七氟烷對β淀粉樣蛋白1-40誘導的大鼠認知功能障礙影響及機制

鄒敏，孫應中，魏艷妮，官煥春

作者單位：重慶市開州區人民醫院麻醉科，重慶 405400

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種中樞神經系統變性疾病，主要表現為漸行性記憶減退、認知功能減退等，其主要病理特征是神經細胞外β 淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）沉積［1］。海馬區作為學習和記憶的關鍵腦區，在AD 早期階段極易受到損害［2］。七氟烷是目前臨床上普遍使用的吸入式揮發性麻醉劑［3］，研究表明，七氟烷吸入可增加Aβ的寡聚肽沉積產生神經毒性［4］，通過上調腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 和白細胞介素（interleukin，IL）-1β 等炎癥細胞因子的表達誘導神經元凋亡，以及隨后的認知障礙。動物實驗結果表明，七氟烷對老年大鼠認知能力有顯著的損傷［5］。因此，對于術前患有AD 或具有AD 傾向的病人應用七氟烷后，是否進一步加重其認知功能障礙仍有待探討。2021 年8 月至2022 年8 月，本研究擬評價七氟烷吸入對Aβ 誘導的AD 模型大鼠認知功能障礙及海馬組織神經炎癥和神經元凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物無特定病原體級12 周齡雄性Sprague-Dawley 大鼠32 只，體質量230～280 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，使用許可證號：SYXK（京）2021-0010，飼養于重慶市開州人民醫院實驗動物中心。大鼠置于自然光照條件下，室內溫度約25 ℃，相對濕度約50%；給予大鼠自由飲食，適應1周后進行實驗。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 主要試劑材料寡聚Aβ1-40溶液（Sigma，美國）；兔源單克隆膠質纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、兔源單克隆離子鈣接頭蛋白分子1（IBA1）抗體、兔源單克隆B 淋巴細胞瘤-xL（Bcl-xL）抗體、兔源多克隆胱天蛋白酶-9（caspase-9）抗體、兔源單克隆腦源性神經營養因子（BDNF）抗體和兔源單克隆晚期糖基化終末產物受體（RAGE）（Santa Cruz，美國）；兔源多克隆β 肌動蛋白（β-actin）抗體（BioVision，美國）；Aβ1-40酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（碧云天，上海）；七氟烷（恒瑞醫藥有限公司，上海）。

1.3 動物模型的建立和分組

1.3.1 雙側海馬內注射Aβ1-40構建AD 模型配置濃度為5 g/L 的Aβ1-40溶液，37 ℃培養箱內孵育1 周后4 ℃儲存備用。腹腔注射10%水合氯醛（250 mg/kg）麻醉，將大鼠固定于腦立體定位儀上，注射部位選擇在海馬CA1 區（前囟后3.0 mm，中線外側2.2 mm，顱骨表面下3.5 mm）。2 個不銹鋼注射器通過引導套管插入尖端下方0.5 mm 處，在5 min 內將2 μL 的0.6%生理鹽水（NS）或Aβ1-40溶液輕輕地緩慢注入CA1 區兩側。留針10 min，使注射溶液充分浸潤。

1.3.2 實驗分組采用隨機數字表法，將32只大鼠分為四組：NS+氧氣組、NS+七氟烷組、Aβ+氧氣組和Aβ+七氟烷組，每組8只。

1.3.3 七氟烷吸入注射NS 或Aβ1-4014 d 后，各組大鼠分別暴露于2.5%七氟烷或30%氧氣中4 h。七氟烷的吸入方法描述如下：大鼠在自制的麻醉室（50 cm×30 cm×30 cm）吸入七氟烷。麻醉室保持在37 ℃溫水浴中，內部有2個通氣孔：上層通氣孔與麻醉泵相連，下層通氣孔與氣體監測器相連。首先在麻醉室中用5%的七氟烷對NS+七氟烷組和Aβ+七氟烷組的大鼠進行麻醉，2 min 后大鼠昏迷，用2.5%七氟烷和30%氧氣持續吸入4 h（流速1.5 L/min）。NS+氧氣組和Aβ+氧氣組大鼠在麻醉室中僅給予30%氧氣吸入4 h。

