鈦表面PAMAM-PQQ功能層構建及對心內壁細胞生物學行為的影響

王義隆,黃金全,袁婭婷,宋思齊,陳俊英

（西南交通大學 材料先進技術教育部重點實驗室，成都 610031）

目前，心血管疾病仍是國內死亡的主要原因[1]。植/介入治療是目前心血管疾病重要治療手段，因此，植/介入器械在臨床已經廣泛使用。常見的植入器械包括藥物洗脫支架、心臟瓣膜和心臟起搏器等。植入器械(如心臟起搏器)植入時，材料表面與周圍內皮細胞(Endothelial cells，EC)、心肌細胞(Myocardial cells，MC)及血液相接觸。材料的植入還會對植入部位造成損傷從而引起炎癥[2-3]，產生氧化應激，進一步損傷內皮細胞和心肌細胞的功能。因此，植入材料對內皮細胞和心肌細胞的保護作用及良好的血液相容性[4]尤為重要。通過對材料表面進行改性，能有效改善植入材料的生物相容性。

目前，研究者通過表面接枝等技術對金屬材料表面進行功能化修飾，例如接枝多肽、肝素等生物功能分子來提高植入器械表面內皮化、抗凝血能力[5-7]。其中，聚酰胺胺樹狀大分子(Polyamido amine，PAMAM)是一種內部具有空腔結構、表面分布大量可修飾官能團的納米材料，在藥物傳遞[8]和材料表面改性[9]中具有很好的應用價值。Li等[10]研究顯示，材料表面固定PAMAM能維持內皮細胞的生長及能降低血小板的黏附與激活。吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)是一種水溶性醌類化合物，是繼煙酰胺和黃酮核苷酸后發現的第三種輔酶[11]。PQQ具有抗炎、抗氧化、保護神經及保護心臟的能力[12-17]。已有研究者探究了PQQ對心肌肥大[15]、心肌纖維化[16]、心力衰竭[17]等的作用，但都是基于喂養[18-21]和注射[22-24]的方式，而未有心血管植入器械材料表面功能化修飾的相關研究。因此，本文將PAMAM固定于鈦表面后，利用其氨基基團，采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺/N-羥基丁二酰亞胺(EDC/NHS)體系，將功能分子PQQ引入到材料表面，構建PAMAM-PQQ功能層，并探究不同濃度PQQ材料表面的血液相容性和細胞相容性及抗氧化損傷能力。

1 實驗材料及方法

1.1 原材料

鈦(Ti)，寶雞有色金屬股份有限公司；樹狀大分子聚酰胺胺(PAMAM，第三代)，晨源分子新材料有限公司；吡咯喹啉醌(PQQ)，上海阿拉丁生化科技有限公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(1-ethyl-(3-dimethylaminopropyl)carbamide diimide，EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(Nhydroxysuccinimide，NHS)、超純水、無水乙醇、酸性橙、氫氧化鈉、活性氧熒光探針(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)，Sigma-Aldrich；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；丙二醛(Malonaldehyde，MDA)試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 PAMAM-PQQ功能層構建

圖1為樣品表面功能層構建示意圖，具體工藝及其參數如下。

圖1 聚酰胺胺(PAMAM)-吡咯喹啉醌(PQQ)功能層的制備過程Fig.1 Preparation process of polyamido amine (PAMAM)-pyrroloquinoline quinone (PQQ) functional layer

(1) 將鈦基材打磨并拋光后分別使用無水乙醇和超純水超聲清洗，樣品標記為Ti。

(2) 配制3 mol/L的氫氧化鈉溶液；將Ti浸沒于氫氧化鈉溶液中，置于80℃條件下反應12 h，使用超純水清洗，獲得堿處理后的Ti，樣品標記為TiOH。

(3) 在TiOH樣品表面滴加質量濃度為1 mg/mL的PAMAM溶液，室溫下反應12 h，樣品標記為TiP。

(4) 分別配制濃度為200、250、300 nmol/mL的PQQ溶液，使用EDC/NHS活化PQQ，將共混溶液滴加于TiP樣品表面，室溫下反應24 h，將樣品標記為TiPP，根據PQQ濃度分別標記樣品為TiPP200、TiPP250、TiPP300，如表1所示。

