椎間盤丸治療腰椎間盤退變的網絡藥理學和生物信息學研究

陳璐璐,李 洋,呂文娟,張 迪

(河南省洛陽正骨醫院 河南省骨科醫院脊柱外三科,鄭州 450000)

下腰痛(low back pain, LBP)是脊柱外科最常見的疾病之一,在成年人群中,LBP的發病率為10%～30%,65%～80%的人在一生中曾受到LBP的困擾[1]。LBP嚴重影響患者的生活質量,降低患者的勞動能力,給家庭和社會造成巨大的負擔。引起LBP的原因有很多,其中腰椎間盤退變是最常見原因之一[2]。大部分腰椎間盤源性LBP經6～12周的保守治療可以取得滿意的效果[3-4]。椎間盤源性LBP的保守治療方法包括臥床休息[5]、藥物治療[6]、運動療法[7]、硬膜外注射[8]、腰椎牽引[9]、手法治療[10]等。但是經保守治療后臨床癥狀的復發率仍高達25%[3]。此外,治療椎間盤源性LBP的藥物多為對癥治療,且長時間使用均存在或多或少的不良反應。中藥在臨床上被廣泛應用于腰椎間盤退變性疾病地治療,并取得了不錯的臨床效果[11-12]。椎間盤丸(zhuijianpan pill,ZJPW)是河南省洛陽正骨醫院治療腰椎間盤退變的協定處方,該方由當歸、桂枝、細辛、黃芪、白芍、延胡索、威靈仙、五加皮、牛膝、甘草等藥物組成,具有溫通經脈、養血散寒、理氣止痛之功效。ZJPW在臨床應用中取得了良好的療效,但是其抑制腰椎間盤退變的分子機制尚未完全闡明。

網絡藥理學是近年來發展起來的新興學科,其以系統生物學為基礎,整合了系統生物學、多向藥理學、生物信息學和計算機科學,為尋找藥物分子和疾病的相互關系提供了新的手段[13]。中醫理論注重整體觀念,而單一的藥物成分研究不能充分揭示中藥的作用機制,因此運用網絡藥理學技術挖掘復方中藥治療疾病的分子機制逐漸受到廣大臨床醫生的關注。本研究運用網絡藥理學的方法篩選ZJPW治療腰椎間盤退變的主要成分和作用靶點,并利用分子對接技術進行驗證。最后使用CIBERSORT工具計算免疫細胞與致病基因的相關性,從免疫浸潤角度探討藥物作用的分子機制。為ZJPW用于腰椎間盤退變的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 ZJPW有效活性成分的確定 按照既往文獻的方法[14],使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)篩選ZJPW組方中10味中藥當歸、桂枝、細辛、黃芪、白芍、延胡索、威靈仙、五加皮、牛膝、甘草的有效成分。以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%,類藥性(drug-likeness,DL)>0.18為標準篩選出該組方中可能有效的化學成分。在TCMSP數據庫和drugbank數據庫(https://go.drugbank.com/)中檢索這些活性成分對應的蛋白質靶點。最后利用蛋白質數據庫UniProt(https://www.uniprot.org/)將蛋白靶點轉換成對應的基因名稱,得到ZJPW中各藥物成分的靶點基因。

1.2 獲取腰椎間盤退變的相關基因 在GeneCards數據庫(https://www.Genecards.org)、靶向治療數據庫(therapeutic target Database,TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)和藥物基因組學知識庫(pharmacogenomics knowledgebase,PharmGKB)(https://www.pharmgkb.org/)中檢索腰椎間盤退變的致病基因,合并并刪除重復基因。以nucleus pulposus[All Fields] AND “Homo sapiens”[porgn] AND “Expression profiling by array”[Filter]為檢索式在GEO數據庫中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)進行檢索,選擇GSE15227作為研究對象,提取椎間盤Ⅱ級退變樣本5個,Ⅳ級退變樣本3個,以P<0.05和log|FC|>1為標準篩選差異表達基因。將篩選出的差異表達基因與之前獲得的致病基因取交集,得到腰椎間盤退變的致病基因。再將藥物靶點基因和致病基因取交集,最終得到ZJPW有效成分的作用靶點。

