基于整合藥理學和轉錄組學的肝細胞癌和膽管癌共同差異miRNA調控網絡構建及相關中藥預測分析Δ

施金虎,吳 波,藍曉紅,王玥坤,楊 陽,易劍峰,魏 瑋,高 茗#

(1.中國人民解放軍東部戰區總醫院藥劑科,南京 210002; 2.江西中醫藥大學中醫基礎理論分化發展研究中心,南昌 330004)

原發性肝癌的發病率在我國常見惡性腫瘤疾病中居第4位,其病死率在惡性腫瘤中居第2位,嚴重威脅我國人民的生命和健康[1]。原發性肝癌主要分為肝細胞癌(HCC)、肝內膽管癌(ICC)和混合型肝細胞癌-膽管癌(Chcc-CCA)3種不同病理學類型,三者發病機制、病理組織學、治療方法、生物學行為以及預后等方面差異較大,既往研究主要在HCC或膽管癌(CC)方面,而2種疾病的共同基礎分子機制鮮有報道。因此,研究兩者間的聯系,有助于肝膽癌早期篩查、診斷、系統治療及隨訪監測等。隨著高通量測序技術的不斷發展與完善,基于多組學數據研究被用于挖掘調控疾病潛在細胞因子、基因表達異常及信號通路等復雜調控機制。微RNA(miRNA)是一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA分子,廣泛分布于真核生物中,其大小長20～25個核苷酸。近年來,大量研究發現miRNA及其靶基因的表達失調,影響多種腫瘤細胞增殖、侵襲及凋亡,已成為當今研究的熱點。隨著轉錄組學的高速發展,使得研究人員對特定癌種中表達失衡miRNA及其調控靶點挖掘變為可能。本研究通過挖掘HCC和CC中共同差異表達miRNAs(DEMs),預測其上游調控基因和下游調控靶點,借助Cytoscape 3.9.1軟件篩選關鍵靶點,構建miRNA-關鍵靶點調控網絡,并對關鍵靶基因進行驗證和中藥預測分析,以期為肝膽癌的診斷和治療提供新的線索或依據。

1 資料與方法

1.1 轉錄組數據獲取

本研究所需芯片數據集源于GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),該數據庫儲存了大量轉錄組基因表達數據集和測序序列。在GEO DataSets搜索欄添加“hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma and miRNA or microRNA”進行檢索,獲得與研究內容相關的芯片數據集。

1.2 DEMs、上游轉錄挖掘因子及下游靶基因挖掘

HCC和CC基因表達原始數據均來自GSE209875數據集,該數據來自日本東麗工業株式會社,包含了10對HCC患者(6對CC患者)腫瘤組織和癌旁組織(基因芯片平臺:GPL21185和GPL21263)。利用在線分析工具GEO2R對數據集進行分組,以閾值為|log2FC|>1和P<0.05[2]篩選DEMs,通過FunRich數據庫(http://www.funrich.org/)預測上游轉錄因子[3],通過miRNet數據庫(https://www.mirnet.ca/)預測下游靶基因。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡、miRNA調控網絡構建及關鍵基因篩選

將“1.2”中預測的下游靶基因上傳至STRING數據庫(https://cn.string-db.org/),閾值“minimum required interaction score=0.4”“hide protein names”,獲得PPI網絡。隨后,用Cytoscape 3.9.1軟件行可視化處理,并用“cytohubba”插件行MCC算法分析,得到該網絡關鍵靶基因,按打分值排序,選取前30位靶基因與DEMs構建miRNA調控網絡。

1.4 下游靶基因功能富集分析

將“1.2”中預測下游靶基因上傳至DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/),獲得靶基因參與生物過程(BP)、細胞組成(CC)和分子功能(MF)及KEGG通路。

1.5 關鍵基因在癌組織和非癌組織中的表達差異及對整體生存率的影響

UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/)是綜合交互式的網絡數據庫,可用于識別生物標志物或潛在基因,便于研究人員收集有價值基因信息和數據。將關鍵基因上傳至UALCAN數據庫,選擇“TCGA”功能模塊,獲取靶基因在正常人與HCC(或CC)患者中的表達差異,P<0.05為差異有統計學意義[4]。Kaplan Meier-plotter軟件(https://kmplot.com/analysis/)能夠評估所有基因表達與21種腫瘤類型的樣本存活率之間的相關性,該軟件用于惡性腫瘤相關生物標志物研究。將關鍵基因上傳至該軟件,選擇“liver cancer”進行分析,獲得靶基因整體生存率。

1.6 關鍵靶點相關中藥預測

與靶點相關的中藥預測用到的數據庫為Coremine Medical(https://www.coremine.com/),該數據由多國科研機構共同研制,吸納中西醫相關領域的醫學信息檢索平臺,支持在線檢索與靶點相關的信息,如中藥、疾病、藥物、食物、基因、蛋白、化合物及細胞成分等。將關鍵基因映射到Coremine Medical數據庫中獲取相關中藥,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗樣本信息

