燈盞花素對牙齦卟啉單胞菌脂多糖誘導的人牙齦成纖維細胞損傷的影響

晁曉芹 ,趙國廷 ,董振耀 ,馬民英 ,姚毅章

青海省第五人民醫院1口腔科,2醫學中心 西寧市,810000

牙周炎是主要由菌斑微生物引發的一種口腔疾病,是成人失去牙齒的主要原因,牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg) 是牙周疾病的重要致病菌,該菌外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) 可導致牙周組織細胞破壞,使牙周炎病情加重,因此,減輕Pg-LPS (以下簡稱LPS) 誘導的人牙齦成纖維細胞 (human gingival fibroblasts,HGFs) 炎性損傷對預防和治療牙周疾病具有重要意義[1-3]。燈盞花素(breviscapine,BVP) 是從菊科植物中提取的黃酮類成分,主要成分為燈盞乙素,具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、擴張血管等多種藥理學作用[4-5]。研究顯示,BVP 可通過上調微小RNA (microRNA,miR) miR-499 的表達,抑制LPS 誘導的心肌細胞氧化應激和細胞凋亡,從而保護LPS 所致心肌細胞損傷[6]。但是BVP 對LPS 誘導的HGFs 炎癥損傷的影響尚不清楚。因此,本研究建立LPS 誘導的HGFs 細胞損傷模型,觀察BVP對LPS 誘導的HGFs 細胞的影響,為尋找治療牙周炎的新藥提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

HGFs 購自中科院上海細胞庫,Pg-LPS (貨號: ATCC33277) 購自美國R&D Systems 公司;BVP (規格: 20 mg) 購自中國藥品生物制品檢定所;RPMI 1640 培養基(貨號: 11875101)、胎牛血清(貨號: 26140-079) 購自美國Gibco 公司;二辛可寧酸(bicinchoninicacid,BCA) 蛋白檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI 試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司;超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD) 活性檢測試劑盒 (貨號:HZB002) 購自上海滬崢生物科技有限公司;活性氧(reactive oxygen species,ROS) 檢測試劑盒-DCFHDA (貨號: HR8687) 購自北京百奧萊博科技有限公司;TNF-α (貨號: E-EL-H0109c)、IL-1β (貨號: E-EL-H0149c)、IL-6 (貨 號: E-ELH0192c)、酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、比色法測試盒 (TBA 法)(貨號: E-BC-K025-M) 購自Elabscience 公司;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) 標記的兔抗二抗(批號: E030120)、鼠抗二抗(批號:E030110) 購自美國EarthOx 公司;兔抗人細胞周期素Cyclin B1 (Y106,貨號: ab215436)、Cyclin D1 (SP4,貨號: ab134175)、BCL-2 相關X 蛋白(BCL-2-associated X protein,Bax) (E63,貨號:ab263897)、B 淋巴細胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2,Bcl-2) (EPR17509,貨號: ab218123)、半胱氨酸蛋白酶3 (Caspase-3) (E87,貨號: ab32150) 和鼠抗人β-actin 抗體(AC-15,貨號: ab6276) 購自英國Abcam 公司。Epics Altra 型流式細胞儀購自美國Beckman Coulter 公司,MK3 型全自動酶標儀購自美國Thermo 公司。

1.2 細胞培養及分組

常規復蘇HGFs 細胞后,接種至RPMI 1640 培養基中進行傳代培養,每隔2～3 天換液,待細胞生長至對數期時,將HGFs 細胞分為對照組,LPS組,LPS+BVP 低、中、高劑量 (25、50、100 μmol/L BVP) 組。對照組不做處理,LPS 組使用10 mg/L LPS 處理4 h,LPS+BVP 低、中、高劑量組使用10 mg/L LPS 處理4 h 后,再分別用終濃度為5、50、100 μmol/L 的BVP 處理,置于細胞培養箱中進行培養。

1.3 細胞計數試劑(cell counting kit 8,CCK-8) 法檢測細胞增殖

將處理好的各組HGFs 細胞接種于96 孔板中,培養48 h 后,采用CCK-8 法檢測細胞增殖,計算細胞存活率。

1.4 細胞凋亡檢測

將處理好的各組HGFs 細胞接種于96 孔板中,培養24 h 后,使用70 %乙醇固定,使用Annexin V-FITC/PI 試劑盒檢測細胞凋亡。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移