表1 各樣品編號Table 1 Marking of each sample

1.3 材料學表征

采用X射線光電能譜XPS (K-Alpha，Thermo Scientific)、傅里葉紅外光譜(Nicolet iS50，Thermo Scientific)分別對材料表面的成分、結構及官能團進行表征。采用掃描電子顯微鏡(JSM 7800F Prim，日本電子株式會社)觀察樣品表面形貌，并采用水接觸角檢測儀對樣品表面水接觸角進行檢測。進一步采用酸性橙檢測材料表面氨基的變化量，并檢測樣品表面功能分子釋放特征。

1.4 血液相容性評價

1.4.1 血小板黏附和激活實驗

取新鮮血液，1 500 r/min離心15 min，上層得到富含血小板的富板漿(PRP)；在樣品表面滴加PRP，37℃孵育1 h；生理鹽水清洗樣品表面，使用質量分數為2.5wt%的戊二醛固定，過夜；將固定好的樣品使用羅丹明染色，采用熒光顯微鏡(OLYMPUS IX73，奧林巴斯株式會社)觀察材料表面的血小板；將樣品脫水，噴金后使用SEM觀察血小板形態。

1.4.2 凝血實驗

取新鮮血液滴加于樣品表面，37℃下分別孵育30 min、45 min；到達時間后加入超純水靜置3 min，收集上清液，采用酶標儀(Gen5，美國Biotek)檢測吸光度值。

1.5 體外細胞學評價

采用內皮細胞和H9C2心肌細胞(以下稱為心肌細胞)探究不同濃度PQQ功能層對細胞增殖和遷移的影響。將細胞以1×104個/mL的密度接種至樣品表面，培養1天、3天后，使用質量分數為2.5wt%的戊二醛固定，羅丹明染色，熒光顯微鏡下觀察細胞形態，使用細胞計數試劑(CCK-8)試劑檢測細胞活性。

制備1 cm×2 cm的Ti樣品并將其對折90°，在一端構建功能層，另一端為未改性表面。先將細胞以5×104個/mL的細胞密度接種至未改性表面，培養12 h后，再將樣品翻轉90°，添加新鮮培養基，繼續培養24 h。使用質量分數為2.5wt%的戊二醛固定，羅丹明染色，熒光顯微鏡下觀察細胞遷移情況。

1.6 抗氧化損傷能力評估

構建H2O2損傷下內皮細胞和心肌細胞的氧化損傷模型。將細胞以5×104個/mL的密度接種在樣品表面，培養24 h后，使用200 μmol/L的H2O2與細胞共培養6 h。使用吖啶橙(Acridine orange hydrochloride，AO)/碘化丙啶(Propidium iodide，PI)試劑檢測內皮細胞凋亡率，使用DCFH-DA探針檢測內皮細胞內活性氧(Reactive oxide species，ROS)的含量。通過檢測心肌細胞LDH釋放量、SOD活性和MDA生成量來評價材料對心肌細胞抗氧化損傷的能力。

1.7 統計分析

對實驗數據進行統計學分析，結果采用3次測定的均值±標準差(SD)表示。然后進行單因素方差分析，確定不同組間的差異有統計學意義。當p值小于0.05時，認為樣本組間差異顯著。*、**、***分別表示p＜ 0.05、p＜ 0.01、p＜ 0.001。

2 結果與討論

2.1 PAMAM-PQQ功能層表征

圖2為改性前后樣品FTIR結果。在3 300 cm-1處TiOH、TiP及TiPP樣品均有吸收峰，該吸收峰為O-H的伸縮振動峰。樣品TiP表面含有氨基，因此，引入了N-H伸縮振動，該特征吸收峰在3 200～3 500 cm-1處發生重疊；1 640 cm-1和1 550 cm-1處分別出現了酰胺I帶C=O的伸縮振動峰及酰胺II帶的N-H面內彎曲振動吸收峰，由此可以判斷PAMAM成功接枝到表面上。TiPP樣品中1 550 cm-1處振動峰減弱，這是由于PQQ分子上的羧基基團消耗了表面的氨基導致的，且在1 600～1 700 cm-1之間出現了多個峰，這是喹啉環中C=N和C=C、醌和羧基中的C=O伸縮振動疊加引起的，因此，該結果表明PQQ在表面成功接枝。

