納米羅勒精油/聚乙烯吡咯烷酮-聚乙烯醇水凝膠傷口敷料制備及性能表征

徐密,張良*,何志仙

（1.西安建筑科技大學 化學與化工學院，西安 710311；2.西安建筑科技大學 分析測試中心，西安 710311）

傷口敷料作為傷口保護屏障，能防止細菌感染并幫助傷口愈合[1]。理想的傷口敷料材料應具備良好的生物相容、抑菌、力學、保濕、溶脹、低黏附、透氣等性能，其中抑菌性能是關鍵[2-3]。為了賦予傷口敷料良好的抑菌性，引入了一系列抑菌劑，如抗生素、金屬和金屬氧化物，雖然它們具有良好的抑菌活性，但其安全和環保一直存在爭議[4-7]。羅勒是一種芳香草本植物，傳統上用于烹飪、民間醫學、制藥和食品工業，可以從其葉片中提取羅勒精油(BEO)，其中含有多種醇、酚類和烯烴，對大量致病菌的抗菌活性已被一些研究證實，是一種綠色、安全、環保且可再生的抑菌劑[8-9]。然而，BEO直接用于傷口治療面臨一些挑戰，包括它們的高揮發性及直接暴露在空間時變質的高風險，因此不能在較長時間內維持抑菌效果[10]。納米封裝已被提議作為克服精油以上問題的新方法[11]。通過封裝制備的聚合物納米粒子，如納米膠囊和納米球，可以控制精油的釋放，提高精油的物理穩定性和抑菌能力，并降低精油的揮發性[12]。納米沉淀是最簡單和可重復的封裝方法[13]。玉米醇溶蛋白(Zein)是一種從玉米中提取的兩親性蛋白質，不溶于水和無水乙醇，而溶于80%～92%的乙醇，具有良好的生物相容性，常用于封裝生物活性納米粒子[14]。

聚合物納米粒子單獨用于傷口愈合時，往往不能有效地支撐或保護傷口，因此需要合適的材料對其進行負載，具有三維網絡結構的水凝膠則被認為是良好的傷口敷料基材[15]。聚乙烯醇(PVA)是一種合成、生物相容、可降解、親水聚合物[16]。PVA獨特的半晶體結構使可以通過冷凍/解凍方法制備水凝膠，避免了化學交聯劑的引入，從而降低了水凝膠的毒性[17]。PVA基水凝膠具有類軟組織含水量，可以在治療過程中控制活性物質的釋放，加速皮膚傷口的愈合，在傷口敷料方面有很大潛力[18]。然而，作為傷口敷料需要進一步提高其力學性和抑菌性，因此通常制備基于PVA的雜化水凝膠[19]。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)表現出良好的生物相容性和生物降解性、高水溶性、優異的潤濕性和成膜性[20]。研究表明，PVP-PVA基水凝膠具有良好的物理性能，適合傷口敷料，并且能屏蔽細菌[21-23]。

在本工作中，首先通過納米沉淀法制備了具有核殼結構的納米羅勒精油(BEO@Zein)，然后通過凍融循環法制備了納米羅勒精油/聚乙烯吡咯烷酮-聚乙烯醇(BEO@Zein/PVP-PVA)水凝膠傷口敷料。對BEO@Zein和BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠進行表征，測試了水凝膠的抑菌性能及揮發性、力學性、溶脹性、保濕性、降解性和血液相容性。

1 實驗材料及方法

1.1 原材料

羅勒精油(BEO)、玉米醇溶蛋白(Zein，92%)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，相對分子質量MW=40 000)，上海源葉生物；聚乙烯醇(PVA，MW=105 000)，廣東光華科技；無水乙醇(分析純)，天津市富宇精細化工；磷酸鹽緩沖液(PBS，1X，pH=7.2～7.4)，上海泰坦科技；去離子水為實驗室自制。

1.2 樣品的制備

1.2.1 BEO@Zein的制備

在4.8wt%Zein的乙醇水溶液(乙醇與水的體積比為4∶1)中加入BEO (BEO和Zein的質量比為5∶1)，在劇烈攪拌下把上述混合溶液倒入其3倍體積的水中，得到BEO@Zein懸浮液。通過靜置揮發除去乙醇和部分水，把懸浮液濃縮為原體積的1/4。一部分懸浮液冷凍干燥為粉末保存，一部分以懸浮液狀態在4℃下保存。

