急、慢性腎損傷患者血清中生物標志物的研究與驗證*

丁 璐， 劉 勝， 胡 波

（中山大學附屬第三醫院檢驗科，廣東 廣州 510000）

急性腎損傷（acute kidney injury， AKI）是由各種原因引起的腎功能在短時間內突然下降而出現的臨床綜合征。臨床表現為腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate， eGFR）下降，血清肌酐（serum creatinine， SCr）和尿素（Urea）等在體內潴留，水電解質和酸堿平衡紊亂等，是威脅患者生命的常見疾病。AKI是住院患者中常見的并發癥，AKI可發展成為急性腎功能衰竭（acute renal failure， ARF），死亡率高達26.5%～45.0%［1］。慢性腎臟?。╟hronic kidney disease， CKD）是由各種原因引起的慢性腎臟結構和功能障礙，最終發展成為慢性腎功能衰竭［2］。CKD是嚴重危害人類健康和生命的常見疾病，全球平均患病率約13.4%［3］。據我國第六次全國人口普查結果顯示，我國18歲以上成年人CKD的患病率為8.2%［4］。到2040年，估計CKD將成為全球第五大常見死亡原因［5］。

目前，臨床上常用SCr、尿量等標志物水平評估腎功能，但腎損傷是亞臨床狀態向完全衰竭轉變的一個連續發展過程，這些標志物在腎損傷早期改變不明顯，一般SCr在腎臟功能下降50%以上才會發生明顯改變，且容易受到其他因素影響［6］。因此，找到一種特異的、敏感的早期生物標志物對于腎損傷患者極其重要。中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin， NGAL）是一種由腎小管上皮細胞合成的與抗菌特性或細胞凋亡相關的糖基化蛋白，可以促進腎小管上皮細胞的分化和組織構成［7-8］。大量研究發現，NGAL作為腎功能損傷的生物標志物，已證實是AKI的早期診斷因子。有研究者利用FVB/N小鼠模型誘導其發生腎臟改變，研究發現，NGAL不僅是急性腎損傷的早期預測因子，也在慢性腎臟病中起著重要作用。本研究通過檢測急、慢性腎損傷患者血清中NGAL及各項生物指標水平，探討各單項指標在急、慢性腎損傷診斷中的作用與價值。

材料和方法

1 一般資料

研究選取2022年1月～2023年7月在中山大學附屬第三醫院收治治療的急性腎損傷患者171例作為AKI組，慢性腎損傷患者209例作為CKD組，另選取同期體檢的94例健康人員作為對照組，記錄3組研究對象性別、年齡等一般資料。

診斷標準：急性腎損傷組：目前臨床使用的AKI診斷標準是由2012年國際改善全球腎臟病預后組織（Kidney Disease： Improving Global Outcomes， KDIGO）制定的。根據KDIGO標準的定義，患者SCr 48 h內升高≥26.5 umol/L，或7 d內SCr升高≥1.5倍基礎SCr，或尿量減少（＜0.5 mL·kg-1·h-1，持續6 h）即可診斷為AKI［9］；慢性腎臟病組：目前臨床使用的CKD診斷標準是由2000年美國國家腎臟基金會（National Kidney Fondation，NKF）修訂的最新KDOQI（Kidney Disease Outcome Quality Initiative）指南。根據KDOQI標準的定義：（1）為腎臟損害（血成分、尿成分異?；蛴跋駥W、病理檢查異常）≥3個月，伴或不伴腎小球濾過率異常；（2）eGFR＜60 mL·min-1·1.73 m-2≥3個月，有或無腎臟損傷證據，以上2條中有1條即可診斷為CKD［10］。

納入標準：（1）符合上述急、慢性腎損傷診斷標準，且SCr≥120 μmol/L；（2）年齡≥18周歲，無嚴重心功能不全、冠心病、肝臟疾病等重大器官疾??；（3）臨床資料完整。

排除標準：（1）妊娠或哺乳期女性；（2）既往腎臟疾病史；（3）心肺功能異常、合并腫瘤、精神性疾??；（4）年齡＜18周歲；（5）其他系統嚴重疾??；（6）臨床資料不完整。本研究經醫院倫理委員會批準［批件號：中大附三醫倫RG2023-169-01］。

2 收集資料及標本檢測

2.1 標本收集 收集患者干燥管靜脈血3 mL，采血1 h內將血液以1 369.6×g離心10 min，取血清于干凈無菌EP管中，-80 ℃冰箱低溫保存。

2.2 收集資料 按照設計的臨床登記表收集資料，記錄所有納入對象的相關臨床資料和實驗室指標，包括年齡、性別、鉀（K）、鈉（Na）、氯（Cl）、二氧化碳（carbon dioxide，CO2）、尿素（Urea）和葡萄糖（glucose， GLU），所有檢查均在本院檢驗科完成。