將各組處理的HGFs 細胞以4×104個/孔接種于6孔板中,待細胞貼壁融合后,使用200 μL 槍頭在培養皿垂直劃線,加入無血清的RPMI 1640 培養基培養48 h,顯微鏡觀察拍照,計算各組細胞遷移率。

1.6 蛋白質印跡法檢測細胞蛋白表達

離心收集各組處理的HGFs 細胞,使用蛋白裂解液裂解細胞,提取各組HGFs 細胞總蛋白,經變性后進行十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS) -聚丙烯酰氨凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE),轉膜封閉后,分別加入兔抗人Cyclin B1 (1∶500 稀釋)、Cyclin D1 (1∶1 500稀釋)、Bax (1∶1 000 稀釋)、Bcl-2 (1∶1 000 稀釋)、Caspase-3 (1∶1 500 稀釋) 和鼠抗人β-actin(1∶1 000) 抗體,4 ℃孵育過夜,再加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) 標記的IgG二抗(1∶2 000 稀釋),室溫孵育1 h,DAB 顯色,以β-actin 為內參,Quantity One 軟件分析條帶灰度,并計算目的蛋白相對表達量。

1.7 ELISA 法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平

各組細胞培養48 h 后取細胞培養上清液,采用ELISA 法測定各組HGFs 細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平。

1.8 SOD、MDA 與活性氧 (reactive oxygen species,ROS) 的檢測

取各組處理的細胞,裂解液裂解細胞后,用試劑盒檢測細胞中SOD 和MDA。各組處理的HGFs細胞接種于黑色96 孔板中,每孔加入10 μmol/L的二氫熒光素二乙酸酯(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate,DCFH-DA) 探針,37 ℃避光孵育30 min,以空白孔做對照,熒光酶標儀檢測各孔A值,計算相對ROS 水平。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 BVP 對LPS 誘導的HGFs 細胞增殖及其相關蛋白表達的影響

與對照組比較,LPS 組細胞的存活率、Cyclin B1、Cyclin D1 蛋白表達水平顯著性降低 (P＜0.05)。

與LPS 組比較,LPS +BVP 低、中、高劑量組細胞存活率、Cyclin B1、Cyclin D1 蛋白表達水平顯著升高,并呈BVP 濃度依賴性(P＜0.05) (圖1、表1)。

表1 BVP 對LPS 誘導的HGFs 細胞增殖及其相關蛋白表達的影響

圖1 各組細胞Cyclin B1、Cyclin D1 蛋白表達情況

2.2 BVP 對LPS 誘導的HGFs 細胞凋亡及其相關蛋白表達的影響

與對照組比較,LPS 組Bcl-2 蛋白表達顯著降低,HGFs 細胞凋亡率、Bax、Caspase-3 蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05);與LPS 組比較,LPS +BVP 低、中、高劑量組Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高,細胞凋亡率、Bax、Caspase-3 蛋白表達水平顯著降低,并呈BVP 濃度依賴性(P＜0.05) (圖2、表2)。

表2 BVP 對LPS 誘導的HGFs 細胞凋亡及其相關蛋白表達的影響

圖2 BVP 對LPS 誘導的HGFs 細胞凋亡及其相關蛋白表達的影響

2.3 BVP 對LPS 誘導的HGFs 細胞遷移的影響

使用劃痕實驗檢測細胞的遷移能力,與對照組比較,LPS 組HGFs 細胞遷移率顯著降低 (P＜0.05);與LPS 組比較,LPS+BVP 低、中、高劑量組細胞遷移率呈BVP 濃度依賴性升高 (P＜0.05) (圖3、表3)。

表3 BVP 對LPS 誘導的HGFs 細胞遷移的影響

圖3 BVP 對LPS 誘導的HGFs 細胞遷移的影響(×100)

2.4 BVP 對LPS 誘導的HGFs 細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表達的影響

ELISA 實驗結果顯示,與對照組比較,LPS 組HGFs 細胞培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6 表達水平顯著升高(P＜0.05)。