在不加入BEO的條件下可以制備納米Zein(BEO和Zein的質量比為0∶1)，方法同上。

1.2.2 BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的制備

15wt%PVA水溶液中加入PVP (PVA和PVP的質量比為5∶1)，90℃下攪拌1 h后降為室溫，然后一邊攪拌混合溶液一邊加入BEO@Zein懸浮液(混合溶液與懸浮液的體積比為5.67∶5)，攪拌均勻后轉移至6孔培養皿，凍融循環至少3次。記作BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠。

15wt%PVA和8.5wt%PVA水溶液中分別加入PVP (PVA和PVP的質量比為5∶1)，超聲10 min除去內部氣泡，轉移至6孔培養皿，凍融循環至少3次。分別記作PVP-PVA水凝膠和PVP-8.5wt%PVA水凝膠。

15wt%PVA和8.5wt%PVA水溶液分別在90℃下攪拌1 h，超聲10 min除去內部氣泡，轉移至6孔培養皿，凍融循環至少3次。分別記作PVA水凝膠和8.5wt%PVA水凝膠。

1.3 樣品的表征

1.3.1 BEO@Zein的表征

通過掃描電鏡(SEM，GeminiSEM500，卡爾蔡司(上海)管理有限公司，電壓5 kV)觀察納米BEO@Zein的形貌。通過負染色技術分析納米Zein和BEO@Zein的結構，磷鎢酸負染色后進行透射電鏡(TEM，Hitachi H-7650，日立公司，120 kV)檢測成像。

1.3.2 BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的表征

通過SEM (Hitachi Regulus8100，日立公司，電壓5 kV)觀察PVA水凝膠、PVP-PVA水凝膠、BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的形貌。通過X射線衍射儀(XRD，Rigaku Ultma IV，日本理學)分析PVA水凝膠、PVP-PVA水凝膠、BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠在5°～90°的結晶性。通過熱重紅外聯用儀(ISQ 7000 Nicolet iS50 TGA/DSC3，新加坡THERMO公司)分析BEO、BEO@Zein、BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠、PVP-PVA水凝膠、PVA水凝膠在500～4 000 cm-1范圍內的紅外圖譜(FTIR)，并測試BEO、Zein、BEO@Zein、BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠在50～600℃范圍內的差式掃描量熱法(DSC)曲線和熱重(TG)曲線(氮氣氣氛，升溫速率10℃/min)。

1.4 性能測試

1.4.1 抑菌性能

(1) 探究BEO的揮發性及其對BEO@Zein/PVPPVA水凝膠抑菌性的影響。

首先，測定了等質量的BEO、BEO@Zein隨著時間在37℃空氣中的質量變化，揮發率(%)計算方式如下：

其中：M0是揮發前的質量；Mt是揮發后的質量。每組樣品平行重復3次。

然后，采用抑菌圈法對分別揮發了36 h和72 h的BEO (以濾紙為載體)、BEO@Zein/PVPPVA水凝膠進行抑菌實驗。把揮發了一段時間的BEO和水凝膠分別放在涂有大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)懸浮液的固體平板培養基中心，放在生化恒溫箱(37℃)中培養，24 h后測量抑菌圈的尺寸并拍照記錄。

(2) 探究BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠在PBS中對BEO的釋放規律及對抑菌性能的影響。

首先，把水凝膠置于1 mL PBS中，固定時間間隔后取500 μL溶液，并補充500 μL新鮮PBS。測量溶液在280 nm的吸光度，根據標準曲線得到BEO的含量，并計算BEO釋放率(%)，計算方式如下：

其中：E0是水凝膠中BEO總質量；Et是PBS中釋放的BEO質量。每組樣品平行重復3次。

然后把水凝膠與E.coli和S.aureus于液體培養基中共培養一段時間，在固定時間間隔后取50 μL菌懸液涂布于固體培養基上，37℃培養24 h。

(3) 通過抑菌圈法測試PVP-PVA水凝膠、BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠對E.coli和S.aureus的抑菌性。