1.3 構建“藥物-成分-作用靶點”關系網絡 將藥物、活性成分和作用靶點之間的關系導入Cytoscape 3.9.1 軟件,構建“藥物-成分-作用靶點”網絡,用“節點”表示藥物、活性成分和作用靶點,用“邊”表示節點之間的相互作用,節點大小和邊的粗細表示度值的大小。

1.4 基因本體論(gene ontology,GO)功能和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopediaof genesand genome,KEGG)富集分析 使用R 軟件的“clusterProfiler”包和“pathview”包對ZJPW治療腰椎退變的靶點基因進行GO和KEGG富集分析。其中GO分析包括生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC) 和分子功能(molecular function,MF)3部分。以FDR<0.05作為GO和KEGG富集分析的篩選條件,取排名靠前的10個條目分別繪制氣泡圖。對GSE15227的全部基因進行差異分析后,以“c2.cp.v7.2.symbols.gmt”為參考基因集,以FDR<0.25且p.adjust<0.05為條件進行GSEA富集分析。

1.5 構建蛋白質- 蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡 在STRING 數據庫中,以置信度分數(Score)> 0.9 為篩選條件,構建PPI網絡。將得到的tsv文件導入Cytoscape3.9.1 軟件,分別使用CytoNCA插件(以度值進行排序,取度值>10的基因)和MCODE插件(以節點評分cut-off值=0.2、K-Core值=2、度值cut-off =2為默認參數進行聚類關聯分析,取得分最高的聚類)篩選ZJPW治療腰椎間盤退變的關鍵基因。將兩種方法篩選得到的關鍵基因取交集,最終得到的交集基因被認為是ZJPW治療腰椎間盤退變的Hub基因。

1.6 分子對接驗證 選取“藥物-成分-作用靶點”網絡中連接度值排名前10 位的活性成分分別與Hub基因進行分子對接驗證。在PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載前10位活性成分的2D 結構并進行3D轉換。在PDB 數據庫(https://www.rcsb.org/)下載Hub基因對應蛋白的3D 結構,利用Pymol 軟件和AutodockTools-1.5.6軟件處理后保存為pdbqt 格式。在AutodockTools-1.5.6 軟件中設置蛋白受體的口袋參數,通過AutodockVina進行分子對接,在分子對接過程中結合能越低代表受體與配體的親和力越好。將分子對接的結合能進行評分并繪制熱圖。

1.7 免疫浸潤分析 將從GEO數據庫獲得的基因表達譜數據上傳到CIBERSORT網站,得到免疫細胞浸潤矩陣。使用“ggplot2”包繪制Ⅱ級退變組和Ⅳ級退變組免疫細胞浸潤差異的小提琴圖。再以Hub基因的表達中位數將全部樣本分為Hub基因高表達組和Hub基因低表達組,同樣的方法繪制Hub基因高低表達組免疫細胞浸潤差異的小提琴圖。最后分析Hub基因和免疫細胞浸潤的相關性,并使用“ggpubr”包繪制棒棒糖圖。

2 結果

2.1 ZJPW活性成分及靶基因 共篩選得到“白芍”活性成分13個、“五加皮”活性成分16個、“當歸”活性成分2個、“甘草”活性成分92個、“桂枝”活性成分7個、“黃芪”活性成分19個、“牛膝”活性成分20個、“威靈仙”活性成分7個、“細辛”活性成分8個、“延胡索”活性成分49個(見表1)。在TCMSP數據庫和drugbank數據庫中得到“白芍”作用靶點990個、“五加皮”作用靶點17個、“當歸”作用靶點864個、“甘草”作用靶點2 507個、“桂枝”作用靶點2 402個、“黃芪”作用靶點953個、“牛膝”作用靶點1 034個、“威靈仙”作用靶點310個、“細辛”作用靶點1 668個、“延胡索”作用靶點1 549個。利用UniProt數據庫將靶點轉換成對應的基因名稱,去除重復基因后,共得到ZJPW活性成分的靶基因共1 283個。