2.3 標本檢測 所有標本使用HITACHI系列全自動生化分析儀和邁克生物股份有限公司試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書，采用膠乳免疫比濁法檢測血清中NGAL水平。

3 統計學處理

將收集的數據系統性錄入SPSS 26.0軟件并進行相關數據分析，計量資料以中位數（下四分位數，上四分位數）［median （Q1，Q3）］表示，3組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。采用采用多因素logistic回歸方程分別分析AKI和CKD的相關因素，并依據各指標的預測界值建立聯合檢測因子，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic， ROC）曲線評價檢測指標單獨及聯合檢測在AKI和CKD診斷中的意義，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 生物信息學分析

我們通過轉錄組和蛋白組數據分析發現，在急性腎損傷患者血清中差異顯著蛋白和慢性腎損傷患者活體標本中差異顯著基因共有的差異數為124（圖1A）。這124個差異基因在慢性腎損傷患者活體標本中差異水平見圖1B。差異基因的GO富集分析結果顯示，排在前列的通路為抗菌免疫反應、嗜中性粒細胞脫顆粒（圖1C）。在腎損傷中，嗜中性粒細胞脫落會產生細胞因子破壞腎組織生長，脫落的細胞還會引起炎癥反應，進而加劇腎損傷。研究表明，嗜中性粒細胞脫落與NGAL的釋放密切相關。在篩選的共有顯著基因中，我們發現NGAL位列其中，且顯著上調（圖1D）。進一步，我們在腎損傷的動物模型上也發現，腎損傷的組織中NGAL水平顯著高于假手術組（圖1E）。上述結果提示，NGAL可能是腎損傷的檢測標志物。

Figure 1.Transcriptome analysis of biopsy specimens from patients with acute and chronic kidney injury.A： Wayn diagram showing the intersection of differentially significant proteins in serum of patients with acute kidney injury and differentially significant genes obtained from sequencing in patients with chronic kidney injury；B： heatmap showing shared significantly differential genes in the discovery cohort and validation cohort of patients with chronic kidney injury；C： GO enrichment analysis of shared significantly divergent genes；D： volcano plot of shared significantly divergent genes；E： Ngal gene changes in mouse kidney tissue in a model of acute kidney injury， **P＜0.01.圖1 急、慢性腎損傷患者活檢標本轉錄組分析

2 AKI組和CKD組一般資料比較

AKI組、CKD組和健康對照組，K、Na、Cl、CO2、Urea、GLU、NGAL檢測結果對比見表1。AKI組和CKD組K、Na、CO2、Urea、GLU、NGAL水平與健康對照組比較均呈顯著性差異（P＜0.05）；各組間年齡、性別和Cl水平比較無統計學差異（P＞0.05）。AKI組和CKD組Urea和NGAL水平明顯高于健康對照組（P＜0.05）。

表1 各組實驗室指標檢測結果差異性分析Table 1.Analysis of the difference of laboratory indexes in each group ［Median （Q1， Q3）］

3 AKI和CKD相關因素的多因素logistic回歸分析

logistic回歸分析顯示，在AKI組中Na［OR=0.692， （95% CI： 0.559， 0.855）］、Urea［OR=4.030，（95% CI： 2.506， 6.482）］、GLU［OR=2.478， （95%CI： 1.288， 4.766）］和NGAL［OR=1.011， （95% CI：1.004， 1.019）］是影響AKI發生的獨立危險因素（P＜0.05）；在CKD組中，Na［OR=0.712， （95% CI：0.575， 0.881）］、Urea［OR=4.218， （95% CI： 2.622，6.784）］、GLU［OR=2.038， （95% CI： 1.059，3.921）］和NGAL［OR=1.012， （95% CI： 1.005，1.020）］是影響CKD發生的獨立危險因素（P＜0.05），見表2。

表2 發生AKI和CKD時多因素logistic回歸分析參數估計值Table 2.Multivariate logistic regression analysis of parameter estimates of AKI and CKD

4 Na、Urea、GLU和NGAL分別在診斷AKI和CKD時的效能

ROC曲線分析結果顯示，在診斷AKI發生的曲線下面積分別為：Na［AUC=0.711， （95% CI： 0.773，0.650），P＜0.01］、Urea［AUC=0.960， （95% CI：0.938，0.982），P＜0.01］、GLU［AUC=0.793， （95%CI： 0.738， 0.847），P＜0.01］和NGAL［AUC=0.841，（95% CI： 0.793， 0.888），P＜0.01］，見圖2及表3。

