神經母細胞瘤化療耐藥機制的研究進展

林梅珍,李志杰,2*

0 引言

神經母細胞瘤(Neuroblastoma,NB)是起源于交感神經嵴的兒童常見顱外惡性實體腫瘤。1999-2007年,歐洲NB發病率約為1.2/10萬,在兒童腫瘤患者中約占7%,死亡率在兒童腫瘤中占15%[1]。根據國際神經母細胞瘤風險分層 (International Neuroblastoma Risk Group,INRG),將NB患者分為低危、中危和高危型。目前,治療NB的標準治療方案包括手術切除、化療、放療、靶向治療、免疫治療等。治療后,低危和中危NB患者5年生存率可達到90%,高?；颊卟捎枚喾N模式的綜合治療后,5年總生存率約為50%[2-6]。盡管免疫治療、靶向治療等是目前的研究熱點,但化療依然是臨床上控制腫瘤生長的主要手段之一,手術前后合并化療是治療NB的首選方案。手術前化療能縮小瘤體、減少術中出血量、加大手術成功率,術后化療可以減少腫瘤殘余量?；熌退幨撬心[瘤治療失敗的最重要原因之一,其中也包括NB,患者對化療藥物的敏感性直接影響預后[7]。本文就NB化療耐藥機制進行闡述,旨在為臨床NB患者的治療提供相關參考。

1 細胞凋亡受阻

1.1 凋亡蛋白 細胞凋亡(程序性細胞死亡)是細胞死亡的一種重要機制,是維持機體正常生理功能和機體內環境平衡所必需的。細胞凋亡通路有兩條主要途徑,即外源性和內源性途徑。外源性凋亡途徑又稱死亡受體途徑,是由細胞表面的死亡受體如凋亡誘導配體受體1(Fas cell surface death receptor 1,Fas1)和腫瘤壞死因子受體家族(Tumor necrosis factor receptor family,TNF-R)介導,從而激活凋亡程序。內源性凋亡途徑又稱線粒體途徑,通常是由應激條件、化療試劑、藥物等引起,其中涉及BCL-2家族引起的線粒體外膜通透性改變,從而激活了凋亡程序。根據功能的差異,BCL-2蛋白家族可分為兩大類:促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白,兩者之間的平衡被破壞是腫瘤細胞獲得凋亡抗性的主要原因[8]。幾乎所有臨床上使用的常規化療藥物都能誘導腫瘤細胞凋亡,腫瘤細胞一旦成功避開凋亡途徑,則會發生化療和放療耐藥性[9-10]。有研究表明,高遷移率族蛋白1(High mobility group box 1,HMGB1)通過ROS/ERK1/2途徑抑制順鉑和依托泊苷誘導的細胞焦亡,從而增加NB細胞體外和體內的凋亡和化療敏感性[11]。Shmakova等[12]發現,在NB細胞系Neuro2a中下調尿激酶型纖溶酶原激活物受體(Urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR)會抑制細胞凋亡激活,且出現細胞休眠表型和p53水平下降。研究顯示,BCL-2家族抑制劑GX15-070能引起細胞凋亡和自噬,從而提高化療敏感性[13]。研究細胞凋亡通路的調控機制以及導致凋亡抗性的因素對于開發更有效的治療策略至關重要。同時,應該加強針對細胞凋亡通路的抗凋亡治療策略的研究,以提高腫瘤細胞對化療的敏感性,減少化療耐藥性的發展。繼續深入研究細胞凋亡機制,尋找新的治療靶點,將有助于提高腫瘤治療的成功率。