表1 ZJPW的藥物組成及活性成分

2.2 ZJPW治療腰椎間盤退變的潛在作用靶點 在GeneCards、OMIM和PharmGKB數據庫中檢索得到腰椎間盤退變的靶點基因2 458個。在GSE15227數據集中得到腰椎間盤Ⅱ度退變和Ⅳ度退變樣本的差異表達基因1 104個,選取表達譜中表達上調和下調排名前20基因繪制熱圖(見圖1A)。將上述基因取交集,共得到271個腰椎間盤退變相關的疾病靶點基因(見圖1B)。再將ZJPW活性成分的靶基因與腰椎間盤退變的致病基因取交集,共得到23個基因,這23個基因即為ZJPW治療腰椎間盤退變的潛在作用靶點(見圖1C)。

注：A:GSE15227數據集中椎間盤Ⅱ度退變和Ⅳ度退變樣本的差異表達基因;B:GeneCards、OMIM 和PharmGKB數據庫中的致病基因與GSE15227數據集中的差異基因取交集;C:藥物作用靶點與致病基因取交集;D:“藥物-活性成分-作用靶點”網絡圖。

2.3 “藥物-活性成分-作用靶點”網絡的構建 將藥物、活性成分和作用靶點數據導入Cytoscape 3.9.1軟件,繪制“藥物-活性成分-作用靶點”網絡圖,共得到170個節點,384條邊(圖1D)。根據連接度值大小排序,排在前10位的化合物是槲皮素、漢黃芩素、β-谷甾醇、黃芩黃素、山柰酚、甘草查爾酮A、芝麻素、尼森香豌豆紫檀酚、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇和隱品堿。這些成分主要來源于牛膝、細辛、白芍等藥物。見表2。

表2 排名前10位的活性成分及來源藥物

2.4 GO、KEGG和GSEA富集分析 對腰椎間盤退變的23個潛在治療靶點基因進行GO和KEGG富集分析,篩選條件為FDR<0.05。在BP方面,靶點基因主要富集在泌乳(lactation)、蛋白質磷酸化的調節(regulation of protein phosphorylation)、對外來生物刺激的反應(response to xenobiotic stimulus)和血管生成(angiogenesis);在CC方面,靶點基因主要富集在細胞外空間(extracellular space)、細胞外基質(extracellular matrix)、內質網腔(endoplasmic reticulum lumen)和細胞外區域(extracellular region);在MF方面,靶點基因主要富集在酶結合(enzyme binding)、相同的蛋白結合(identical protein binding)、蛋白結合(protein binding)和蛋白酶結合(protease binding)(見圖2A)。從KEGG 通路富集分析中可以看出,這些基因主要富集在糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications),蛋白聚糖在癌癥(proteoglycans in cancer),PI3K-Akt 信號通路以及人乳頭瘤病毒感染(見圖2B)。GSEA富集分析共得到83個符合條件的數據集,這些基因主要富集在固有免疫、VEGFR2信號通路、感染性疾病、選擇性自噬和膠原蛋白相關信號通路(見圖2C)。

注：A:藥物靶點基因的GO分析;B:藥物作用靶點的KEGG分析;C:GSE15227數據集中差異表達基因的GSEA分析。

2.5 PPI網絡構建 在STRING數據庫中獲得藥物靶點基因的PPI網絡,將得到的結果導入Cytoscape 3.9.1軟件進行可視化和聚類篩選(見圖3A)。利用Cytoscape中的“Network analyzer”工具計算無方向PPI網絡中每個節點的評分,得到每個節點的度值。用節點的大小表示度值,用邊的寬度表示這條邊的綜合得分值,篩選出度值≥15的節點,共24個節點,166條邊(見圖3B)。隨后分別使用MCODE插件和CytoNCA分別篩選Hub基因,在MCODE插件中得分最高的是聚類包含9個節點(見圖3C)。在CytoNCA分析中,度值>10的基因共有5個(見圖3D)。將使用MCODE插件分析得到的結果和使用CytoNCA插件分析得到的結果取交集,共得到PTGS2、HIF1A、VEGFA、FN1和CAV1共5個Hub基因。這5個Hub基因可能是ZJPW治療腰椎間盤退變的關鍵位點。