表3 Na/Urea/GLU/NGAL在診斷AKI時的效能Table 3.Efficacy of Na/Urea/GLU/NGAL in the diagnosis of AKI

Figure 2.Efficacy of Na/Urea/GLU/NGAL in the diagnosis of AKI.圖2 Na/Urea/GLU/NGAL在診斷AKI時的效能

在診斷CKD發生的曲線下面積分別為：Na［AUC=0.681， （95% CI： 0.617， 0.744），P＜0.01］、Urea［AUC=0.990， （95% CI： 0.981， 0.999），P＜0.00］、GLU［AUC=0.703， （95% CI： 0.646，0.760），P＜0.01］和NGAL［AUC=0.930， （95% CI：0.902， 0.958），P＜0.01］，見圖3及表4。

表4 Na/Urea/GLU/NGAL在診斷CKD時的效能Table 4.Efficacy of Na/Urea/GLU/NGAL in the diagnosis of CKD

Figure 3.Efficacy of Na/Urea/GLU/NGAL in the diagnosis of CKD.圖3 Na/Urea/GLU/NGAL在診斷CKD時的效能

5 NGAL和Urea聯合診斷AKI和CKD的效能

ROC曲線分析結果顯示，NGAL和Urea聯合檢測AKI患者發生的靈敏度和特異性分別為81.9%和61.1%［ROC=0.731 （95% CI： 0.685， 0.776）］；NGAL和Urea聯合檢測CKD患者發生的靈敏度和特異性分別為62.7%和80.0%［ROC=0.794 （95% CI：0.755， 0.833）］，見圖4及表5。

表5 Urea和NGAL聯合診斷AKI和CKD時的效能Table 5.Efficacy of Urea combined NGAL in diagnosis of AKI and CKD

討 論

生物標志物是能較準確地反映疾病的發生和發展過程，并能客觀地被測量和評價的標志。作為能預測疾病發生的標志物，影響因素少、穩定性高、標本易獲得極為重要。Urea、Na、GLU和NGAL均可以通過重復抽取靜脈血進行檢測，具有方便的優勢。Urea是傳統的評價腎功能的指標。但研究表明，腎臟的代償、儲備和修復能力比較強，在腎損傷早期，腎臟功能和結構都不會發生改變，可以逆轉血流動力學損害，腎功能會得到很好的恢復［11］。當腎小球濾過率降幅＞50%，用于評價腎損傷的生物標志物Urea才會開始升高［12］。有研究顯示，Na水平較高會通過有機酸、嘌呤和氨基酸代謝等途徑使腎臟皮質和實質發生改變，還會增強糖酵解，引起磷酸戊糖途徑、還原型輔酶Ⅱ/氧化型輔酶Ⅱ等活性上調，改變腎臟功能［13］。因此，Na不僅對腎損傷有一定診斷價值，也作為危險因素加重腎損傷，在臨床上應該受到重視。血糖是各類并發癥的獨立危險因素［14］，有研究發現，血糖急性增高可誘導腎小管上皮細胞凋亡，且腎小球過濾的葡萄糖超過腎小管的重吸收能力，加重腎損傷［15］，但影響血糖因素包括遺傳、飲食、身體代謝能力等。

NGAL是一種在活化中性粒細胞中被發現的載脂蛋白，生理狀態下在腎組織中表達水平極低，可在腎小球自有濾過并在腎小管大量吸收［16］。當接觸腎毒性物質或發生腎損傷后，皮質腎小管、血液和尿液中會大量蓄積NGAL，在損傷3 h后便可以檢測到，NGAL是腎損傷后最先表達的蛋白質之一，其敏感性明顯高于Urea和Cr等傳統腎損傷標志物［17］。有研究表明，NGAL對早期診斷急性腎損傷和其腎臟轉歸具有預測作用［18-19］。還有相關研究表明，NGAL在預測CKD的進展中也有作用［20］。

良好的生物學標志物能及時、準確、客觀地作為檢測或評價腎功能的指標，并且有助于反映疾病的發生和發展，標本易獲取，干擾因素少，穩定性好的指標尤為重要。綜上所述，血清NGAL和Urea聯合早期診斷AKI和CKD效能較好，檢測外周血NGAL和Urea水平是較易獲取的患者數據，有助于提升AKI和CKD早期診斷。本研究存在一定的局限性，本研究為單中心研究，研究結果不一定能代表其他地區，后期需要開展多中心研究，并且增大樣本量進一步佐證。