消栓再造丸中輔料煉蜜的質量考察

陸鈁，丁晴

作者單位：無錫市藥品安全檢驗檢測中心，江蘇 無錫 214028

消栓再造丸（大蜜丸）是由血竭、赤芍、沒藥（醋炙）、當歸、牛膝等39 味中藥材制成的大處方成藥，具有活血通絡、息風開竅，補養氣血的功效。煉蜜是由蜂蜜經高溫煉制而成，在蜜丸中占比較大，占總量的20%～50%，是蜜丸中重要的輔料［1-3］，在我國中成藥生產中使用廣泛。近年來，蜂蜜的摻偽、造假現象普遍，主要為摻入蔗糖或者使用人工轉化糖漿等替代蜂蜜［4-7］。據報道，人工轉化糖漿在轉化過程中可產生5-羥甲基糠醛［8-9］。另外，由于蜂蜜制成的煉蜜在工藝上不統一、不規范，會導致煉蜜中有害成分增加，間接影響中藥質量，特別是蜂蜜在煉制的過程中，果糖等單糖在高溫下會產生5-羥甲基糠醛［10-11］。5-羥甲基糠醛與人體蛋白質結合，對人體橫紋肌及內臟有損害，具有神經毒性等危害［12-13］。中國藥典對蜂蜜中5-羥甲基糠醛和果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的含量均制定了限度［14］。也有相關文獻報道了蜜丸中5-羥甲基糠醛和糖類成分的限量檢查［7，15-18］。

消栓再造丸為2020年國家評價性抽驗品種，本次抽檢共收集到34 批樣品。其現行質量標準較為簡單，未涉及對輔料煉蜜的質量考察。因此，2020年5月至2021年12月，本研究擬采用高效液相色譜法（HPLC）建立消栓再造丸中5-羥甲基糠醛的含量測定方法，采用HPLC-蒸發光散射檢測器（ELSD）法建立消栓再造丸中果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的含量測定方法，分類別對消栓再造丸中煉蜜的質量情況進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料LC-20AT 高效液相色譜儀（島津公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫公司）；電子天平METTLER XSE205（梅特勒公司，精度：十萬分之一）；電子天平METTLER XP-19（梅特勒公司，精度：百萬分之一）；Milli-Q純水儀。

5-羥甲基糠醛對照品（批號111626-201912，純度99.2%），果糖對照品（批號100231～201807，純度99.6%），D-無水葡萄糖（批號110833～201908，純度99.8%），蔗糖（批號111507～201704，純度100.0%），麥芽糖（批號100287～201905，純度94.4%），均來自中國食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈為色譜純；三乙胺為分析純；水為純化水。

1.2 方法

1.2.1 5-羥甲基糠醛測定方法采用LC-20AT 高效液相色譜儀（紫外檢測器），色譜柱Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-水（10∶90）為流動相；檢測波長為284 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min。

色譜條件考察：考察了不同色譜柱Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phecda C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），結果表明，除保留時間稍有差異外，結果無差異，均能滿足分離要求。

對照品溶液制備：取5-羥甲基糠醛對照品適量，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，制成每毫升含291.53 μg 的溶液，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液，分別用水稀釋成0.364 4 mg/L、1.457 6 mg/L、3.644 1 mg/L、7.288 2 mg/L、14.576 4 mg/L、29.152 9 mg/L 的溶液，作為系列標準溶液。

供試品溶液制備：取本品水蜜丸研碎，取1 g，精密稱定，加水約40 mL，超聲處理30 min，放冷，用水定容至50 mL，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

1.2.2 糖類成分含量測定方法采用Agilent 1260高效液相色譜儀（ELSD），色譜柱Waters XBridge Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；流動相為乙腈-0.2%三乙胺溶液（79∶21）；柱溫為35 ℃；流速為0.8 mL/min。ELSD 條件：漂移管溫度80 ℃，氣體流速2 L/min。

混合對照品溶液的制備：取果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖對照品適量，精密稱定，加40%乙腈制成每毫升分別含果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖0.2 mg 的溶液，作為對照品溶液。