1.2 剪接因子 剪接因子是參與調節可變剪接的蛋白質,在這個過程中,內含子從初級轉錄物中去除,而外顯子被選擇性地連接,以產生不同的mRNA。參與凋亡調節的基因的可變剪接通常會導致合成相反作用的蛋白質變體,這些變體可以激活或抑制程序性細胞死亡。剪接因子的2個關鍵家族分別是富含絲氨酸/精氨酸蛋白 (Serine/arginine-rich proteins,SR蛋白)和核不均一性核糖核蛋白(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)。SR蛋白和hnRNP家族的典型成員分別是富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子1(Serine/arginine-rich splicing factor 1,SRSF1)和hnRNPA1,能促進Bcl-x和Mcl-1抗凋亡剪接變體的合成。剪接因子既可以減少藥物誘導的細胞凋亡,也可以增強化療藥物的促細胞凋亡作用[14]。Shi等[15]研究顯示,藥物抑制剪接體可以誘導NB細胞凋亡并消除體內腫瘤生長。有研究表明,MYCN是MYCN-hnRNPA1/PTBP1-PKM2通路中Warburg效應的上游參與者[16]。在NB中MYCN過表達,可引起剪接因子hnRNPA1和PTBP1上調,這2種剪接因子能促進NB細胞增殖和下游分子PKM2的差異剪接。其中,致癌異構體PKM2主要在胎兒發育過程中表達,能促進NB細胞生長的Warburg效應[17]。剪接因子在NB中對細胞凋亡和腫瘤生長起著重要的調節作用。研究剪接因子及其調控的通路,可能為NB的治療提供新的靶點和策略。

1.3 泛素-蛋白酶體系統(Ubiquitin-proteasome system,UPS) UPS負責調節細胞內蛋白質的降解,其調節功能主要由E3泛素連接酶和去泛素化酶(Deubiquitinating enzyme,DUB)發揮作用,同時參與了細胞凋亡[18-19]。Caspase是細胞凋亡過程中的關鍵蛋白酶家族,負責調控細胞凋亡的執行步驟。E3泛素連接酶可以介導Caspase的泛素化,并促使其被降解。這種降解調控可以影響Caspase的穩態水平,從而影響細胞凋亡的進程。同時,抑制UPS可以恢復腫瘤細胞對常規化療藥物的敏感性[20-21]。有研究顯示,UPS參與了線粒體釋放細胞色素c,且沉默E3泛素連接酶可以降低NB細胞中的細胞色素c[22]。腫瘤抑制基因p53的突變是NB復發耐藥的主要原因之一。研究表明,通過沉默E3泛素連接酶ITCH可以減少TP73的泛素化修飾,提高其在NB中的穩定性和表達水平,這種負調控機制可能增強TP73的活性,從而提高NB細胞對化療的敏感性[23]。泛素連接酶E4B(Ubiquitin-conjugating enzyme E4B,UBE4B)是一種參與EGFR降解的E3/E4泛素連接酶。在化療耐藥NB細胞系中,UBE4B表達水平下降會增強其對西妥昔單抗的敏感性[24]。UPS在調控細胞凋亡和腫瘤治療中發揮重要作用,深入研究UPS的調控機制和相關的分子信號通路,可能為開發新的腫瘤治療策略和增強化療藥物的療效提供新的思路。

2 藥物外排

藥物外排是腫瘤細胞耐藥最常見的機制之一,通常是細胞毒性藥物通過細胞膜轉運體外排所致。由于許多抗癌藥物的靶點在細胞內,所以,細胞膜轉運體在化療耐藥中起重要作用。ATP結合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉運蛋白是具有重要臨床意義的膜蛋白,利用ATP水解釋放的能量來排出化療藥物[25]。迄今為止,在人類基因組中已經發現了49種不同的ABC轉運蛋白基因。轉運體由2個跨膜結構域(Transmembrane domain,TMD)和2個核苷酸結合結構域(Nucleotide-binding domain,NBD)組成,前者識別和轉運質膜上的底物,后者通過水解ATP產生運輸所需的能量。其中,ABC轉運體包括ABCA2、ABCA3、ABCB1、ABCB4(MDR2/MDR3)、ABCB5、ABCC1、ABCC2(MRP2/cMOAT)、ABCC3(MRP3)、ABCC10(MRP7)和ABCG2。與其他轉運蛋白相比,糖蛋白ABCB1 (MDR1/P-gp)、多藥耐藥蛋白ABCC1 (MRP1)在多藥耐藥中最為重要[26]。