圖2 各樣品FTIR圖譜Fig.2 FTIR spectra of samples

圖3為改性前后樣品XPS檢測結果。相比于TiOH，TiP中出現了N元素峰，這是由于PAMAM分子中有大量含N元素的酰胺基團和氨基基團；由于PQQ分子元素組成和PAMAM相同，因此TiPP和TiP相比沒有出現新的元素峰。

圖3 各樣品XPS全譜Fig.3 XPS spectra of samples

表2為改性前后樣品表面各元素含量。通過各元素含量計算得到兩個樣品前后C/N的原子比由4.3增加至4.9。這是由于PAMAM分子接枝PQQ后，C元素增加量大于N元素增加量，且隨著接枝PQQ分子數量增加，C/N的比值會逐漸增加。

表2 各樣品表面元素原子含量Table 2 Atomic proportion of each element on the sample surface

圖4為改性前后樣品表面氨基暴露量檢測結果。由于PAMAM含有大量的氨基基團，因此，相對比TiOH，TiP表面氨基量顯著增加。但在接枝PQQ后，消耗了材料表面氨基量，使表面氨基量有所減少。因此，可以說明PAMAM和PQQ均引入到了材料表面。

圖5為改性前后樣品SEM圖像。堿活化后的TiOH樣品表面呈現多孔網狀結構。根據Reggente等[25]研究顯示，該多孔網狀結構呈微納厚度。由于PAMAM和PQQ均是水溶性分子，因此引入PAMAM和PQQ后對樣品表面形貌無明顯影響。

圖5 各樣品表面SEM圖像Fig.5 SEM images of the sample surface

圖6為改性前后樣品表面水接觸角檢測結果。樣品表面水接觸角的變化反映材料表面親疏水性的變化。接枝了PQQ后樣品表面水接觸角有所降低，說明PQQ的引入使樣品表面更加親水，這與樣品表面呈現網狀多孔結構及表面富含有大量親水基團有關[26]。有相關研究顯示，提高材料表面的親水性能提高材料表面的生物相容性[27]。

圖6 各樣品的水接觸角Fig.6 Water contact angle of samples

接著，檢測了樣品表面一周時間內PQQ的釋放量。圖7為樣品表面PQQ釋放曲線。由于表面接枝量較少，因此，選取了最高濃度樣品進行檢測?？梢钥闯?，一周時間內釋放總量僅為7.1%，說明功能層具有良好的穩定性。由于是利用靜電作用先將PAMAM固定在Ti表面，再將PQQ分子引入，因此PQQ的釋放量反映出PAMAM-PQQ功能層的釋放特征。此外，鈦具有較高的強度及良好的抗腐蝕性能，因此，構建的功能層不易降解且具有良好的穩定性。

圖7 改性后樣品TiPP300表面PQQ釋放量Fig.7 Release of PQQ from the modified TiPP300 sample surface

2.2 樣品表面血小板黏附與激活結果

圖8為樣品表面血小板熒光及數量統計結果。由圖8(a)可得，TiOH表面黏附有大量的血小板。在表面引入PAMAM后，TiP樣品表面血小板數量變少。相較于TiP，接枝PQQ后樣品表面血小板數量均有減少。圖8(b)中血小板黏附數量統計結果顯示，隨著PQQ濃度升高，血小板黏附數量減少。

圖8 各樣品表面血小板熒光及數量統計結果Fig.8 Results of platelet fluorescence and number on the sample surface

圖9為樣品表面血小板SEM掃描結果。TiOH表面血小板嚴重激活，血小板幾乎呈完全鋪展形態。TiP表面部分血小板也伸出偽足，但激活程度不如TiOH表面。TiPP200、TiPP250和TiPP300表面血小板數量較少，少量伸出偽足，其中TiPP300表面血小板呈現圓形、幾乎無偽足伸出，說明引入PQQ后材料表面具有良好的抗血小板黏附和激活能力。