注：A:藥物靶點基因的PPI網絡;B:按度值≥15篩選并排序;C:CytoNCA法篩選出的Hub基因;D:MCODE法篩選出的Hub基因。

2.6 分子對接驗證 取度值排名前10位的活性成分分別與篩選出的5個Hub基因進行分子對接。在分子對接過程中,受體和配體的結合能越小表明結合活性越好。結果顯示,與PTGS2結合能最小的活性成分是槲皮素、漢黃芩素和山柰酚;與HIF1A結合能最小的活性成分是槲皮素、山柰酚和甘草查爾酮A;與VEGFA、CAV1和FN1結合能最小的活性成分均為槲皮素、山柰酚和黃芩黃素。見表3、圖4。

注：A-C:CAV1分別與槲皮素、黃芩黃素和山柰酚對接;D-F:FN1分別與槲皮素、黃芩黃素和山柰酚對接;G-I:HIF1A分別與槲皮素、山柰酚和甘草查爾酮A對接;K-M:PTGS2分別與槲皮素、山柰酚和漢黃芩素;N-P:VEGFA分別與槲皮素、黃芩黃素和山柰酚對接。

表3 排名前10位的活性成分與靶點基因對接結合能

2.7 免疫浸潤分析 CIBERSORT免疫浸潤分析顯示,一共有22種免疫細胞在受測樣本中表達,從免疫細胞浸潤差異的小提琴圖可以看出,Ⅱ級退變組和Ⅳ級退變組免疫細胞浸潤無明顯差異(見圖5A)。按照HIF1A的高低表達分組后我們發現,在HIF1A高表達組中,激活的NK細胞顯著升高(見圖5B)。免疫細胞與HIF1A的相關性分析也發現,激活的NK細胞與HIF1A呈顯著的正相關(見圖5C)。

注：A:椎間盤Ⅱ級退變和Ⅳ級退變免疫細胞浸潤的差異,紅色表示Ⅱ級退變,藍色表示Ⅳ級退變;B:HIF1A高低表達組免疫細胞浸潤的差異,紅色表示HIF1A高表達,藍色表示HIF1A低表達;C:HIF1A和免疫細胞的相關性分析。

3 討論

腰椎間盤退變是引起LBP最常見的原因之一[15]。中藥是治療腰椎間盤退變的重要手段[11, 16]。中藥多取材于天然動植物,其不良反應較小,且可以在多個靶點起作用,從而達到整體施治的目的[17-19]。ZJPW雖然已經被廣泛應用于臨床,并取得了令人滿意的臨床效果,但是其治療腰椎間盤退變的分子機制尚未完全闡明。

在本研究中,筆者通過數據庫分析,共得到ZJPW的有效活性成分139個,其中最重要的成分是槲皮素、漢黃芩素、β-谷甾醇、黃芩黃素、山柰酚、甘草查爾酮A、芝麻素、尼森香豌豆紫檀酚、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇和隱品堿。這些活性成分主要來源于牛膝、細辛、白芍等藥物。槲皮素是一種重要的抗衰老藥物,可以通過SIRT1信號通路調節細胞自噬或通過Nrf2/NF-κB信號軸抑制衰老相關的分泌表型(senescence associated secreted phenotype,SASP)因子的表達,從而減緩腰椎間盤退變[20-21]。有研究[22]還發現,抗衰老藥物達沙替尼和槲皮素長期聯合使用可顯著改善小鼠年齡相關的椎間盤退變。黃芩黃素是黃芩中含量最高的黃酮類化合物之一,具有抗腫瘤和抗炎等多種作用,在多種腫瘤和炎癥性疾病的治療中起重要作用[23-25]。在體外實驗中,黃芩黃素可抑制髓核細胞中由IL-1β誘導的炎癥反應,從而延緩椎間盤的退變[26]。山奈酚也是一種黃酮類化合物,自然存在于茶以及許多常見的蔬菜和水果中,具有抗氧化、抗骨質疏松、抗炎等多種功能,被廣泛用于治療許多急性和慢性炎癥引起的疾病,包括椎間盤退行性變和結腸炎以及絕經后骨質流失和急性肺損傷[27]。 體外實驗發現,山奈酚可通過改善LPS誘導的BMSCs成骨/成脂失衡和炎癥反應來減緩椎間盤退變[28]。漢黃芩素可通過介導細胞信號通路和免疫應答發揮抗癌、抗炎、治療細菌和病毒感染等多種生物學活性[29-31]。體外實驗也發現,漢黃芩素可通過Nrf2/ARE和MAPK信號通路減輕椎間盤退變[32]。以上研究結果與本研究篩選出的ZJPW活性成分是一致的,這說明ZJPW可能是通過上述活性成分發揮治療椎間盤退變的作用。本研究結果發現,ZJPW的靶點基因主要富集在PI3K-Akt信號通路,有研究[24]也表明,黃芩黃素可以通過PI3K/Akt/NF-κB通路提高A549肺腺癌細胞對順鉑的敏感性。因此筆者推測,ZJPW也可能通過PI3K/Akt信號通路調節椎間盤細胞的活性,從而延緩椎間盤退變的發生?；钚猿煞峙c信號通路的具體調控機制將在接下來的實驗研究中進一步闡明。