1.4 觀察吸入七氟烷大鼠的生命體征NS+七氟烷組和Aβ+七氟烷組大鼠吸入5%七氟烷輕度麻醉后，將血氣分析儀動脈導管插入大鼠頸動脈，另一端連接壓力傳感器。監測大鼠持續吸入2.5%七氟烷4 h 的血液動力學參數：平均動脈壓（MAP）、心率、pH、動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）、動脈血氧分壓（PaO2）和碳酸氫根（HCO3-）。

1.5 Morris 水迷宮實驗（MWM）水迷宮的主要組成部分是一個圓形水池（直徑160 cm，高50 cm），并根據池壁上的4 個等距點分為4 個相等的象限（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）。平臺放置在第Ⅳ象限中心的水面下2 cm 處，其直徑為15 cm。游泳試驗的方法如下：將大鼠放在4 個不同象限的水池中，面對池壁，允許大鼠自由游動，直到找到隱藏在水底的平臺。用Any-Maze 視頻追蹤系統記錄大鼠的游泳速度和逃逸潛伏期（大鼠從進入水中到爬上平臺的時間）。若大鼠在90 s 內沒有找到平臺，它們將被引導到平臺上休息30 s，逃逸潛伏期被記錄為90 s。定位航行試驗后1 d，四組大鼠接受雙側海馬內注射NS 或Aβ，14 d 后，在2.5%七氟醚或30%氧氣中暴露4 h。暴露后7 d，所有大鼠接受第2 次MWM。移除平臺，對所有大鼠進行空間探測測試，并記錄探索原始平臺的時間。然后，平臺被移到原來象限的另一側（第Ⅱ象限）。所有大鼠在新平臺上接受了4 次測試。測試前，將大鼠放在新平臺上30 s，然后按照上述方法進行測試，并記錄游泳速度和逃逸潛伏期。取4次結果的平均值作為每只大鼠的實驗結果。

1.6 ELISA 測定大鼠海馬區Aβ1-40脫頸處死大鼠后，收集海馬組織樣本，立即放入冰NS（25 mL/g）中。用勻漿器在4 ℃下研磨海馬組織。4 ℃離心（2 500 r/min，半徑10 cm，15 min）獲取上清液，轉移至干凈的小型離心管中。根據試劑盒說明書，用ELISA 法測量組織上清液中Aβ1-40表達水平，采用酶標儀在450 nm處讀取吸光度。

1.7 蛋白質印跡法采集海馬區標本并置于冰磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中，4 ℃下加入蛋白裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑，用勻漿器研磨海馬組織。裂解1 h，4 ℃、12 000 r/min（半徑10 cm）離心20 min。蛋白-銅螯合化學試劑法檢測樣本蛋白含量，煮沸變性。應用聚丙烯酰胺凝膠電泳對40 μg 總蛋白進行電泳。濕轉將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，8%脫脂牛奶封閉非特異性蛋白1 h，分別置于抗IBA1抗體（1∶500）、抗GFAP 抗體（1∶500）、抗Bcl-xL 抗體（1∶1 000）、抗caspase-9 抗體（1∶2 000）、抗RAGE 抗體（1∶1 000）和抗BDNF 抗體（1∶1 000）中4 ℃過夜，辣根過氧化物酶結合的二抗室溫孵育1 h。采用增強化學發光法顯示蛋白條帶，Image-Pro Plus 6.0 軟件進行灰度分析。