圖9 樣品表面血小板微觀形貌的SEM圖像Fig.9 SEM images of platelets on the sample surface

2.3 樣品表面凝血結果

將樣品和血液孵育一定時間后，檢測上清液的吸光度值(Optical density，OD)可以反映材料表面凝血情況。吸光度值越大，反映樣品表面生成的血栓量越少。圖10為血液在樣品表面孵育30 min、45 min后上清液吸光度值結果。引入PAMAM和PQQ的樣品上清液吸光度值均高于TiOH樣品。TiPP200、TiPP250和TiPP300吸光度值均高于TiP，其中TiPP250和TiPP300吸光度值高于TiPP200。說明接枝PQQ后提高了材料表面抗凝血能力，且TiPP250和TiPP300樣品效果更優。

圖10 樣品表面30 min和45 min凝血結果Fig.10 Coagulation results at 30 min and 45 min on the sample surface

2.4 樣品表面內皮細胞活性、增殖及遷移結果

植入材料表面除了具有良好的抗凝能力外，還應具有促內皮的能力。圖11為樣品表面內皮細胞靜態培養結果。圖11(a)和圖11(b)為內皮細胞靜態培養1天、3天的熒光圖和CCK-8結果。培養1天時，各樣品表面細胞數量與細胞活性無明顯差異，細胞均勻鋪展在樣品表面，且細胞形態較好。培養至3天后，各樣品細胞的數量和活性都有提高，TiPP200、TiPP250和TiPP300表面細胞數量明顯多于TiP表面。說明材料表面利于細胞黏附和增殖。其中，TiPP200活性稍優于TiPP250和TiPP300，這是由于PQQ屬于醌類小分子化合物，醌濃度低時作為抗氧化劑，過高的濃度時起到促氧化劑的作用，對細胞具有毒性[28]。

圖11 各樣品內皮細胞靜態培養結果Fig.11 Results of endothelial cell culture of samples

進一步探究了材料表面內皮細胞的遷移能力。由圖11(c)和圖11(d)可以看出，接枝了PQQ的樣品遷移距離顯著優于TiP表面；且隨著PQQ濃度的增加，遷移距離也隨之增加。Ge等[29]研究發現在材料中加入PQQ后提高了內皮細胞的遷移距離，本實驗結果與其一致。

2.5 樣品表面心肌細胞活性、增殖及遷移結果

H9C2心肌細胞，來源于BD1X大鼠胚胎心臟組織，該細胞易于培養，常被用于研究心肌細胞分化的前體干細胞模型。由于植入材料也與心肌細胞相接觸，因此，材料對心肌細胞也應具有較好的相容性。

圖12為心肌細胞在材料表面靜態培養結果。圖12(a)和圖12(b)分別為細胞靜態培養1天、3天的熒光圖和細胞計數試劑(Cell counting Kit-8，CCK-8)結果，圖12(c)和圖12(d)為細胞遷移熒光圖和遷移距離結果。由圖12(a)可得，培養1天時，各樣品組之間數量無明顯差異，但TiPP250和TiPP300表面細胞形態亮好，多表現為梭形。培養3天后，各樣品表面細胞數量都有明顯增多，其中接枝PQQ的樣品表面細胞數量多于TiP樣品。由圖12(b)可得，接枝PQQ的樣品細胞活性均高于TiP樣品。

圖12 各樣品心肌細胞靜態培養結果Fig.12 Results of myocardial cells culture of samples

由圖12(c)和圖12(d)遷移結果可得，PQQ的引入顯著提高了心肌細胞的遷移距離，且TiPP300樣品促進心肌細胞遷移效果最好。這是由于細胞在遷移過程中會受到能量的影響[30]，而PQQ可以增加細胞中健康線粒體的數量[28]，從而提供更多的能量促進細胞的遷移。