供試品溶液的制備：取本品水蜜丸，研碎，取1 g，精密稱定，置50 mL離心管中，精密加入40%乙腈20 mL，稱定質量，渦旋1 min，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用40%乙腈補足減失的質量，搖勻，12 cm 離心半徑4 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2 結果

2.1 5-羥甲基糠醛含量測定結果

2.1.1 線性關系考察精密取5-羥甲基糠醛標準對照品系列溶液，按照“1.2.1”色譜條件進樣，以對照品濃度X為橫坐標，對應濃度的峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，求得線性回歸方程為Y=78 928.77X-2 776.70，R=1，表明5-羥甲基糠醛在0.364 4～29.152 9 mg/L范圍內線性關系良好。

2.1.2 精密度試驗精密吸取5-羥甲基糠醛標準對照品溶液（S=7.288 2 mg/L），連續進樣6 次，測定峰面積，并計算相對標準差（RSD）值為0.04%（n=6），表明精密度良好。

2.1.3 重復性試驗取同一批次樣品（批號17014041），按“1.2.1”方法平行制備6 份供試品溶液，按照“1.2.1”色譜條件進樣。計算5-羥甲基糠醛的含量，并計算RSD值為1.05%（n=6）。表明方法重復性良好。

2.1.4 穩定性試驗取同一供試品溶液（批號17014041），分別于0、2、4、8、12、24 h 依次進樣，測定峰面積，結果5-羥甲基糠醛峰面積的RSD 值為0.46% （n=6）。表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.5 回收率試驗取同一批次樣品（批號17014041）1 g，精密稱定，精密加入5-羥甲基糠醛對照品儲備液（S=291.53 mg/L）0.75 mL，按照供試品溶液制備方法，平行制備6 份樣品，計算回收率（見表1）。5-羥甲基糠醛的平均回收率為98.31%，RSD 值為1.40%，表明方法準確度符合要求。

表1 5-羥甲基糠醛回收率試驗結果（n=6）

2.1.6 檢出限和定量限逐級稀釋5-羥甲基糠醛對照品溶液，以信噪比10∶1 和3∶1 時5-羥甲基糠醛的濃度測得定量限為0.018 22 mg/L，檢出限為0.005 466 mg/L。

2.1.7 樣品測定根據建立的測定方法和色譜條件對收集到的34 批消栓再造丸樣品進行測定。5-羥甲基糠醛測定結果見表2，色譜圖見圖1。

圖1 消栓再造丸樣品色譜圖（5-羥甲基糠醛保留時間：10.321 min）

表2 消栓再造丸34批樣品中5-羥甲基糠醛的含量測定結果

2.2 糖類成分含量測定結果

2.2.1 糖類成分的回歸方程及線性范圍精密吸取糖類成分混合對照品溶液1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、30 μL，注入液相色譜儀，按照“1.2.2”色譜條件進樣，分別測定峰面積積分值。以對照品進樣量的自然對數為橫坐標，峰面積積分值的自然對數為縱坐標，進行線性回歸，得到回歸線方程。見表3。表明線性關系良好。

表3 消栓再造丸糖類成分的回歸方程及線性范圍

2.2.2 儀器精密度試驗精密吸取糖類成分混合對照品溶液10 μL，連續進樣6 次，測定各成分的峰面積，并計算其對數RSD 值，結果果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的RSD 值（n=6）分別為0.12%、0.06%、0.09%、0.11%。表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復性試驗糖類成分重復性考察見回收率試驗，結果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖回收率RSD 值分別為1.79%、1.16%、1.72%、1.17%（n=6）。表明方法重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗取同一供試品溶液（批號17014041），分別于0、2、4、8、12、24 h 依次進樣，測定峰面積，結果果糖、葡萄糖、蔗糖峰面積的RSD 值為1.36%、1.14%、1.33%（n=6）。表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.5 回收率試驗取同一批次樣品（批號17014041）0.5 g，精密稱定，分別精密加入果糖100 mg、葡萄糖100 mg，蔗糖10 mg、麥芽糖80 mg，按照“1.2.2”供試品制備方法，平行制備6 份加樣供試品溶液，按照“1.2.2”色譜條件進樣，依法測定，計算回收率（見表4），結果果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖平均回收率分別為102.77%、97.38%、96.71%、98.36%，表明方法準確度符合要求。

