一種可用于OBI 檢測的高靈敏度核酸提取方法的建立與驗證

高文博 何博 杜榮松 廖芬芳 謝君謀 王敏 王淏

(廣州血液中心廣州市醫學重點實驗室血液安全重點實驗室，廣東 廣州 510095)

隱匿性HBV 感染(occult hepatits B virus infection，OBI)是HBV 感染的1 種特殊形式，其以HBsAg 持續陰性，血液或肝臟中HBV DNA 病毒載量低為特征[1-2]。 因OBI 患者體內HBV DNA 往往處于極低水平，甚至可能低于HBV DNA 核酸檢測(nucleic acid test， NAT)的檢測下限，所以常常導致NAT 檢測假陰性和序列擴增失敗[1]。 如何提取足夠濃度的HBV DNA 用于檢測或序列擴增已成為影響輸血安全以及OBI 分子生物研究的難題。

目前采供血機構用于NAT 的進口檢測系統主要包括Roche 檢測系統和Grifols 檢測系統，無論是Roche 檢測系統的混檢模式(6 人份混檢，每支標本167 μL 混合為1 mL)、拆分模式(單支標本1 mL)，還是Grifols 檢測系統的聯檢模式(單支標本500 μL)，都是從≤1 mL 的標本中提取核酸進行檢測。 這對于很多病毒載量低的標本，尤其是OBI 標本，可能無法有效提取出足夠量的核酸。 另外，這2 種檢測系統都只是定性檢測，無法對標本的病毒濃度進行實際定量。

已有報道的針對低病毒載量標本的核酸提取方法有PEG 富集法[3]和超高速離心法[4-5]。 其中超高速離心法需要在4 ℃、250 000 g 條件下離心數小時，對設備要求高；而PEG 富集法需要4 ℃過夜，實驗過程耗時相對較長。 因此本研究旨在建立1 種操作性強、耗時較短、易于普及的，可用于極低病毒載量OBI 核酸提取的方法，以此獲得足夠的HBV DNA，為提高NAT 檢測下限和序列擴增效率提供方法學參考。

1 材料與方法

1.1 標本來源

對2019 年9 月—2020 年3 月本中心采集的無償獻血者標本，同時進行ELISA 雙試劑HBsAg 和Panther 核酸檢測系統NAT 檢測，其中ELISA -/NAT＋的標本共168 份，收集這些標本相對應的報廢新鮮冰凍血漿(100 或200 mL，ACD 或CPD 抗凝)，分裝凍存備用。

1.2 試劑與儀器

ELISA 試劑:HBsAg ELISA 檢測試劑(北京萬泰公司，批號:B20190519；上?？迫A公司，批號:201904151)。 電化學發光試劑:HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 檢測試劑(Roche 公司，批號: 47040801、 47336501、 43358203、 43862602、46343102)。 NAT 試劑: High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume 試劑(Roche 公司， 批號:58726800)，Procleix Ultrio Elite Assay 試劑(Grifols公司，批號:700516)。 HBV DNA 定量檢測試劑(PCR-熒光探針法，適用于HBV B 型、C 型、D 型、B/C 型混合、C/D 型混合標本，廣州達安公司，批號:2020001)；陰性血漿(廣州邦德盛公司)；磁珠、蛋白酶K 試劑、EB、洗脫液(Roche 公司)，異硫氰酸胍、DTT、檸檬酸鈉二水合物(碧云天公司)，Polydocanol(Sigma 公司)，8420 低速離心機(久保田公司)，5418 高速離心機(Eppendorf 公司)，DHP-9012 恒溫箱(上海一恒公司)，DK-8D 水浴箱(上海精宏公司)，7500 型熒光定量PCR 儀(ABI 公司)，QBD-1 干浴器(Grant 公司)，105004 旋轉混勻器(NEST 公司)，T203 分析天平(DENVER 公司)，SI-0246 渦旋振蕩器(SI 公司)，納米磁珠分離器(實驗室自制)，STAR 全自動加樣儀、FAME 全自動酶免分析儀(Hamilton 公司)，Panther 核酸檢測系統(Grifols 公司)，Cobas E601 全自動電化學發光免疫分析儀(Roche 公司)。

1.3 方法

1.3.1 裂解液配置

參照Roche Cobas Taq Screen MPX Test，version 2.0 核酸檢測試劑盒裂解液配置(做部分調整)，按照0.3%檸檬酸鈉二水合物、42.5%異硫氰酸胍、5%Polydocanol 和0.9% DTT 的比例，加入蒸餾水充分溶解。

1.3.2 標準品配置

將達安HBV DNA 定量檢測試劑盒中的陽性定量參考品(2×106IU/mL、2×105IU/mL、2×104IU/mL、2×103IU/mL，其量值可溯源為有證國家標準物質)加陰性血漿分別配置成10 000 IU/mL、1 000 IU/mL、100 IU/mL、10 IU/mL 和1 IU/mL 濃度的標準品。

