不同,本研究在宏觀層面對海量的數據進行統計,但并不代表著優勢亞組的條件是絕對適用的,需要在FLAs的結構、有效含量、主效成分、生物利用度、生物適用性等方面多重考慮。例如在飼糧中補充黃岑提取物能夠使奶牛的全周期泌乳量提高約13%[42],而在飼糧中補充柑橘提取物則對產奶量無顯著影響[12]。而且在飼喂時長≥30 d的情況下,Gessner等[36]的研究異質性較大,可能是添加FLAs的有效成分較低導致的,這也證明了以上結論。所以,對天然植物提取物成分進行深度挖掘、完善植物中FLAs的成分檢測,是未來反芻動物飼糧添加劑的研發過程中的一個重要方向。

乳脂率、乳蛋白率與乳糖率是衡量牛奶品質高低的重要指標[43-45],FLAs對乳品質的改善能力在不同的指標中也存在差異。研究對乳脂率的亞組分析結果表明,飼糧中添加的FLAs種類與飼喂時長對奶牛乳脂率無顯著影響,當FLAs添加劑量≥100 mg/kg時,奶牛乳脂率有升高趨勢。張一涵等[24]研究發現,在荷斯坦奶牛飼糧中添加160 mg/kg的沙棘黃酮后奶牛乳脂率顯著升高;賈若愚等[46]研究發現,在荷斯坦奶牛飼糧中添加110 mg/kg的竹提取物會顯著升高奶牛的乳脂率,以上研究結果均與本文結果一致。多數關于FLAs對奶牛乳蛋白率影響的試驗結果表明,FLAs可有效提高荷斯坦奶牛乳蛋白率,例如:在飼糧中分別添加30 mg/kg的大豆異黃酮與28 mg/kg的槲皮素均可顯著提高奶牛的乳蛋白率[25,39],且奶牛乳蛋白率會隨著杜仲提取物的使用時間延長有增加的趨勢[47],均與本研究所得結果一致。如今,乳制品行業對生產適合乳糖不耐癥患者飲用的低乳糖牛奶表現出濃厚興趣[48],關于飼料添加劑對奶牛乳糖率影響的研究也受到廣泛關注。在本研究中,當剔除栗明月等[26]異質性較大的研究時,發現FLAs的不同飼喂時長可能是異質性來源之一。當FLAs的添加劑量≥50 mg/kg時乳糖率有升高趨勢,郭玉新[11]在飼糧中補充60 mg/kg的王不留行提取物30 d,牛奶中乳糖含量提高了1.3%,但國內外對王不留行單獨應用于畜禽飼料的研究報道很少,且其中黃酮苷的含量及作用機理也需進一步探究。

奶牛乳房炎是導致奶牛產奶量和繁殖性能下降的重要原因[49],在控制牛奶的乳脂、乳蛋白等指標的同時,更要做好對體細胞數的監控[50]。Meta分析結果表明,飼糧中添加FLAs可有效降低牛奶體細胞數。當剔除張一涵等[24]異質性較大的研究時,發現FLAs的不同飼喂時長可能是異質性來源之一。當飼喂時長≥30 d時,牛奶體細胞數有降低趨勢。Liu等[51]在荷斯坦奶牛飼糧中添加大豆黃酮提高了4%標準乳產量并降低乳中體細胞數;鄒阿玲等[52]研究發現,對奶牛補飼恰麻古90 d后乳中體細胞數平均值顯著低于對照組,與本研究亞組分析結果一致。

3.2 FLAs對奶牛血清免疫指標的影響

特異性免疫球蛋白普遍存在于動物血液中[53],主要參與體液免疫的過程,其含量可以反映機體的免疫狀態[54]。IgA主要參與對黏膜的保護作用,IgG與IgM在抵御感染的免疫應答中起著重要作用,其中IgM是抵御感染的第1道防線[55]。本研究Meta分析結果表明,飼糧中添加FLAs可以有效提高奶牛血清中IgA含量。李杰等[56]研究表明,在補飼當歸提取物后奶牛血清中IgA含量顯著升高,研究結果與本文結論一致。對血清中IgG含量的亞組分析結果顯示,提高奶牛血清中IgG含量的最適飼喂時長為≥30 d,最適FLAs添加劑量為<50 mg/kg。研究發現,在對奶牛補飼絲蘭提取物60 d后發現血清中IgG含量顯著升高[57],低添加劑量的苜蓿黃酮可以提高奶牛血清中IgG含量[37],與本研究亞組分析結果一致。對血清中IgM含量的Meta分析結果顯示,飼糧中添加FLAs對血清中IgM含量無顯著影響。栗明月[58]研究表明,補飼竹葉提取物可顯著升高奶牛血清中IgM含量;Abouzed等[59]研究表明,在奶牛飼糧中添加富含黃酮的木瓜提取物也可使血清中IgM含量增高,與Meta分析結果不一致的原因可能是可能由于本研究在對血清中IgM含量的Meta分析中所納入文獻較少,無法對添加FLAs與血清中IgM含量的相關性做出具體評價,而天然植物提取物中發揮主效作用的物質也有待進一步探究。

3.3 本研究的局限性

本研究仍存在一定的局限性:首先,本研究在分析FLAs對奶牛血清免疫指標的影響中所納入的文獻數量較少,可能會對Meta分析結果造成影響,這與目前FLAs對于奶牛的研究主要集中在產奶量及乳成分等常規指標上有關,未來還需進一步加強對血清免疫、氧化指標及乳中營養物質的研究。其次,各項研究所添加的FLAs的主效成分差異較大,可能造成某項結局指標的樣本間異質性較大而導致Meta分析結果存在潛在異質性。因此,未來需要深入研究不同品種的FLAs的主效成分,并改進FLAs的質量評估方法,以確保FLAs在奶牛生產中得以有效應用。另外,研究缺少質量評估標準,無法客觀驗證試驗結果的科學性,因此本研究也需要進一步優化文獻的檢索與篩選流程,拓寬數據采集途徑,細化亞組因素以通過亞組分析更全面地探究異質性來源,提高亞組因素與結論的相關性,進一步驗證研究結果。

4 結 論

采用Meta分析方法,可以從統計層面有效評價FLAs對奶牛生產性能及血清免疫指標的影響,為FLAs應用于奶牛生產實際奠定了堅實的理論基礎。本研究結果表明,在飼糧中添加FLAs可以有效提高奶牛產奶量、乳蛋白率及血清中IgA含量,有效降低牛奶體細胞數。本研究結論為在飼糧中添加FLAs改善奶牛生產性能和血清免疫指標提供了堅實的理論基礎。