2.1 ABCB1 ABCB1也稱為多藥耐藥基因(Multi-drug resistance 1,MDR1),主要編碼一種細胞膜上的蛋白質,即P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)。P-gp作為一種能量依賴的外排泵,在細胞毒性作用發生前,將與MDR相關的藥物轉運出細胞,從而誘導了化療耐藥性[27]。R?sch等[28]研究表明,P-gp抑制劑和ERBB家族抑制劑能有效地逆轉NB對長春新堿的耐藥性。P-gp和其他MDR轉運體可以通過各種類型的細胞外囊泡(即外泌體和微泡),將耐藥腫瘤細胞(供體)轉移到藥敏腫瘤細胞(受體),從而導致受體細胞在體內外均出現獲得性耐藥,以逃避藥物帶來的細胞毒性[29-30]。Sousa等[31]研究顯示,細胞外囊泡可能會轉移微小RNA(MicroRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)、蛋白質(如藥物外排泵)和其他負責耐藥性的相關因子,從而將腫瘤耐藥性特征擴散到受體細胞。有研究表明,TP53突變可能在化療和NB的惡性進展過程中獲得[32-33]。當腫瘤暴露于DNA損傷類的化療藥物后,腫瘤細胞中的p53會過度表達,當p53基因不能阻止帶有受損DNA的細胞進入復制周期,便出現耐藥性,本質上是p53基因發生突變[34]。突變型p53(mutp53)是賦予腫瘤細胞化療耐藥性的關鍵分子,可能與耐藥性相關,MDR1是mutp53靶基因。組織蛋白酶L(Cathepsin L,CTSL)通過上調ABCB1和ABCG2的表達水平,同時抑制細胞自噬和凋亡途徑,從而降低NB細胞對順鉑和阿霉素的敏感性[35]。研究ABC轉運體、細胞外囊泡、TP53突變等對于理解NB細胞耐藥性的機制以及尋找逆轉耐藥性的治療方法具有重要意義。

2.2 ABCC1 ABCC1也稱多藥耐藥相關蛋白1(Multi-drug resistant associate protein 1,MRP1),ABCC1基因的上調與NB患者的預后密切相關。此外,ABCC1受MYCN基因的轉錄調控,MYCN是神經母細胞瘤發生的驅動因素。MYCN基因的擴增發生在大約20%～30%的原發性NB中,并且始終與不良臨床結果相關。NB治療中使用的許多一線藥物是MRP1底物,包括依托泊苷、多柔比星、長春新堿和拓撲替康[36]。有研究顯示,MRP1缺失增強了長春新堿和依托泊苷的藥物敏感性,顯著延緩腫瘤生長,表明MRP1在體內介導化學抗性[37-38]。Lucianò等[39]發現,在NB中,M2受體激動劑,可以減少藥物射流泵的表達,有助于化療藥物進入細胞,并停留在細胞內部,從而增加藥物在細胞內的積累并增強其毒性作用,即使在低劑量下也可以實現這種效果。MRP1在NB中的高表達與不良預后相關,通過干擾MRP1蛋白功能或利用M2受體激動劑,可以增加化療藥物的療效,減少化療藥物的泵出,從而提高藥物在腫瘤細胞內的積累并增強其治療效果。這也為開發針對MRP1的治療策略提供了指導和依據。

3 DNA修復增強

化療藥物可直接或間接引起腫瘤細胞的DNA損傷,進而殺死腫瘤細胞。當基因組內出現各種損傷時,DNA損傷修復能力是決定腫瘤細胞對化療敏感性的重要因素[40]。其中,DNA修復的途徑包括堿基切除修復(Base excision repair,BER)、核苷酸切除修復(Nucleotide excision repair,NER)、錯配修復(Mismatch repair,MMR)、DNA雙鏈斷裂修復(DNA double-strand break repair,DSBs)等[40]。通常情況下,DNA修復不完全后,細胞會發生凋亡。鉑類藥物(如順鉑、奧沙利鉑和卡鉑)通過與DNA分子交聯而導致DNA損傷,從而誘導細胞凋亡和細胞死亡。負責DNA修復的基因中的遺傳缺陷,如MSH2和MLH1,可導致腫瘤細胞對DNA損傷類藥物(如拓撲替康、環磷酰胺、順鉑等)產生耐藥性[26]。研究顯示,在營養缺乏的MYCN非擴增NB細胞系中,耐藥性主要是通過增加DNA修復和膽固醇介導的拓撲替康外流引起的;然而,在營養缺乏的MYCN擴增NB細胞系中,耐藥性主要是由膽固醇介導的拓撲替康外流引起的。結果顯示,在不同類型的NB細胞系中,耐藥機制可能存在差異[41]。DNA損傷修復能力是影響腫瘤細胞對化療藥物敏感性的重要因素?；熕幬镆餌NA損傷后,如果細胞的DNA修復能力完整,則細胞可能適應損傷并存活,從而降低化療的效果。相反,如果細胞的DNA修復能力受損,藥物引起的DNA損傷則無法修復,進而導致細胞凋亡和死亡,增強化療的效果。