基于GSE209875基因片段原始數據,對其進行分組:HCC組包括10個惡性腫瘤組織和10癌旁組織,年齡為62～75歲,平均68歲,樣本的miRNA來源于total RNA;CC組包括6個惡性腫瘤組織和6個癌旁組織,年齡為63～76歲,平均71歲,樣本的miRNA來源于total RNA。

2.2 DEMs、上游調控因子及下游調控靶點的預測

通過在線分析工具GEO2R對兩組進行差異分析,分別得到14個DEMs(HCC組)和104個DEMs(CC組),其中miR-199a-5p為兩組共同DEMs,見圖1(A)—圖1(B)。利用FunRich軟件對miR-199a-5p進行轉錄因子預測,得到28個轉錄因子,差異最大的前6個分別為EGR1、ELF1、MEF2A、POU2F1、SP1和RXRA,見圖1(C);通過miRNet數據庫預測出166個下游靶基因,見圖1(D)。

A.HCC組與CC組DEMs交集;B.CC組和HCC組miR-199a-5p熱圖;C.miR-199a-5p上游轉錄因子;D.miR-199a-5p下游調控靶點。

2.3 miRNA-hubGenes調控網絡構建

將166個下游靶基因映射到STRING數據庫中,構建PPI網絡,該網絡中有166個節點,449條邊,平均度值為5.41,PPI enrichment(P<1×10-16),見圖2(A)。利用Cytoscape 3.9.1軟件中“cytohubba”插件分析該網絡關鍵靶點,選取分值排序前30位進行可視化處理,見圖2(B)、表1。將關鍵基因映射至下游靶基因網絡,見圖2(C)。

表1 MCC算法關鍵基因打分排序(前10位)

2.4 差異miRNA的KEGG通路富集分析與GO功能富集分析

BP富集到270個條目,68個有效條目,主要涉及基因表達的正向調控、凋亡過程的負調控、細胞增殖的正向調節、蛋白質磷酸化、對缺氧的反應、上皮細胞向間質細胞轉變和細胞遷移的正向調節等;CC富集到41個條目,11個有效條目,主要涉及基底外側質膜、細胞質、轉錄因子復合物、細胞表面和核內膜等;MF富集到49個條目,28個有效條目,主要涉及蛋白激酶結合、酶結合、生長因子結合、蛋白激酶活性、受體結合、細胞因子活性和膠原蛋白綁定等,見圖3(A)。KEGG通路主要富集到癌癥通路、胃癌、胰腺癌、FoxO信號通路、HCC、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號通路以及磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路等,見圖3(B)。

A.PPI網絡;B.MCC算法分析關鍵基因間相關性;C.miRNA與關鍵基因調控網絡,綠色倒三角示下調miR-199a-5p,紅色菱形示打分值排序居前10位的上調關鍵基因,紅色圓形為打分較低關鍵基因。

A.下游靶基因主要參與生物過程、組成成分及分子功能;B.下游靶基因富集到的主要信號通路。

2.5 關鍵基因在惡性腫瘤組織及正常組織中的表達差異

本課題組研究了TCGA數據集中關鍵基因在正常人與惡性腫瘤患者中的表達水平,發現HCC及CC的VEGFA、CDH1、CD44、SMAD4、SMAD3、CDH2、SOX9、JAG1和KRAS等9個關鍵基因mRNA表達與正常人比較有顯著性差異,見圖4(A)—圖4(T)。進一步比較其差異的變化趨勢,發現VEGFA、CD44、SMAD4、SMAD3、SOX9、JAG1和KRAS等7個關鍵基因在HCC和CC中的表達較正常組織顯著升高,與上述預測結果一致。CDH1基因在HCC中表達較正常組織顯著升高,在CC中表達較正常組織顯著降低,說明該基因在不同癌種間發揮著不同生物學作用。

2.6 Kaplan Meier-plotter生存曲線分析

通過對關鍵基因(排序居前10位)進行HCC患者整體生存率的分析,發現VEGFA、CDH1、SOX9和JAG1的異常表達與HCC患者整體生存率有關,見圖5。

A—J.不同表達的關鍵基因對肝癌患者整體生存率的影響(logrank P<0.05為差異有統計學意義)。

A.預測中藥性味分類;B.預測中藥歸經。

2.7 相關中藥預測結果

將關鍵基因(排序居前10位)映射至Coremine Medical數據庫,篩選治療HCC或CC的潛在中藥,共篩選出中藥25味(P<0.05),結果見表2。對預測的中藥進行性味、歸經分析,多數中藥以微寒為主,主要歸于肝經、脾經,見圖6。

表2 與關鍵基因作用的潛在中藥

3 討論

目前,甲胎蛋白被廣泛作為HCC診斷的生物標志物,但由于HCC發生、發展的生物學過程十分復雜,且易受外界因素的影響(如病毒性肝炎、乙醇),因而,尋找新的HCC預后相關分子標志物對HCC的診斷、治療及預后意義重大[5]。CC是常見的肝臟惡性腫瘤,具有惡性程度高、擴散轉移時間短、治療效果差和生存期短等特點。上述2種疾病雖病理機制不同,但仍有交集,若能探明其內在聯系,有利于疾病診療。隨著生物數據量劇增和生物信息學快速發展,與腫瘤相關的二級數據庫逐漸趨于完善,研究人員可對特定癌種中表達異?；蜻M行系統研究[6-8]。