表4 消栓再造丸中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖回收率試驗結果（n=6）

2.2.6 檢出限和定量限取糖類成分混合對照品溶液進行逐級稀釋，以信噪比3∶1時測定檢出限，以信噪比10∶1 時測定定量限，結果蔗糖檢出限為0.007 928 μg，定量限為0.015 86 μg，麥芽糖檢出限為0.016 03 μg，定量限為0.032 07 μg。

2.2.7 樣品測定果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖測定結果見表5，HPLC色譜圖詳見圖2，3。

圖2 消栓再造丸混合對照品溶液色譜圖

圖3 消栓再造丸供試品溶液色譜圖

表5 消栓再造丸樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量測定結果

3 討論

3.1 5-羥甲基糠醛限度的擬定《中國藥典》2015年版一部蜂蜜項下規定，5-羥甲基糠醛含量不得過0.004%。據文獻報道，在煉蜜過程中隨著加熱溫度和時間的增加，5-羥甲基糠醛含量逐步增加。蜂蜜經高溫煉制后，5-羥甲基糠醛含量增加10～50 倍，按100 倍折算。制劑按處方中最多加蜜量對制劑中5-羥甲基糠醛含量限度進行折算，擬定消栓再造丸中5-羥甲基糠醛的限度為1.0 mg/g。

3.2 果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖限度的擬定《中國藥典》2015 年版蜂蜜的標準規定，果糖與葡萄糖之和不得少于60.0%，果糖與葡萄糖含量比值不得少于1.0。因此煉蜜中果糖與葡萄糖含量之和按60%折算，制劑按處方中最少加蜜量，擬定消栓再造丸中果糖和葡萄糖含量應不得少于340 mg/g。

《中國藥典》2015 年版蜂蜜的標準規定，蔗糖含量不得過5%，食品安全國家標準GB14963-2011 中規定桉樹蜂蜜、柑橘蜂蜜、紫苜蓿蜂蜜、荔枝蜂蜜、野桂花蜜的蔗糖不得過10%，因此煉蜜中蔗糖含量按10%折算，按消栓再造丸處方比例，制劑按最多加蜜量，擬定消栓再造丸中蔗糖含量不得多于60 mg/g。

《中國藥典》2015 年版規定蜂蜜中麥芽糖含量不得過5%，煉蜜中麥芽糖含量按5%折算，按消栓再造丸處方比例，制劑按最多加蜜量，擬定消栓再造丸中麥芽糖含量不得多于30 mg/g。

由于果糖、葡萄糖為蜂蜜中必須含有的成分，故規定限度時按蜂蜜最少加入量和含量最低值折算制劑中的量設定限度。而蔗糖和麥芽糖為蜂蜜中不含或少量含有的成分，故規定限度時按蜂蜜的最多加入量、最大限度值來設定限度。

3.3 結論本研究共收集到一個廠家不同批次共計34 批樣品。5-羥甲基糠醛含量測定結果表明，34批樣品中5-羥甲基糠醛含量在0.124～0.476 mg/g。結果均低于擬定限度值（1.0 mg/g）。且各批次間差異不大，表明質量控制較穩定。糖類成分含量測定結果表明，34 批樣品果糖和葡萄糖含量范圍381.55～428.61 mg/g，含量均大于限度值（340 mg/g），果葡比均大于1.0。蔗糖含量范圍23.23～30.24 mg/g，含量均低于限度值（60 mg/g）。麥芽糖均未檢出。糖類成分各項指標均符合規定。表明本次抽驗的34批樣品中輔料煉蜜質量符合要求。

本研究建立了消栓再造丸中5-羥甲基糠醛和果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量測定分析方法，操作簡便快捷，結果準確可靠，為消栓再造丸輔料煉蜜的質量評價提供了科學依據。