2.6 功能層抗氧化損傷能力評估結果

H2O2是體內多種代謝途徑的產物，是重要的活性氧之一，其可以氧化細胞內核酸、蛋白質等分子，還可以氧化細胞膜的脂質及蛋白質，引起細胞膜功能受損。因此，選用H2O2損傷細胞來模擬體內氧化應激微環境。

2.6.1 H2O2損傷下內皮細胞行為

圖13為H2O2損傷后內皮細胞檢測結果。圖13(a)和圖13(b)分別為內皮細胞活死染色結果(上面為活細胞，下面為死細胞)和細胞凋亡率結果。由圖13(a)可得，在H2O2損傷后，TiP樣品出現大量細胞凋亡，TiPP200、TiPP250和TiPP300僅有少量凋亡細胞。圖13(b)細胞凋亡率結果顯示，TiP樣品細胞凋亡率為33.5%，TiPP200、TiPP250和TiPP300細胞凋亡率分別為7.9%、5.8%、4.1%，PQQ的引入顯著降低了由H2O2引起的內皮細胞凋亡。

圖13 各樣品內皮細胞活死染色結果Fig.13 Results of live and dead staining of endothelial cells of samples

在H2O2損傷內皮細胞后，使用DCFH-DA熒光探針染色檢測內皮細胞內的ROS含量，如圖14所示?？梢钥闯?，TiPP200、TiPP250和TiPP300樣品表面熒光亮度低于TiP表面，說明PQQ的引入能抑制細胞內的ROS生成。

圖14 各樣品內皮細胞內活性氧(ROS)含量檢測結果Fig.14 Results of reactive oxide species (ROS) content in endothelial cells of samples

2.6.2 H2O2損傷下心肌細胞行為

圖15為H2O2損傷后心肌細胞染色結果。TiP樣品表面細胞形態呈現為圓形，部分細胞出現空泡化，這說明細胞狀態不好且趨于凋亡。TiPP200、TiPP250和TiPP300樣品表面細胞鋪展均勻，形態良好呈長梭形。

圖15 各樣品H2O2損傷后心肌細胞熒光圖片Fig.15 Fluorescence images of myocardial cells of samples after H2O2 injury

圖16為H2O2損傷后心肌細胞LDH釋放量、SOD活性和MDA生成量結果。TiPP200、TiPP250和TiPP300樣品降低了LDH釋放量，提高了SOD活性及減少MDA的生成量。說明PQQ的引入能降低H2O2帶來的損傷及對心肌細胞具有保護作用。

圖16 各樣品H2O2損傷下心肌細胞檢測結果Fig.16 Results of myocardial cells detection of samples under H2O2 injury

PQQ可以催化O2與O2-相互轉化，從而在PQQ和PQQH2(PQQ還原型)間轉換；PQQH2還可以與單線態氧、羥自由基等反應再次氧化為PQQ，以此來維持體內氧自由基平衡[31]。PQQ可以通過自身氧化還原循環來調節LDH酶活性，促進丙酮酸生成[32]。PQQ還可以作為非共價結合輔基與超氧化物歧化酶SOD協同消化自由基，降低自由基對細胞的傷害[33]。

3 結 論

(1) 利用聚酰胺胺(PAMAM)端部氨基基團，將吡咯喹啉醌(PQQ)引到Ti表面，成功構建了PAMAM-PQQ功能層。PAMAM及PQQ固定后表面呈現多孔網狀結構及具有高度親水性，且功能層具有良好的穩定性。

(2) PQQ的引入減少了表面血小板黏附數量及激活程度，并表現出較好的抗凝血能力，其中使用PQQ濃度為300 nmol/mL時效果更優。

(3) PQQ的引入提高了內皮細胞和心肌細胞活性、增殖及遷移能力，同時，PQQ均以濃度依賴的方式促進兩種細胞遷移。

(4) PQQ的引入減少了內皮細胞因氧化損傷引起的死亡且抑制胞內活性氧(ROS)產生。PQQ的引入也降低了氧化損傷后的心肌細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放量、丙二醛(MDA)生成量及提高了細胞內超氧化物歧化酶(SOD)的活性，降低了心肌細胞受到的氧化損傷。