1.3.3 大體積核酸提取

參照Roche Cobas Taq Screen MPX Test，version 2.0 核酸檢測試劑盒核酸提取方法，在進行了多次實驗條件摸索和不同參數的效果比對后，做了如下調整:在50 mL 的無菌離心管內分別加入不同濃度的10 mL 標準品，600 μL 的蛋白酶K 試劑，1 000 μL的磁珠和15 mL 的裂解液；蓋緊管蓋，漩渦振蕩1 min，70 ℃溫育15min 后振蕩顛倒搖勻5 min；將離心管放入磁力架，吸磁1 min，棄上清；將約33 mL的磁珠洗滌液加入離心管，漩渦振蕩30～60 s，共洗滌3 遍；將離心管放入磁力架，吸磁，棄上清，留約500 μL 磁珠混合液，轉移至2 mL EP管；將EP 管1 801 g 離心1 min，平鋪吸磁，用移液器吸取上清，棄去，盡量吸取干凈；EP 管敞開蓋，56℃烘干2 h；往離心管內加入65℃預熱的洗脫液(EB)65 μL，移液器反復吹打，充分懸浮磁珠；蓋緊管蓋，70℃靜置5 min 40 s，期間混勻數次使核酸從磁珠上洗脫下來；將離心管放在磁力架上，吸磁。上清即為核酸溶液，-20℃保存備用。

1.3.4 熒光定量PCR

按照達安HBV DNA 定量檢測試劑盒說明書操作。 具體步驟為:將提取的不同濃度標準品核酸作為模板，每個濃度梯度進行平行雙份檢測。 每個PCR 反應管內加入HBV 反應液A 1 μL、HBV 反應液B 1.5 μL、HBV 反應液C 7.5 μL 和模板20 μL，蓋緊管蓋，瞬時離心15 s 轉至擴增檢測區。 使用熒光定量PCR 儀按如下循環進行反應:50℃2 min、1 cycle，95℃15 min、1 cycle，94℃15 s →55℃45 s、45 cycles。

1.3.5 方法驗證

病毒濃度經過對數轉換后，以病毒濃度的對數為X 軸，同濃度標準品2 次檢測CT 值的平均值為Y 軸，構建熒光定量標準曲線和回歸方程。 共進行3 次獨立HBV 標準品提取和熒光定量，分別構建標準曲線和回歸方程，取3 次HBV 標準品平均CT值構建平均標準曲線回歸方程。

1.3.6 OBI 標本確認

采取Roche 電化學發光免疫分析法對ELISA-/NAT＋獻血者標本進行HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 檢測，嚴格按照檢測試劑說明書操作。 若HBsAg-、NAT＋且抗-HBc＋則判定為OBI[6]。

1.3.7 OBI 標本檢測

依照說明書方法用High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume 試劑盒提取2.5 mL OBI 標本DNA 并做熒光定量PCR，結果為陰性的標本再采用上述方法提取標本DNA 并和2 份陰性對照標本一起做熒光定量PCR。

1.4 統計學分析

使用Graphpad Prism 9.5 和Microsoft Excel 2019 軟件進行數據統計分析和作圖。 采用簡單線性回歸模型構建標準曲線。

2 結果

2.1 HBV DNA 標準品熒光定量PCR 結果與標準曲線

見表1、圖1，CV 均＜5%，說明本核酸提取方法有較高的穩定性。

圖1 3 次標準曲線及不同濃度標準品CT 值的變異系數Figure 1 Coefficient of variation of CT values of standards with different concentrations in triplicate standard curves

CT 值標準曲線1 標準曲線2 標準曲線3 均值CV(%HBV DNA 10 00026.9327.1426.7226.93 0.78標準品1 00030.7930.4929.9830.42 1.36(IU/mL) 10034.3634.1133.3733.94 1.52 1037.6337.7137.1737.50 0.78 140.8941.2640.7740.98 0.63

2.2 標準曲線回歸方程

3 次標準曲線回歸方程的E(擴增效率)均在90%～105%，擴增效率理想； R2均＞0.99，表明CT值與病毒模板量的對數之間具有良好線性關系，見表2。

回歸方程E(%)斜率R2標準曲線1Y＝-3.49X＋41.0794.041.10.999 2Y＝-3.55X＋41.2491.441.20.999 3Y＝-3.53X＋40.6692.040.70.999均值 Y＝-3.52X＋40.9992.341.00.999

2.3 OBI 標本熒光定量PCR 結果

經大體積方法提取的6 份低病毒載量OBI 標本(OBI-1—6)的熒光定量PCR 結果均為陽性。 通過回歸方程計算出的對應HBV 病毒濃度均值為1.70 IU/mL，其中最低的OBI-4 病毒濃度為0.18 IU/mL(表3)。 陰性對照NC 均無擴增信號。