1.8 免疫組織化學染色海馬組織取出后用10%多聚甲醛固定24 h，常規脫水、石蠟包埋、切片（5 μm）。將切片與GFAP（1∶1 000）或IBA1（1∶500）抗體在4 ℃下孵育至少18 h。辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔免疫球蛋白G 抗體（1∶500）作為二抗在室溫下孵育1 h，PBS 清洗，封片。光鏡下拍照記錄，放大倍數為400倍。

1.9 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）用組織勻漿器在Qiagen 裂解緩沖液中提取組織中的總RNA，并按照說明書用Qiagen RNeasy 小柱進行RNA 純化。使用NanoDrop ND-1000 分光光度計對RNA 進行定量，并根據說明書，用NuGEN's Ovation 系統進行擴增和生物素標記。將50 ng 的RNA 加入SYBR qPCR 混合液中進行qRT-PCR。分組樣品中的目標基因表達以β-actin 進行標準化。引物序列設計如下，IL-1β 正向：5′-GCTGTGGCAGCTACCTATGTCTTG-3′，反向：5′-AGGTCGTCATCATCCCACGAG-3′；核因子-κB（NF-κB）正向：5′-ACTGCCGGGATGGCTTCTAT-3′，反向：5′-CTGGATGCGCTGGCTAATGG-3′；誘導型一氧化氮合酶（iNOS）正向：5′-TCCACCTCCTTCCCTGAACTGG-3′，反向：5′-TGATGACGGTGATGAAGAATAT-3′；β-actin正向：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，反向：5′-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。每個樣本重復檢測3 次，2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.10 統計學方法采用SPSS 26.0 統計學軟件對數據進行分析。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 七氟烷吸入對大鼠生命體征的影響動脈監測結果顯示，維持吸入2.5%七氟烷在NS+七氟烷組和Aβ+七氟烷組大鼠4 個不同時間點（1、2、3、4 h）的MAP、心率、pH、PaCO2、PaO2和HCO3-的測量值比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表1。

表1 七氟烷吸入對大鼠生命體征的影響/

表1 七氟烷吸入對大鼠生命體征的影響/

注：MAP為平均動脈壓，PaCO2為動脈血二氧化碳分壓，PaO2為動脈血氧分壓，HCO3-為碳酸氫根，NS為生理鹽水，Aβ為β淀粉樣蛋白。

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2.2 七氟烷對大鼠認知能力以及海馬區Aβ1-40水平的影響MWM 結果顯示，與NS+氧氣組比較，Aβ+氧氣組大鼠原始平臺探索時間減少，逃逸潛伏期延長，Aβ1-40蛋白表達增多，差異有統計學意義（P＜0.05）。與Aβ+氧氣組相比，Aβ+七氟烷組大鼠原始平臺探索時間減少，逃逸潛伏期和Aβ1-40蛋白表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。NS+氧氣組和NS+七氟烷組大鼠之間原始平臺探索時間、逃逸潛伏期和Aβ1-40蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠認知功能、海馬區Aβ1-40表達比較/

表2 各組大鼠認知功能、海馬區Aβ1-40表達比較/

注：Aβ為β淀粉樣蛋白，NS為生理鹽水。①與NS+氧氣組相比，P＜0.05。②與Aβ+氧氣組相比，P＜0.05。

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2.3 七氟烷對大鼠海馬區GFAP 和IBA1 表達的影響各組大鼠海馬組織表達GFAP 和IBA1 蛋白的星形膠質細胞和小膠質細胞分布在CA1 區各層。與NS+氧氣組比較，Aβ+氧氣組大鼠海馬區GFAP和IBA1 蛋白表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與Aβ+氧氣組相比，Aβ+七氟烷組大鼠海馬區GFAP和IBA1 蛋白表達進一步增多，差異有統計學意義（P＜0.05）。NS+氧氣組和NS+七氟烷組大鼠之間GFAP 和IBA1 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠GFAP和IBA1表達比較/（個/高倍視野，）