(4) 探究BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的抗E.coli生物膜和S.aureus生物膜性能。24孔板中每孔500 μL菌懸液，在37℃培養24 h，棄去形成細菌生物膜的孔板中的懸液，用PBS沖洗3次。把水凝膠和500 μL液體培養基加入各孔，37℃培養24 h。棄去懸液，每孔中加入500 μL PBS，超聲振蕩10 min，分別在每孔中取50 μL涂布于固體培養基上，37℃培養24 h。每組樣品平行重復3次。

(5) 通過熱重紅外氣質聯用儀對BEO進行氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)分析，探究BEO的有效抑菌成分。用乙醇把BEO稀釋103倍，進樣量為1 μL，分流進樣，分流比10∶1，進樣口溫度220℃，升溫程序，初始溫度75℃，以5℃/min速率升至150℃，保留2 min，以10℃/min速率升至200℃，保留3 min。

1.4.2 力學性能

把PVA水凝膠、8.5wt%PVA水凝膠、PVP-PVA水凝膠、PVP-8.5wt%PVA水凝膠、BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠裁成20 mm×5 mm (長×寬)的尺寸，使用萬能實驗機(CMT6103，美特斯工業系統)以50 mm/min的拉伸速度進行實驗，測試內容為力-位移曲線、應力-應變曲線、拉伸強度、斷裂伸長率、拉伸模量。每組樣品平行測量3次。

1.4.3 溶脹性

把PVA水凝膠、PVP-PVA水凝膠、BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠浸泡在PBS溶液中，隨著時間的變化，記錄水凝膠溶脹前后的質量，溶脹率(%)計算方式如下：

其中：Gt為水凝膠溶脹后的質量；G0為水凝膠溶脹前的質量。每組樣品平行重復3次。

1.4.4 保濕性

通過水凝膠的失水率來評價其保濕性。把BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠分別保存在25℃和37℃下，隨著時間的變化，記錄水凝膠失水前后的質量，失水率(%)計算方式如下：

其中：R0為水凝膠失水前的質量；Rt為水凝膠失水后的質量。每組樣品平行重復3次。

1.4.5 降解性

把PVP-PVA水凝膠、BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠埋在自然環境下的土壤中，或浸泡在PBS溶液中，隨著時間的變化，記錄水凝膠降解前后的干重，降解率(%)計算方式如下：

其中：N0是水凝膠降解前的質量；Nt是水凝膠降解后的質量。每組樣品平行重復3次。

1.4.6 血液相容性

用5 mL的0.9wt%氯化鈉溶液稀釋新鮮抗凝劑全血4 mL，制備稀釋后的全血溶液。將BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠樣品切成1 cm×1 cm的小塊，用蒸餾水和0.9 wt%氯化鈉溶液沖洗。放入試管中，加入10 mL的0.9wt%氯化鈉溶液。試管在37℃下加熱30 min，然后加入0.2 mL稀釋的全血，在37℃下加熱1 h。1 000 r/min離心10 min后，用酶標儀(INFINITE 200 FRO，特康奧地利有限公司)測定在545 nm處上清液的吸光度。溶血率(%)計算方式如下：

其中：ODsam、ODneg和ODpos分別為BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠樣品、陰性對照和陽性對照。每組樣品平行重復3次。然后通過倒置熒光顯微鏡(AXIO，卡爾蔡司有限公司)對BEO@Zein/PVPPVA水凝膠、陰性對照和陽性對照處理的紅細胞進行光學圖像拍攝。

1.4.7 統計分析

使用Origin軟件進行統計分析。結果表示為一式3份測量值的平均值±標準偏差(n=3，顯著性水平p≤0.05)。用Studentt檢驗區分p值。

2 結果與討論

2.1 BEO@Zein和BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的制備與表征

BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的制備原理如圖1所示。在BEO@Zein制備過程中，采用了納米沉淀法，因此Zein和BEO必須同時溶解在同一溶劑中。因為Zein不溶于水和無水乙醇，而溶于80%～92%的乙醇，且BEO溶于乙醇，所以選擇了乙醇和水體積比為4∶1的乙醇水溶液作為溶劑[14]。首先，把BEO與Zein同時溶解在乙醇水溶液中，當水的含量驟然增大時，良好溶劑轉變為不良溶劑，BEO與Zein同時析出。兩親性Zein自發形成親水基團對外、疏水基團對內的空腔結構，疏水的BEO被包裹在疏水空腔內部，因此形成了以BEO為核、Zein為殼的納米粒子，即BEO@Zein。然后，把BEO@Zein加入水凝膠中，通過凍融循環PVA發生結晶，同時PVA與PVP形成分子間和分子內氫鍵，由此制備了物理交聯的BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠。