NAT HBsAg 抗-HBs(IU/L)抗-HBc HBe HBeAg CT值抗-HBV DNA(IU/mL)OBI-1 ＋- 105.4(＋) ＋--40.840.56 OBI-2 ＋- 85.55(＋) ＋--39.002.01 OBI-3 ＋- 31.33(＋) ＋＋-38.492.86 OBI-4 ＋- 56.13(＋) ＋＋-42.430.18 OBI-5 ＋- ＜10 (-) ＋--39.631.29 OBI-6 ＋- ＜10 (-) ＋＋-38.283.32均值39.781.70

3 討論

OBI 獻血者體內的HBV 含量通常較低，病毒載量常常＜5 IU/mL[7]。 Weusten 等[8]對于評估OBI 輸血殘余風險的數學模型顯示，約有3.3%的OBI 獻血者是單支標本核酸檢測(ID-NAT)無法檢測到的，并且20 mL 該OBI 獻血者的血液制品即可造成感染。 2018 年Candotti 等[9]報道了3 名HBsAg-/HBV DNA-的OBI 獻血者造成31 名受血者中的9 人感染，進一步證實了HBV DNA 的最小感染病毒載量為3 IU，如要盡可能的降低OBI 經血傳播HBV 的殘余風險，需要提高NAT 檢測下限到0.15 IU。 這與目前高敏感NAT 3.4 IU/mL(Grifols核酸聯檢檢測系統)和2.3 IU/mL(Roche 核酸檢測系統)的檢測下限相比，還有較大差距。 國內也有研究表明，低病毒載量OBI 標本與NAT 的非重復反應現象(可能造成假陰性)密切相關[10]，從另一方面也印證了OBI 漏檢可能性較大。 因此針對OBI 標本的檢測和確認，我們亟需1 種更高靈敏度的核酸檢測方法。 而本研究針對上述問題，通過提高提取核酸標本的體積到10 mL，建立了1 種可用于OBI 的大體積高靈敏度核酸提取方法。 在大體積核酸提取方法的建立過程中，我們進行了長時間的實驗條件和體系的摸索，為了降低實驗成本，采用不同濃度多聚正癸醇配比裂解液，在評估檢測效果的基礎上最終確認在不影響實驗結果的情況下的最優配比；為了克服大體積標本核酸濃縮到小體積中的難點，我們首創性地增加了磁珠烘干步驟。經過烘干，可以使得原來與較大量磁珠相結合的標本DNA(10 mL 標本中提取)沒有多余水分，在加入65 μL 洗脫液洗脫后，不會被稀釋，有利于后續的DNA 檢測與定量。

實驗結果顯示，本核酸提取方法具有較高的穩定性，同時標準品擴增效果理想， CT 值與病毒模板量的對數之間具有良好的線性關系，說明該方法均能將5 個濃度的標準品DNA 提取完全，并將HBV 定量檢測下限提高到1 IU/mL，充分驗證了本方法的提取效率和高靈敏度。 但同時我們也可以看到3 次標準曲線的回歸方程均有差異，這可能是每1 次實驗條件變化造成的影響。 因此當進行低病毒載量標本的定量分析時，應同時進行標準品的檢測，以當次標準品所構建的標準曲線和回歸方程為準。

對于經2.5 mL 核酸提取試劑盒提取核酸后擴增失敗的低病毒載量OBI 標本，我們通過本大體積(10 mL)方法提取到核酸，然后通過熒光定量獲得CT 值并計算出了對應HBV 的病毒濃度(表3)。這表明與2.5 mL 核酸提取方法相比，本方法能夠提取出更多核酸，有利于后續實驗。 目前，Roche試劑因其較高的靈敏度、精密度和重復性，被公認為是HBV DNA 定量檢測的參比試劑[11]，其檢測下限為20 IU/mL。 近些年來，國內的HBV DNA 定量試劑逐漸優化，有研究表明國產試劑與Roche 試劑的定量結果有良好的相關性[12]。 本方法通過擴大體積，提高了檢測靈敏度，檢測下限達到1 IU/mL，能夠有效減少NAT 假陰性，為熒光定量PCR 或巢式PCR 提供足夠濃度的病毒DNA 模板。

本方法采用磁珠提取法，與PEG 富集法比，實驗時間短，提取效率更高；與超高速離心法比，所需設備相對簡單，可操作性更強。 最重要的是通過大體積核酸提取方法，可以大大提高提取的核酸量，將HBV 定量檢測下限提高到1 IU/mL，可以對低病毒載量的OBI 標本進行核酸定量。 不過需要指出的是，針對目前的采供血機構篩查體系，常規留樣10 mL 標本可能較為困難，因此本方法更適合科學研究中對疑似OBI 標本進行核酸富集及鑒定確認。 而針對目前采供血機構核酸檢測系統基本為HBV、HCV 和HIV 的聯檢模式，本大體積核酸提取系統能否適用于HCV、HIV 甚至其他病毒核酸的提取，也有待下一步研究和確認。