系統性紅斑狼瘡病人外周血髓樣樹突狀細胞TLR2和TLR4表達情況及其臨床意義研究

狄寧寧,方茹夢,鄭倩倩,魏小松,謝長好,2,李志軍,2

(1.蚌埠醫科大學第一附屬醫院 風濕免疫科,安徽 蚌埠 233004;2.慢性疾病免疫學基礎與臨床安徽省重點實驗室,安徽 蚌埠 233004)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種全身性自身免疫性疾病,以自身免疫失衡、產生多種自身抗體為特征,通過形成免疫復合物,激活多種炎癥反應,進而導致多器官損傷[1-2]。樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)作為重要的抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell,APCs)之一,被認為在SLE疾病的起始、進展和延續中發揮關鍵作用,DCs依據功能來源不同可分為不同的DC亞群,包括髓樣樹突狀細胞(mDC)和漿細胞樣DC (plasmacytoid dendritic cells ,pDC)[3-4]。Toll樣受體(Toll-like receptors ,TLRs)是模式識別受體的主要類型之一,在天然免疫中起重要作用。越來越多的證據表明,TLRs通過病原體相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)識別自身分子,參與了SLE等自身免疫性疾病的發病過程。而以往較多研究[5-7]關注于細胞內TLRs如TLR7、TLR9等的表達對SLE發病的影響,對于TLR2、TLR4的報道相對較少,特別是對于髓系來源的專職抗原遞呈細胞mDC上TLR2、TLR4的表達水平與SLE病情的關系尚乏研究,故本實驗旨在通過檢測mDC膜表面TLR2、TLR4的表達情況及血清白細胞介素(IL)-10、IL-17A表達水平進一步探討其在SLE發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取 2021年3月至2022年1月于蚌埠醫科大學第一附屬醫院風濕免疫科治療的54例SLE病人作為研究對象,納入標準:(1)符合1997年美國風濕病學會制定的SLE分類標準;(2)除外其他結締組織病以及腫瘤、結核等傳染病。54例SLE病人中男7例,女47例;年齡15～74歲,平均(42.15±13.93)歲。根據SLEDAI-2000評分標準[8]將其分為穩定組(≤4分)21例和活動組(≥5分)33例。同時選取本院30名健康志愿者為對照組,其中男8例,女22例,年齡22～69歲,平均(38.73±15.51)歲。SLE病人組與對照組在年齡和性別上差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 流式抗體包括Lin1(CD3/14/16/19/20/56)-FITC、HLA-DR-APC-CY7、CD11c-APC、TLR4-PE、IgG2a-PE、TLR2-PE-Cy7和IgG2a-PE-Cy7均購自美國BioLegend公司;紅細胞裂解液購自Biosharp公司;Human TruStain FcXTM購自美國BioLegend公司;其他試劑如磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、染色緩沖液(SB)、2%多聚甲醛溶液(PFA)等均為自行配制;IL-10、IL-17A檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司;流式細胞儀為DxP AthenaTM流式細胞儀,酶標儀為科華KHB-ST-360型。

1.2.2 全血法收集外周血mDC 所有研究對象均于清晨空腹狀態下采集外周靜脈血5 mL,置于離心機中以4 ℃,1 500 r/min離心5 min后留取上清液并于-80 ℃冰箱中保存備用。然后向剩余血液中加入約6～10倍細胞體積的紅細胞裂解液,室溫裂解5 min后,再置于離心機中以4 ℃,1 500 r/min離心5 min,棄去上清液(若細胞裂解不完全可重復上述步驟1～2次),加入約5倍體積PBS洗滌,再以上述條件離心后,棄去上清液,加入適當PBS混勻,并移入相應流式管中,向各管細胞懸液中加入5 μL FcR封閉劑,置于4 ℃冰箱中封閉10 min后向各管中加入相應流式抗體,于冰上孵育30 min,向各流式管加入1 mL SB洗滌并離心,棄去上清液,加入200～300 μL 2%PFA固定,而后上機檢測。

1.2.3 流式細胞儀檢測外周血mDC表面TLR2、TLR4表達率 將流式細胞儀電壓及補償調節完畢后,在FSC/SSC散點圖上設門,然后通過FSC/FSC-W去除粘連細胞,再以Lin1/HLA-DR設十字門,得到Lin1-HLA-DR+細胞群,在此基礎上以CD11c/CD123設十字門得到CD11c+CD123-細胞群即為mDC細胞群,通過同型對照組設置每組TLR2/4細胞群位置。每組樣本同型對照陽性率在5%以內。

1.2.4 ELISA法檢測血清中IL-10、IL-17A表達水平 采用ELISA法檢測SLE病人和健康志愿者血清中IL-10、IL-17A表達水平,所有實驗操作嚴格按照各試劑盒的說明書進行。

1.3 統計學方法

采用t檢驗、單因素方差分析和多重比較(Bonferroni法)、秩和(Mann-Whitney和Kruskal-Walli)檢驗和Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 3組外周血mDC-TLR2、mDC-TLR4表達情況 SLE活動組mDC-TLR2的表達率高于穩定組和對照組(P<0.01);mDC-TLR4的表達率高于對照組(P<0.01),與穩定組比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表1、圖1)。

表1 3組mDC-TLR2、mDC-TLR4表達率的比較

2.2 SLE病人與對照組血清IL-10、IL-17A表達水平比較

SLE活動組和穩定組IL-10、IL-17A表達水平均高于對照組(P<0.01),活動組與穩定組間差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 3組血清IL-10、IL-17A水平比較[M(P25,P75);pg/mL]