圖1 羅勒精油(BEO)@玉米醇溶蛋白(Zein)/聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-聚乙烯醇(PVA)水凝膠的制備示意圖Fig.1 Schematic diagram of basil essential oil (BEO)@Zein/polyvinylpyrrolidone (PVP)-polyvinyl alcohol (PVA) hydrogel preparation

BEO和Zein的初始比例不同，BEO@Zein的平均粒徑有所差異(圖2)。當BEO和Zein的質量比為5∶1時，平均粒徑相對較小(56.3 nm)。此外，隨著BEO的比例增大，BEO@Zein的抑菌性能也有所提高(圖3)。但是，當其質量比≥6∶1時，BEO會相對過量，從而影響BEO@Zein的形成和制備，且抑菌性能也不再增強。因此，以BEO和Zein質量比5∶1作為BEO@Zein的初始投料比。

圖2 納米Zein和不同質量比BEO@Zein納米粒子的平均粒徑Fig.2 Average particle size of Zein nanoparticles and BEO@Zein nanoparticles with different mass ratios

圖3 納米Zein和不同質量比的BEO@Zein納米粒子懸浮液對E.coli和S.aureus的抑菌性Fig.3 Bacteriostasis of Zein nanoparticle suspensions and BEO@Zein nanoparticle suspensions with different mass ratios against E.coli and S.aureus

TEM圖像顯示，納米Zein形成了以Zein為殼的空腔(殼密度大、顏色暗，空腔密度小、顏色亮)(圖4(a))?；赯ein的兩親性和BEO的疏水性，BEO@Zein形成了以Zein為殼、BEO為核的核殼結構，由于BEO的密度較小，因此核的顏色較亮(接近納米Zein空腔的顏色)，表明BEO被成功封裝(圖4(b))。SEM圖像則顯示，納米Zein(圖4(c))和BEO@Zein(圖4(d))都是形狀規則的球形顆粒，具有良好的分散性。此外，對BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠進行了表面形貌分析。PVA水凝膠(圖4(e))表面有少量的孔，引入PVP后，PVPPVA水凝膠(圖4(f))變光滑了，這可能是PVP的成膜性造成的。在PVP-PVA水凝膠中加入BEO@Zein懸浮液后，BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠表面的孔明顯增多，且孔徑變大，這可能與水凝膠含水量增大有關(圖4(g))。BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的多孔結構有利于提高其溶脹性能，幫助吸收傷口滲出物。同時，在更高倍數下觀察到BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠表面分布的少量BEO@Zein，其大部分都分散在水凝膠內部(圖4(h))。

圖4 納米Zein的TEM (a)和SEM圖像(c)；BEO@Zein的TEM (b)和SEM圖像(d)；PVA水凝膠(e)、PVP-PVA水凝膠(f)、BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠((g),(h))的SEM圖像Fig.4 SEM (a) and TEM (c) images of Zein nanoparticles; SEM (b) and TEM (d) images of BEO@Zein nanoparticles; SEM images of PVA hydrogel (e),PVP-PVA hydrogel (f) and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel ((g),(h))

為進一步證明BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的制備，對其進行了FTIR圖譜(圖5(a))分析。BEO在2 970 cm-1處有C-H sp3振動，在1 515 cm-1處有苯環骨架振動。BEO@Zein出現蛋白特征譜帶，1 655 cm-1的峰是由酰胺I的C=O振動引起的，1 544 cm-1的峰是由酰胺II的C-N和C-H振動引起的。PVA水凝膠在2 937 cm-1、1 655 cm-1和1 094 cm-1處的峰分別代表C-H、C=O和C-O sp3振動。PVP-PVA水凝膠在1 293 cm-1出現了一個新峰，是PVP的C-N振動引起的，同時在1 655 cm-1的峰偏移到1 652 cm-1且有所增強，可能是由于PVP和PVA的C=O雙鍵振動重疊。BEO@Zein(如-C-H、苯環骨架、酰胺I、酰胺II)和PVP-PVA水凝膠(如C-H、C=O、C=N、C-O)的特征峰在BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的圖譜上均有體現，證明了水凝膠的成功制備。此外，在3 336 cm-1處有寬且強的O-H振動峰，表明BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠中形成了氫鍵。