表3 各組大鼠GFAP和IBA1表達比較/（個/高倍視野，）

注：GFAP 為膠質纖維酸性蛋白，IBA1 為離子鈣接頭蛋白分子1，NS為生理鹽水，Aβ為β淀粉樣蛋白。①與NS+氧氣組相比，P＜0.05。②與Aβ+氧氣組相比，P＜0.05。

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2.4 七氟烷吸入對大鼠海馬組織Bcl-xL、caspase-9、RAGE 和BDNF 蛋白表達的影響與NS+氧氣組比較，Aβ+氧氣組大鼠海馬區caspase-9 和RAGE 蛋白的表達增高，Bcl-xL 和BDNF 蛋白表達降低（P＜0.05）。與Aβ+氧氣組相比，Aβ+七氟烷組大鼠海馬組織caspase-9 和RAGE 蛋白的表達量明顯增高，Bcl-xL 和BDNF 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。而NS+O2組和NS+sevo 組之間的Bcl-xL、caspase-9、RAGE 和BDNF 的蛋白表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4，圖1。

圖1 各組大鼠海馬中Bcl-xL、caspase-9、BDNF、RAGE蛋白表達水平

表4 各組大鼠海馬區Bcl-xL、caspase-9、BDNF、RAGE蛋白表達水平比較/

表4 各組大鼠海馬區Bcl-xL、caspase-9、BDNF、RAGE蛋白表達水平比較/

注：Bcl-xL為B淋巴細胞瘤-xL，caspase-9為胱天蛋白酶-9，BDNF為腦源性神經營養因子，RAGE為晚期糖基化終末產物受體，NS為生理鹽水，Aβ為β淀粉樣蛋白。①與NS+氧氣組相比，P＜0.05。②與Aβ+氧氣組相比，P＜0.05。

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2.5 七氟烷吸入對大鼠海馬組織IL-1β、NF-κB 和iNOS mRNA 表達的影響與NS+氧氣組比較，Aβ+氧氣組大鼠海馬區IL-1β、NF-κB 和iNOS mRNA 表達升高（P＜0.05）。與Aβ+氧氣組相比，Aβ+七氟烷組大鼠海馬區IL-1β、NF-κB 和iNOS mRNA 表達明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.05）。而NS+O2組和NS+sevo 組之間的IL-1β、NF-κB 和iNOS mRNA 表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠海馬區IL-1β、NF-κB和iNOS的mRNA相對表達量比較/

表5 各組大鼠海馬區IL-1β、NF-κB和iNOS的mRNA相對表達量比較/

注：IL-1β 為白細胞介素-1β，NF-κB 為核因子-κB，iNOS 為誘導型一氧化氮合酶，NS為生理鹽水，Aβ為β淀粉樣蛋白。①與NS+氧氣組相比，P＜0.05。②與Aβ+氧氣組相比，P＜0.05。

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3 討論

傳統觀念將七氟烷引起的延遲性神經認知功能障礙歸因于直接的神經毒性作用［6］。為了探討對于術前患有AD 或具有AD 傾向的病人應用七氟烷是否會加重其認知功能障礙，本研究在大鼠雙側海馬注射NS 或Aβ1-40后持續吸入30%氧氣或2.5%七氟烷4 h。結果發現2.5%七氟烷僅對海馬注射Aβ的大鼠產生神經毒性作用，對注射NS 的大鼠無損傷，這表明七氟烷對正常大鼠無影響。NS+七氟烷組或Aβ+七氟烷組大鼠的MAP、心率、pH、PaCO2，PaO2、HCO3-等生命體征無明顯變化，表明在本研究中使用的七氟烷吸入時間和濃度是可行的。