DNA損傷反應(DNA damage response,DDR)是一種保護機制,通過細胞對多種內源性和外源性因子的反應來適應DNA損傷。更多情況下,DNA損傷的積累會導致基因組不穩定和致癌。盡管DDR對正常細胞的存活很重要,但也能通過克服化療藥物誘導的DNA損傷而導致腫瘤細胞產生耐藥性。氧化應激誘導的DNA損傷在癌變過程中最常見[42]。有研究表明,在NB細胞系SH-SYSY中,沉默著絲粒蛋白A(Centromere protein A,CENPA)可以提高NB細胞對阿霉素和順鉑的藥物敏感性,并且抑制細胞的增殖、轉移[43]。研究顯示,抑制組蛋白去乙?；?0(Histone deacetylase 10,HDAC10)與多柔比星聯合使用,可以通過阻礙藥物外排和增強DNA損傷來殺死NB,這為靶向化療耐藥性提供了一個新的機會[44]。此外,DDR作為一種保護機制,幫助細胞應對DNA損傷,對于維持正常細胞的穩定和避免致癌起重要作用。然而,腫瘤細胞也可以通過克服化療藥物誘導的DNA損傷并啟動DDR來產生治療耐藥性。因此,深入研究DDR的調控機制,特別是在腫瘤細胞中的作用,可能有助于開發更有效的治療策略,提高化療效果。

4 腫瘤微環境

腫瘤微環境(Tumor microenvironment,TME)由多種細胞組成,其中包括腫瘤細胞、腫瘤相關成纖維細胞(Cancer-associated fibroblast,CAF)、內皮細胞、免疫細胞、腫瘤干細胞(Cancer stem cells,CSCs)、骨髓源性細胞以及細胞外基質(Extracellular matrix,ECM),這些細胞成分都會推動腫瘤的發展。在腫瘤微環境中的各種細胞中,CAF是TME的主要細胞成分,在獲得腫瘤化療耐藥性中起到關鍵調節作用。CAF介導的耐藥性可大致分為細胞黏附介導的耐藥性(Cell adhesion-mediated drug resistance,CAM-DR)和可溶性分泌因子介導的耐藥性(Soluble factor-mediated drug resistance,SFM-DR)。CAF衍生的ECM蛋白作為腫瘤化療耐藥細胞外基質,腫瘤組織中的ECM比正常組織中的ECM密度更高、硬度更高,密集而堅硬的ECM過度積聚通常會成為藥物滲透到腫瘤環境的物理屏障[42]。同時,與正?；|細胞相比,CAF的p53表達水平較低,甚至缺失[45]。其中,腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages,TAM)是TME中最豐富的浸潤基質成分[46]。有研究表明,NB中端粒酶抑制劑TERF1能夠逆轉由TAM衍生的外泌體miR-155誘導的耐藥[47]。TME是由多種細胞和細胞外基質組成的復雜環境,不同細胞成分之間的相互作用影響著腫瘤的發展和化療耐藥性。CAF、ECM、TAM、CSCs和上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)等成分在腫瘤的治療中發揮關鍵作用。其中,CSCs和EMT表型是TME驅動的化療耐藥性的核心。了解這些成分之間的相互作用和調控機制,有助于發展新的治療策略,克服化療耐藥性,并提高腫瘤治療的效果。此外,深入研究CSCs和EMT的機制,有望為針對這些細胞亞群的治療提供新的方向和策略。

4.1 CSCs CSCs是一種特殊類型的腫瘤細胞,其具有干細胞特征,包括自我更新、分化和腫瘤永生化的特性。CSCs的增殖水平較低,藥物外流增加,DNA損傷修復活性高,會導致固有的化療耐藥性[45]。同時,CSCs細胞周期常處于靜止狀態,能有效避免化療藥物對快速分裂的靶細胞的殺傷作用,從而產生耐藥性[40]。CSCs介導化療抵抗和藥物治療后腫瘤細胞的重新增殖,使其具有高致瘤特性。CSCs在TME中獲得耐藥性可能導致化療藥物治療效果不佳。研究表明,依托泊苷與磺胺嘧啶或PKCα抑制劑C2-4的兩種組合治療方案可以通過阻止EMT轉變和下調GPX4活性觸發鐵死亡,從而增強NB干細胞對依托泊苷的敏感性[48]。研究表明,下調JARID1B通過抑制Notch通路抑制腫瘤球形成,逆轉CSCs的EMT,提高NB細胞對順鉑的化學敏感性[49]。CSCs作為一種特殊亞群,具有自我更新和耐藥性能力,對于腫瘤的治療具有挑戰性。通過有針對性地攻擊CSCs,可能會更有效地消滅腫瘤細胞,并提高治療的成功率。