圖5 水凝膠的FTIR圖譜(a)、XRD圖譜(b) 、DSC曲線(c)和TG曲線(d)Fig.5 FTIR spectra (a),XRD patterns (b),DSC curves (c) and TG curves (d) of hydrogel

對PVA、PVP-PVA和BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠進行了XRD實驗，如圖5(b)所示，水凝膠在衍射角2θ=19.7°和40.8°有與PVA結晶對應的衍射峰，表明水凝膠中形成了PVA結晶的網絡結構[23]。對比不同水凝膠在19.7°處的峰強度，在BEO@Zein加入水凝膠后，峰強度降低了約1/5，說明PVA結晶性有所降低。這可能是由于BEO@Zein的加入降低了水凝膠PVA含量，而PVA含量越低，PVA結晶性越差，水凝膠交聯度就越低，相反，PVA含量越高，PVA結晶性越好，水凝膠交聯度就越高。因此，PVA結晶性會影響水凝膠的力學性能和降解性。

通過DSC曲線(圖5(c))和TG曲線(圖5(d))分析了BEO@Zein和BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的熱穩定性。在DSC曲線中，BEO在187.52℃有一個吸熱峰；Zein在330.76℃有一個吸熱峰；BEO@Zein在328.78℃也有一個吸熱峰，峰值溫度與Zein接近，但是未出現BEO的特征吸熱峰，可能是由于核殼結構提高了BEO的熱穩定性。BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠在107.87℃有一個與水有關的吸熱峰，沒有出現BEO的特征吸熱峰，這說明水凝膠對BEO也起到了較好的保護作用。在TG曲線中，BEO@Zein有兩個失重階段，第一個階段13wt%的失重與游離BEO有關，第二個階段79wt%的失重與Zein和被封裝的BEO有關，但是其失重時的溫度比純BEO高，再次證明BEO@Zein可能提高了BEO的熱穩定性。BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠也有兩個失重階段，第一階段主要是水，第二階段主要是BEO和PVA等分子的分解，但其溫度仍比純BEO高?？梢?，BEO@Zein的核殼結構和BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠網絡都有利于提高BEO的熱穩定性。

2.2 BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠緩釋抑菌性能和抑菌機制

由于BEO具有較強的揮發性，可能會對抑菌效果產生不利影響，因此首先對BEO及BEO@Zein進行了揮發性測試，結果如圖6(a)所示，12 h后，BEO的揮發率為83%，但BEO@Zein的揮發率僅為2%，且之后其揮發率沒有明顯增大。這明顯的差異說明BEO@Zein對BEO的包封可以有效降低它的揮發性。形成BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠后PVP-PVA水凝膠包裹BEO@Zein納米顆粒，進一步延緩BEO的釋放。為了進一步驗證BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠對BEO緩釋性能，水凝膠在PBS中BEO的釋放如圖6(b)所示，在前10 h內以較快的速度釋放，呈現近乎線性的釋放規律，釋放率最高達到44%。此后，BEO釋放速度減慢，在24 h釋放率達到52%。因此，從空氣和模擬體液中均可以表明上述材料對BEO釋放驅動力主要是濃度梯度擴散控制，而BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠對BEO釋放具有減緩功能，其緩釋的原因是首先BEO通過BEO@Zein的外層，受到蛋白中氨基和羥基與BEO的氫鍵作用延緩其擴散速度，然后BEO進入水凝膠后，同樣受到水凝膠的氫鍵作用減緩其擴散。氫鍵作用在紅外的表征中已經得到證實。與沒有氫鍵作用的BEO相比，該水凝膠體現出對BEO緩慢釋放的特性，也因此使水凝膠具有了持續抑菌的優異性能。由圖6(c)可以看出，BEO在揮發36 h后，已失去抑菌性，但同一時間下水凝膠仍具有較好的抑菌性，且揮發72 h后還有明顯的抑菌圈。同時BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠在模擬體液中的緩釋抑菌性也能從圖6(d)中得到證實，0.5 h后對E.coli和S.aureus的抑制率分別為97.59%和25.12%，1 h后抑制率均為100%。由此可知，該水凝膠具有良好的緩釋抑菌性能。