本研究從GEO數據庫中獲取HCC和CC芯片數據集,利用在線分析工具GEO2R對兩組數據集進行差異表達分析,HCC數據集共篩選出14個miRNA,CC數據集共篩選出104個miRNA,兩者共同DEMs為miR-199a-5p。為進一步深入研究其調控機制,進而預測分析共同DEMs的上游轉錄基因,得到EGR1、ELF1、MEF2A、POU2F1、SP1和RXRA等6個上游轉錄基因;下游靶標預測出166個靶基因。隨后進行生物學過程和通路富集,靶基因主要參與增加基因表達調節、抑制凋亡過程、促進細胞增殖、上皮細胞向間質細胞轉變和促進細胞遷移等生物過程;主要涉及癌癥通路、FoxO信號通路、MAPK信號通路以及PI3K-Akt信號通路;富集到主要疾病包括胃癌、胰腺癌和HCC。PPI網絡篩選出VEGFA、CDH1、CD44和SMAD4等10個關鍵基因。VEGFA是血小板衍生生長因子/血管內皮生長因子家族的成員,可介導并增加血管通透性,誘導血管生成,血管發生和內皮細胞生長,促進細胞遷移和抑制細胞凋亡[9-11]。CDH1為鈣依賴性細胞黏附蛋白,屬于鈣黏蛋白家族成員,CDH1基因參與細胞黏附、遷移和上皮細胞增殖,與腫瘤發生、發展密切相關[12]。CD44基因編碼細胞表面糖蛋白,參與細胞間相互作用、細胞黏附和遷移,現已證實該蛋白質在腫瘤細胞侵襲、轉移中起促進作用。SMAD4屬于Smad家族成員,可充當腫瘤抑制因子并抑制上皮細胞增殖,還可通過減少血管生成和增加血管通透性而對腫瘤產生抑制[13]。SNAI1是蛋白質編碼基因,主要參與上皮間質轉化的誘導以及胚胎中胚層的形成和維持、生長停滯、存活和細胞遷移[14]。研究結果顯示,上述基因可能參與HCC/CC相關的腫瘤發生、發展不同階段,有相應文獻為支撐。因而,本預測具有一定的參考意義。

為驗證研究結果的可行性,本課題組比較了核心基因在正常人與HCC(或CC)患者中的表達差異及影響肝癌預后分析。發現VEGFA、CD44、SMAD4、SMAD3、SOX9、JAG1和KRAS等7個關鍵基因在HCC和CC中的表達較正常組織顯著升高,與上述預測結果一致。且VEGFA、CDH1、SOX9和JAG1的異常表達與肝癌患者整體生存率顯著相關。本研究發現,miR-199a-5p表達相比癌旁組織顯著下調,而miR-199a-5p的低表達可以通過增加VEGFA、CDH1、SOX9和JAG1等基因表達來促進肝膽腫瘤細胞增殖、侵襲能力,后續可進行相關實驗驗證。此外,本課題組通過COREMINE數據庫對干預關鍵靶點進行相關中藥預測,結果提示丹參、當歸和人參出現頻次較多,藥物歸經以肝、脾兩經為主,且多為微寒類。中醫學無“HCC”病名,臨床表現多以肋間痛、腹水、黃疸及腹內包塊,中醫學將其歸屬于“肝積”“脾積”和“癖黃”等范疇[15-16]。中醫學中,CC可歸于“肋痛”“黃疸”范疇,與氣血凝結、七情內傷、腑臟虧損和飲食勞傷等密切相關[17],可見2種疾病間交集存在。文獻報道,丹參可抑制肝癌細胞生長、誘導惡性腫瘤細胞分化,減輕患者癥狀,縮小癌腫,增強抗腫瘤藥物療效,并降低門靜脈高壓等[18-21]。張誼等[22]研究發現,丹參酮ⅡA能夠劑量依賴性地抑制肝癌細胞HepG2增殖,誘導細胞凋亡、ATP生成減少、耗氧量降低以及線粒體膜電位的下降。羅藝[23]發現,丹參中的隱丹參酮通過調控PI3K-AKT-雷帕霉素靶蛋白信號通路誘導肝癌細胞凋亡和自噬,體內實驗表明隱丹參酮能夠抑制肝癌細胞Huh7裸鼠皮下移植瘤的生長。

本研究的局限之處在于數據來源依賴于GEO數據庫中記載的芯片數據集,然而單一來源芯片數量過少,可能對研究結果造成偏倚。因而,本課題組采用多個數據庫結合文獻報道驗證結果的準確性,為后續實驗研究進行鋪墊?？傊?本研究構建了miRNA與關鍵基因調控網絡,分析關鍵基因在2種惡性腫瘤中的差異表達及預后不利因素,上述結果有望為肝膽癌發病機制和臨床治療提供新的線索。