本研究通過PPI網絡篩選出了ZJPW的主要作用靶點是PTGS2、HIF1A、VEGFA、FN1和CAV1。PTGS2是環氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,Cox-2)的編碼基因,有研究[33-34]表明,COX-2在退變的髓核細胞中是表達上調的,而阿司匹林可以抑制COX-2的表達,從而延緩椎間盤退變的發生。本研究通過分子對接技術發現,與PTGS2結合能最小的ZJPW活性成分是槲皮素、漢黃芩素和山柰酚。有研究[35-37]表明,這些成分都具有下調COX-2的表達的作用。如前所述,COX-2的高表達是引起椎間盤退變的重要因素之一。因此筆者推測,下調髓核細胞中COX-2的表達可能也是ZJPW治療腰椎間盤退變的分子機制之一。

HIF1A可激活多種基因的轉錄,是細胞和全身對缺氧的穩態反應的主要調節因子,參與能量代謝、血管生成、細胞凋亡相關基因的調控。在椎間盤退變過程中HIF1A是否起正面作用目前尚有爭議,但可以肯定的是HIF1A是準確診斷和治療椎間盤退變不可缺少的參考指標[38]。有研究[39-41]發現,HIF1A通過上調自噬緩解壓應力誘導的髓核來源干細胞凋亡[42]。本研究結果發現,在分子對接過程中槲皮素、山柰酚和甘草查爾酮A與HIF1A的結合能最小。而實驗研究證實[39, 43],這些化合物均對HIF1A具有抑制作用。因此筆者認為,HIF1A是椎間盤退變的危險因素,而ZJPW可以通過下調HIF1A的表達發揮治療椎間盤退變的作用。值得一提的是,有研究[44]認為,外周血中NK細胞數量增多可能加速腰椎間盤退變。也有研究[45]認為,腰椎間盤突出患者的外周血NK細胞較正常對照組減少。而本研究結果發現,HIF1A與活性NK細胞呈顯著的負相關。故筆者認為,ZJPW可以下調HIF1A,進而減少活性NK細胞的數量,從未抑制椎間盤退變。

VEGFA是血管內皮生長因子家族的一員,它可促進新生血管形成和使血管通透性增加。椎間盤是一個乏血供組織,其內的髓核細胞靠軟骨終板的滲透作用提供營養物質和帶走代謝產物。因此,緊貼軟骨終板的椎體骨性終板的血供對椎間盤的退變起著至關重要的作用。血管內皮細胞凋亡可導致終板微血管密度降低,進而導致椎間盤退變[46]。在持續壓迫導致的椎間盤退變過程中,VEGFA起重要作用[47]。本研究結果發現,與VEGFA結合的ZJPW活性成分主要是槲皮素、山柰酚和黃芩黃素。這些化合物可以上調VEGFA的表達,促進血管生成,但是有趣的是,在某些腫瘤中這些化合物下調VEGFA的表達,從而起到抑制腫瘤生長的作用[48-50]。因此筆者認為,ZJPW可能通過增加骨性終板VEGFA的表達促進血管生成,或通過減少軟骨終板的血管化而達到治療椎間盤退變的作用。

綜上所述,本研究通過數據庫挖掘確定了ZJPW的有效活性成分,進一步使用網絡藥理學技術篩選出該藥物治療腰椎間盤退變的關鍵靶點,并初步探討了藥物作用的分子機制,最后利用分子對接技術對實驗結果進行了初步驗證,為ZJPW的深入研究、開發和應用提供了參考。