4.2 EMT 隨著治療后化療耐藥性的發展,腫瘤表現出微環境變化,并在具有間充質特征的腫瘤細胞亞群中富集,這些變化與EMT相關。TME衍生的白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)可以誘導EMT,這是一種促進化療耐藥性的表型開關[45]。Yogev等[50]建立了NB耐藥模型,從而發現獲得性耐藥與轉移到骨髓并產生彌散性轉移的細胞亞群中的EMT有關。有研究表明,uPAR能促進NB細胞中EMT,同時抑制了EGFR/ERK信號通路,并激活AKT信號通路,從而導致化療藥物耐藥[12]。研究表明,EMT轉錄因子在NB順鉑耐藥的形成過程中發揮關鍵作用[51]。EMT作為一種細胞轉化過程,可能導致腫瘤細胞表型的轉變和耐藥性的增強,從而限制了化療效果。探索如何抑制或逆轉EMT過程,有可能為治療耐藥性提供新的目標和方法,提高治療效果,增加患者的生存率。

5 影響自噬

自噬是一種細胞內環境平衡機制,負責細胞器、脂質和蛋白質的分解代謝循環,從而為能量生產和維持細胞內穩態提供底物[50]。自噬在腫瘤中具有雙重作用。一方面,自噬作為一種保護機制被激活時,抑制自噬可以提高化療對耐藥腫瘤細胞的敏感性[40];另一方面,化療引起的持續自噬可刺激“自噬性細胞死亡”,這是一種獨立的細胞死亡方式,不涉及細胞凋亡,但可能伴隨細胞凋亡[52]。在大多數情況下,自噬抑制細胞凋亡,說明自噬傾向于抑制細胞凋亡而不是促進細胞凋亡[53]。在接受化療和放療的腫瘤細胞中,首先的反應之一是自噬,這是一種去除受損蛋白質和細胞器并產生能量和代謝中間產物的細胞過程。自噬可以促進或減弱腫瘤抵抗力,這取決于自噬本質上是細胞保護還是細胞毒性。當耐藥細胞缺乏凋亡能力或表現出抗凋亡能力時,誘導細胞毒性自噬的藥物也可以通過誘導自噬治療腫瘤和阻止化療藥物耐藥性。此外,p53依賴的保護性自噬誘導的耐藥性可能與高水平溶酶體的誘導有關[54]。研究表明,P2X7是一種受體蛋白,能夠與細胞外的ATP結合并傳遞信號,P2X7受體B亞型可以通過抑制自噬、增加MRP型轉運體的藥物外流、對維甲酸產生抵抗、增加干細胞樣表型、誘導EMT等使NB細胞產生耐藥性,而P2X7受體A亞型則具有相反和互補的作用[55]。研究表明,下調自噬相關分子Beclin-1蛋白表達水平,可以提高NB對化療藥物的敏感性[56]。自噬在腫瘤中的雙重作用為腫瘤治療提供了復雜的挑戰。對于耐藥腫瘤細胞,抑制自噬可能是提高化療敏感性的有效策略。然而,對于一些化療引起的自噬性細胞死亡,需要深入了解其機制和潛在的療效。

6 總結與展望

目前,化療仍然是治療NB的主要手段之一,化療耐藥性一直是NB治療的主要挑戰。近年來,針對NB化療耐藥機制的研究取得了一些重要進展。NB細胞的化療耐藥性形成與多個因素相關,包括細胞凋亡途徑異常、DNA修復能力增強、細胞外轉運泵的過度表達、腫瘤干細胞以及細胞外耐藥信號通路的激活等。但臨床上仍然存在內源性或獲得性耐藥的問題,導致部分高危NB患者緩解后仍復發。因此,需要進一步探索NB化療耐藥形成的機制,尋找可以逆轉NB細胞化療耐藥的新治療靶點。