與吸入氧氣相比，Aβ組大鼠吸入七氟烷麻醉后逃逸潛伏期明顯延長，提示七氟烷吸入可誘發大鼠神經認知功能障礙，這一結果與其他關于逃逸潛伏期的研究［7］一致。麻醉藥物可能導致發育中大腦的廣泛神經變性和持續學習障礙，但其行為異常的確切機制仍不清楚。多項研究表明，大鼠七氟烷暴露可顯著增加多個腦區神經元凋亡［8］。Aβ 沉積是AD發病的重要神經病理學標志［9］。Du 等［10］的研究結果發現，與AD 相關的Aβ 肽沉積會誘發神經元凋亡。本研究數據顯示，Aβ+七氟烷組大鼠吸入七氟烷后第7 天海馬Aβ1-40水平明顯增加。這些數據表明，七氟烷吸入導致AD 病人認知功能進一步損傷的部分原因是加劇細胞內Aβ1-40積累。盡管Aβ1-40和Aβ1-42肽在生物體液中普遍存在［11］，但Aβ1-40被認為在AD病人中更具致病性［12］。

GFAP和IBA1常被用作星形膠質細胞和小膠質細胞激活的標志［13］。GFAP 是一種中間絲蛋白，其免疫染色主要用于星形膠質細胞與Aβ 斑塊共定位［14］。IBA1作為一種鈣結合蛋白，在顯示小膠質細胞激活方面起重要作用，這種激活幾乎與AD 老年斑中發現的Aβ 蛋白的致密沉積密切相關［15］。本研究結果顯示，吸入七氟烷后第7 天，Aβ+sevo 組大鼠海馬GFAP 和IBA1 表達明顯增加，而吸入氧氣后無明顯變化，提示七氟烷主要作用于這些膠質細胞，加劇海馬區神經膠質活化。

AD 的病理特征是錯誤折疊蛋白的積累和炎癥變化，導致區域特定性突觸喪失和神經元死亡［16］。目前認為，細胞凋亡的控制缺陷似乎在神經退行性疾病的發病機制中發揮核心作用［17］。Bcl-xL能夠保護神經系統免受caspase-9 依賴性凋亡的影響，靶向破壞Bcl-xL 可導致未成熟神經元大量死亡，而抑制caspase-9 會導致神經元凋亡減少和神經發育異常。本研究結果顯示，與Aβ+氧氣組相比，Aβ+七氟烷組大鼠海馬組織caspase-9 表達量明顯增高，而Bcl-xL表達下降。這些發現提示，七氟烷暴露可能通過潛在地破壞凋亡細胞死亡調節中Bcl-xL 和caspase-9表達平衡而加劇認知功能障礙。RAGE 被認為是神經變性和神經炎癥的潛在促發因素之一，在AD 影響的腦區表達增加［18］。BDNF 是一種神經營養因子，在調節突觸傳遞、神經元存活、軸突導向以及記憶形成和認知方面發揮關鍵作用［19］，可保護神經元免受Aβ 誘導的神經毒性損傷并促進Aβ 降解［20］。本研究結果發現，在Aβ 處理的海馬中，七氟烷吸入增加了RAGE 的表達，并降低BDNF 水平，提示七氟烷吸入可能通過引發海馬組織的神經毒性而導致認知能力下降。

已有研究證實NF-κB 信號通路對于調控炎癥介質的表達有重要作用，可調控主要促炎因子IL-1β的轉錄，與細胞的增殖和凋亡等病理生理過程密切相關在AD 神經元損傷過程中發揮關鍵作用，并依賴于氧化應激的激活［21］。iNOS 具有顯著的促炎作用，激活后可產生大量氧化因子ROS，增強機體氧化應激的程度，促進炎癥因子表達［22］。qRT-PCR 結果顯示，七氟烷吸入麻醉導致Aβ1-40誘導的AD 大鼠海馬中Il-1β、NF-κB 和iNOS mRNA 表達增加，提示七氟烷吸入會驅動AD 病人強大的神經炎癥變化，導致大腦神經元死亡。

綜上所述，給予AD 模型大鼠七氟烷吸入麻醉可能會導致認知障礙和衰退，其基本機制是在Aβ注射的大鼠海馬中形成神經毒性、神經炎癥和神經元凋亡。