圖6 (a) BEO和BEO@Zein在37℃空氣中的揮發率；(b) BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中對BEO的釋放；(c) BEO (以濾紙為載體)和BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠在37℃空氣中揮發36 h和72 h后對E.coli的抑菌性；(d) BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠在模擬體液中釋放BEO對E.coli和S.aureus的抑菌性Fig.6 (a) Volatilization ratio of BEO and BEO@Zein in 37℃ air; (b) BEO release of BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel in phosphate buffer saline (PBS);(c) Antibacterial activity of BEO (filter paper as carrier) and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel on E.coli after volatilization in 37℃ air for 36 h and 72 h;(d) Bacteriostasis of BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel releasing BEO in simulated body fluids on E.coli and S.aureus

水凝膠的持續抑菌性如圖7(a)和圖7(b)所示，PVP-PVA水凝膠沒有抑菌性，負載BEO@Zein后，BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠對E.coli和S.aureus均有良好且持久的抑菌性，抑菌24 h后抑菌圈直徑分別為20 mm和28 mm，且持續抑菌72 h后仍有較大的抑菌圈?？梢?，BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠具有優異的抑菌持久性。

圖7 PVP-PVA水凝膠和BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠對E.coli (a)和S.aureus (b)持續抑菌24 h和72 h后的抑菌性；BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠抗E.coli生物膜(c)和S.aureus生物膜(d)性能Fig.7 Antibacterial activity of PVP-PVA hydrogel and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel against E.coli (a) and S.aureus (b) after 24 h and 72 h of sustained bacteriostasis; BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel against E.coli biofilms (c) and S.aureus biofilms (d)

細菌感染與細菌生物膜的形成密切相關。BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠對細菌生物膜的抑制結果如圖7(c)和圖7(d)所示，水凝膠顯著抑制了E.coli和S.aureus形成的生物膜，對S.aureus生物膜的抑制率可以幾近達到100%，表明該水凝膠具有良好的抗生物膜性能。

BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的緩釋抑菌機制如圖8所示。把水凝膠貼在皮膚傷口處，BEO依次從納米粒子和水凝膠中緩慢釋放到傷口上。BEO中含有抑菌成分丁香酚，它具有破壞微生物細胞膜的能力，可導致細胞壁破裂、細胞膜滲透損傷、成分泄漏和細胞死亡[10]。因此，BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠可以通過緩釋BEO抑制傷口發生細菌感染。此外，在上述抑菌實驗中該水凝膠對S.aureus的抑菌效果更好，這可能是由于BEO中丁香酚等疏水化合物能與S.aureus等革蘭氏陽性菌的細胞膜直接相互作用，而E.coli等革蘭氏陰性菌的親水細胞膜會阻礙疏水化合物的滲透，因此E.coli對BEO的抵抗力更強[24]。

圖8 BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的緩釋抑菌機制示意圖Fig.8 Schematic diagram of slow-release bacteriostatic mechanism of BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel

2.3 BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的力學性能、溶脹保濕性和降解性

作為傷口敷料應該具備一定的力學性能，因此對BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠進行了力學性能的測試。如圖9(a)所示，在PVA中引入PVP，PVA水凝膠和8.5wt%PVA水凝膠的拉伸強度分別增大到0.64 MPa和0.28 MPa，斷裂伸長率也分別提高至479.20%和425%。其性能改善的原因應是PVP中的羰基(C=O)和PVA中的羥基(O-H)形成了氫鍵相互作用力[25]。對比PVA水凝膠和8.5wt%PVA水凝膠及PVP-PVA水凝膠和PVP-8.5wt%PVA水凝膠，前者PVA的質量分數高，力學性能也更好。這是由于水凝膠中PVA含量越高，PVA結晶性越好，力學性能越強。然而，在PVPPVA水凝膠中加入BEO@Zein懸浮液，水凝膠中PVA的質量分數降為8.5wt%，因此BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的力學性能有所下降，但其拉伸強度和斷裂伸長率仍可達到0.33 MPa (大于PVP-8.5wt%PVA水凝膠)和402.52%。