與LPS 組比較,LPS +BVP 低、中、高劑量組HGFs 細胞培養液中TNF-α、IL-1β、IL-6 表達水平顯著降低(P＜0.05) (表4)。

表4 BVP 對LPS 誘導的HGFs 細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表達的影響

2.5 BVP 對LPS 誘導的HGFs 細胞SOD、MDA 與ROS的影響

試驗檢測SOD、MDA 和ROS 活性,結果顯示,與對照組比較,LPS 組HGFs 細胞SOD 活性顯著降低,MDA、ROS 水平顯著升高(P＜0.05);與LPS 組比較,LPS +BVP 低、中、高劑量組HGFs 細胞SOD 活性顯著升高,MDA、ROS 水平顯著降低(P＜0.05) (表5)。

表5 BVP 對LPS 誘導的HGFs 細胞SOD、MDA 與ROS 的影響

3 討論

BVP 是燈盞花的主要活性成分,具有抗炎、抗氧化和抗血管生成等作用,在腫瘤與炎癥疾病中具有良好的應用前景[7-8]。據報道,BVP 可通過抑制LPS 所致小鼠巨噬細胞內ROS 升高而保護線粒體功能,發揮細胞保護作用[9]。BVP 可以抑制高糖誘導的人視網膜色素上皮(RPE) 細胞氧化損傷和凋亡的發生[10]。此外,在腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R) 損傷大鼠模型中,BVP 可有效降低I/R 損傷組織中炎性細胞因子表達、氧化應激及促凋亡蛋白表達,抑制核轉錄因子-κB (nuclear transcription factor-κB,NF-κB) 信號通路和小膠質細胞的活化,改善腦I/R 誘導的損傷和大鼠的神經功能[11]。Cyclin B1、Cyclin D1 為細胞周期調節蛋白,Cyclin B1 促進G/M 期轉換,Cyclin D1 可調節G1/S 期轉換,其水平升高可促進細胞增殖。Bax 與Bcl-2 為促凋亡與抗凋亡蛋白,Bax 表達水平升高促進細胞凋亡,而Bcl-2 則發揮抗凋亡作用,Caspase-3 可降解細胞內的功能蛋白和結構蛋白,促進細胞死亡。本研究結果顯示,LPS 誘導的HGFs 細胞凋亡率、Bax、Caspase-3 蛋白表達水平顯著升高,細胞存活率、遷移率、Cyclin B1、Cyclin D1、Bcl-2 蛋白表達水平顯著降低,而使用不同濃度的BVP 處理LPS 誘導的細胞后,HGFs 細胞凋亡率、Bax、Caspase-3 蛋白表達水平均降低,細胞存活率、遷移率、Cyclin B1、Cyclin D1、Bcl-2 蛋白表達水平均升高,表明BVP 可抑制LPS 誘導的HGFs 凋亡,促進其增殖和遷移,減輕HGFs 細胞損傷。

HGFs 能夠產生多種炎癥相關因子,發揮抗炎作用,而經過LPS 刺激,可放大炎癥反應,過度釋放炎癥因子(TNF-α,IL-1β 等),使牙周炎加重[12]。研究表明,在大鼠顱腦損傷模型中,BVP預處理可減少腦組織炎癥因子TNF-α 和IL-1β 水平,抑制炎癥損傷[13]。本研究發現,經LPS 處理的HGFs 細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6 表達水平均升高,而25、50、100 μmol/L 的BVP 處理細胞后,HGFs 細胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6 表達水平均降低,表明BVP 可抑制LPS 誘導的HGFs細胞炎癥因子的釋放,減輕LPS 所致HGFs 細胞炎癥損傷。SOD 是細胞內的抗氧化酶,其水平高低可反映細胞抗氧化能力,MDA 與ROS 可反映細胞的氧化損傷程度[14-15]。研究顯示,大鼠皮質神經元缺氧/復氧損傷模型中,BVP 可增加SOD 的表達,降低細胞內MDA 水平,抑制神經元細胞內ROS 水平,保護缺氧/復氧誘導的神經元氧化損傷[16]。在本研究中,LPS 處理的HGFs 細胞中SOD活性降低,MDA、ROS 水平升高,而不同濃度的BVP 處理HGFs 細胞后,細胞SOD 活性升高,MDA、ROS 水平降低,表明BVP 可通過抗氧化作用抑制LPS 誘導的HGFs 細胞氧化損傷。

綜上所述,BVP 可通過抗炎、抗氧化作用減輕LPS 誘導的HGFs 細胞損傷,對牙周疾病中的應治療有一定潛在價值,但其具體作用機制仍需進一步研究。