2.3 SLE病人外周血mDC-TLR2、mDC-TLR4表達率與實驗室指標相關性

在各項實驗室指標中,SLE病人外周血mDC-TLR2表達率與血清IgG、24 h尿蛋白定量均呈負相關(r=-0.270、-0.310,P<0.05),而與抗Sm抗體呈正相關(r=0.340,P<0.05)。mDC-TLR4表達率與血小板計數呈正相關(r=0.340,P<0.05),與其余臨床指標均無相關性(見表3)。

表3 SLE病人外周血mDC-TLR2、mDC-TLR4表達率與實驗室指標的相關性分析(r)

3 討論

SLE是一種慢性自身免疫性疾病,以體內自身抗體產生為特征,可通過形成免疫復合物等激活炎癥細胞,促進炎癥因子的表達和釋放,導致免疫失衡。盡管在過去幾十年里對于SLE的早期診斷和治療有明顯進步,但SLE的發病風險和死亡率仍在持續增加[9-12]。因此探索和研究SLE的確切發病機制對于SLE病人的治療和預后有著十分重要的意義。

TLRs作為重要的模式識別受體,在天然免疫中發揮著重要作用。研究[13-14]報道,TLRs在活化狀態下可能通過調節細胞因子的產生而影響SLE疾病活動性,且TLR2和/或TLR4的缺乏使自身抗體的產生減少,延緩了SLE癥狀的發展。另外,近期一項研究[15]顯示使用TLR阻斷劑及其衍生物能夠顯著抑制活化B細胞NF-κB的激活,抑制炎癥因子的分泌,并且對SLE小鼠的疾病進展有一定的預防作用,提示TLR2和TLR4在SLE發病中可能起到重要作用。作為較早發現的重要的胞外TLRs,TLR2和TLR4可以識別細菌、支原體、真菌和病毒的各種成分,包括脂蛋白、肽聚糖等,其中TLR2以與TLR1或TLR6形成異源二聚體的形式來識別其配體,而TLR4則通過與細胞膜表面的骨髓分化蛋白2(myeloid differentiation 2,MD2)結合形成復合物而參與配體識別,并招募特定信號分子,包括髓樣分化因子88和β-干擾素TIR結構域銜接蛋白,啟動下游信號事件,激活轉錄因子NF-kB,調節炎癥細胞因子(如IL-10、IL-17A等)分泌,從而參與免疫反應[16-19]。DCs作為目前已知抗原提呈能力最強的細胞之一,在免疫激活和免疫耐受過程中起到重要作用,依據功能來源不同可分為不同的DC亞群,包括CD11c+CD123-mDC和CD11c-CD123+pDC。mDC可通過提呈抗原、協同信號傳遞和分泌細胞因子,激活T細胞,從而參與免疫反應。人外周血mDC膜表達TLR2、4,可能通過識別PAMPs,激活前述TLR2/4-MyD88/TRIF通路,釋放炎性細胞因子,進而參與SLE的疾病進展[20]。

近幾年國內外有關不同細胞膜表面TLR2、TLR4的研究結果不盡相同。有研究[21]報道,SLE病人單核細胞TLR4表達水平顯著低于健康對照組,TLR2表達水平與健康對照組相比差異無統計學意義。另有研究[22]顯示,SLE病人活動期、穩定期血清TLR4表達水平顯著高于健康對照組。而本研究旨在通過流式細胞術探究TLR2、TLR4在SLE病人外周血mDC膜表面的表達情況,及其與SLE病人各項臨床指標之間的關聯以及血清IL-10、IL-17A表達水平,進一步探討TLR2、TLR4在SLE發病機制中的作用。

本研究發現SLE活動組mDC-TLR2表達率顯著高于對照組和穩定組,提示TLR2可能在SLE疾病發病與病情進展中起到重要作用,這一結果與劉昱[23]在SLE病人CD4+T細胞TLR2表達水平研究中的結果一致。本研究中SLE活動組mDC-TLR4表達率顯著高于對照組,差異有統計學意義;穩定組mDC-TLR4表達率高于對照組,但差異無統計學意義,與張文蘭等[24-25]的研究結果基本一致,不同之處是本研究中活動組mDC-TLR4表達率高于穩定組,但差異無統計學意義,分析其原因可能是檢測方法不同及所測細胞種類不同。本次研究結果提示mDC-TLR2、mDC-TLR4可能在SLE發病過程中起到重要作用,并可能作為SLE藥物治療的潛在靶點,為研制TLRs阻斷劑治療SLE提供一定理論支持。IL-10具有刺激免疫反應和抑制免疫反應的雙重作用,在調節免疫反應過程中起到重要作用[26]。IL-17A是IL-17家族具有代表性的成員,其可以誘導多種促炎細胞因子產生,后者可募集B細胞等多種效應細胞,誘導產生大量自身抗體,激活免疫反應。在本研究中,我們發現SLE活動組及穩定組血清IL-10、IL-17A水平顯著高于對照組,與以往多項研究[27-29]結果一致,提示IL-10、IL-17A可能參與SLE發病。筆者將SLE病人mDC-TLR2、mDC-TLR4表達率與實驗室指標進行相關性分析發現,SLE病人血小板計數與mDC-TLR4表達率呈正相關;血清IgG水平、24 h尿蛋白定量與mDC-TLR2表達率呈負相關;抗Sm抗體與mDC-TLR2表達率呈正相關,表明TLR2在SLE發病中起到一定作用。

綜上所述,SLE是一種多因素參與的全身性自身免疫病,可引起多器官損害,研究mDC-TLR2、mDC-TLR4在SLE病人中的表達情況有利于對SLE發病機制的進一步探索,有望提供研制TLRs阻斷劑治療SLE的理論可能性,對完善SLE病人的靶向治療、改善預后,具有重要的臨床意義。