圖9 (a) PVA水凝膠、8.5wt%PVA水凝膠、PVP-PVA水凝膠、PVP-8.5wt%PVA水凝膠、BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的應力-應變曲線；(b) PVA水凝膠、PVP-PVA水凝膠、BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠在PBS溶液中的溶脹率曲線；(c) BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠在37℃和25℃下的失水率曲線；(d) PVP-PVA水凝膠和BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠在土壤和PBS溶液中的降解率曲線Fig.9 (a) Stress-strain curves of PVA hydrogel,8.5wt%PVA hydrogel,PVP-PVA hydrogel,PVP-8.5wt%PVA hydrogel,and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel;(b) Swelling ratio curves of PVA hydrogel,PVP-PVA hydrogel,and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel in PBS solution; (c) Water loss ratio curves of BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel at 37℃ and 25℃; (d) Degradation ratio curves of PVP-PVA hydrogel and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel in soil and PBS solution

傷口敷料應該具有吸收傷口滲出液并維持傷口環境濕潤的作用，因此對BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠進行了溶脹測試。如圖9(b)所示，PVA水凝膠對PBS溶液的吸收在8 h后基本飽和，溶脹率可以達到229%以上，PVP-PVA水凝膠在同一時間溶脹率達到285%以上，這可能要歸因于PVP的高極性基團，使其具有強親水性。由于BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的多孔結構及Zein的親水基團，因此其初始溶脹速率相對更快，8 h的溶脹率為332%。同時，BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的失水率曲線如圖9(c)所示，在25℃和37℃下，水凝膠8 h內的失水率分別達到了40%和85%以上。在同一時間下BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的溶脹率要遠高于失水率。因此，BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠能通過吸收傷口滲出液維持傷口環境濕潤，即具有良好的溶脹保濕性。

除此之外，BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠傷口敷料還具有降解性。Zein、PVP和PVA本身都具有良好的降解性[26]。降解率如圖9(d)所示，水凝膠在土壤和PBS溶液中的降解率非常接近。PVPPVA水凝膠和BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的降解率在10天后分別為20%和50%，此后，降解速率變慢。在70天后，BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的降解率為60%，是PVP-PVA水凝膠的2倍。BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠整體的降解率明顯高于PVPPVA水凝膠，是由于BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的PVA含量低于PVP-PVA水凝膠，水凝膠中PVA含量越低，PVA結晶性越差，水凝膠交聯度越小，因此降解性越好。隨著時間的不斷增加，BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的降解率一直在緩慢增加，如果有充足的時間，水凝膠有可能被完全降解。

2.4 BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠的血液相容性

血液相容性是傷口敷料最重要的性能之一，以防止對人體造成傷害，因此用紅細胞溶血實驗評價血液相容性。PBS和水處理的紅細胞分別作為陰性對照和陽性對照。BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠處理的紅細胞的溶血率基本為0 (圖10(a))，離心后上清液為淺黃色透明溶液(圖10(b))，與陰性對照接近。光學圖像顯示，與陰性對照(圖10(c))相比，紅細胞在BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠處理后沒有發生明顯的形態學轉變(圖10(d))，說明紅細胞基本沒有發生溶血現象。因此，BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠具有良好的血液相容性。

圖10 水、PBS和BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠處理的紅細胞的溶血率(a)和圖像(b)；PBS (c)和BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠(d)處理的紅細胞的光學圖像Fig.10 Hemolysis ratio (a) and pictures (b) of red blood cells treated with water,PBS and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel; Optical images of red blood cells treated with PBS (c) and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel (d)

3 結 論

(1) 納米羅勒精油(BEO@Zein)形成了以BEO為核、Zein為殼的納米結構，其形貌為規則的球形，平均粒徑為56.3 nm。BEO@Zein能提高BEO的熱穩定性，并降低其揮發性。

(2) 納米羅勒精油/聚乙烯吡咯烷酮-聚乙烯醇(BEO@Zein/PVP-PVA)水凝膠傷口敷料可以緩慢釋放BEO，從而表現出優異的緩釋抑菌性能。此外，水凝膠還表現出顯著的抗細菌生物膜性能，對S.aureus生物膜的抑制率幾近達到100%。

(3) BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠以PVA結晶和氫鍵交聯，具有較好的力學性能(斷裂伸長率為402.52%)，同時多孔結構使其具有較強的溶脹保濕性(溶脹率8 h可達332%，遠高于同期失水率)，此外還具有良好的降解性。

(4) BEO@Zein/PVP-PVA水凝膠處理過的紅細胞的溶血率基本為0，細胞也沒有發生形態學轉變，具有良好的血液相容性。