山東省臨沭縣鴨疫里默氏桿菌分離鑒定及生物特性分析

楊希川

（臨沭縣動物疫病預防控制中心，山東臨沭 276700）

鴨疫里默氏桿菌病是一種由鴨疫里默氏桿菌（Riemerellaanatipestifer，RA）感染水禽（鴨、鵝等）和鳥類引起的細菌性傳染病，廣泛流行于世界各地，發病率和死亡率均較高。衛生條件差、營養不良、環境突變等引起的應激反應常導致易感動物感染RA。被RA 感染的動物常表現流鼻涕、咳嗽、鼻竇炎、腹瀉和神經癥狀，病死動物以纖維素性心包炎、腦膜炎、肝周炎、卵管炎和氣囊炎為主要病理特征。RA 血清型較多，目前世界上已至少發現21 種[1]，國內至少流行13 種[2]。由于不同血清型之間缺乏交叉保護，疫苗保護效力有限，抗生素仍然是治療RA 感染的常用方法。然而，由于抗生素濫用導致RA 耐藥性加劇，加之臨床上RA 常與其他病原微生物混合感染，均給鴨疫里默氏桿菌病治療增加了難度。

近年來，山東省臨沭縣某些鴨鵝養殖場戶鴨疫里默氏桿菌病頻發，造成一定經濟損失。2023年5—6 月，從臨沭縣8 家鴨鵝養殖場戶采集疑似鴨疫里默氏桿菌病病死動物的心血、腦和肝臟等組織樣本，進行RA 分離鑒定和血清型分型，并對RA 耐藥性及致病性進行了評估，以期為鴨疫里默氏桿菌病治療和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料與試驗動物

從山東省臨沭縣8 家鴨鵝養殖場戶采集疑似感染RA 的病死鴨鵝心血、腦和肝臟等組織病料，每只動物病料計為1 份，共40 份。未免疫7 日齡健康雛鴨20 只，購自臨沭縣金興養鴨專業合作社。

1.2 主要試劑和質控菌株

胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、巧克力瓊脂培養基、麥康凱培養基（MAC），購自青島海博生物技術有限公司；抗菌藥物藥敏紙片（共16 種）、微量生化鑒定管，購自杭州微生物試劑有限公司；新生犢牛血清，購自江蘇科晶生物科技有限公司；Goldview 核酸染料、革蘭氏染液，購自北京萬佳首化生物科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker，2×TaqPCR Master Mix，TIANamp Bacteria DNA kit、DNA 膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；RA 1～13、16 血清型陽性血清，購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所；質控菌株大腸埃希菌（CMCC（B）44102），購自中國獸醫藥品監察所。

1.3 引物設計與合成

參考文獻[3] 設計16S rRNA 基因通用引物： 上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'； 下游引物1492R：5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。擴增產物長度約1 450 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 分離培養

將病料無菌劃線接種于巧克力瓊脂培養基，37 ℃培養24 h；挑取邊緣整齊、半透明、表面光滑濕潤的露滴狀菌落分別接種于巧克力瓊脂培養基和MAC，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24～48 h，觀察菌落形態；選取單個菌落接種于TSB（含5%新生犢牛血清），取純培養菌液進行革蘭氏染色，利用生物學顯微鏡觀察，記錄菌體形態、染色特性。

1.5 生化鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》[4]，挑取純化培養的分離菌接種于生化鑒定管，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養24～48 h，對照手冊判定生化特性。

1.6 PCR 鑒定

吸取純培養液1～5 mL， 采用TIANamp Bacteria DNA kit 提取總DNA，使用16S rRNA 基因通用引物進行PCR 鑒定。PCR 反應體系（25.0 μL）：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，菌液2.0 μL，ddH2O 補至總反應體積25.0 μL。PCR 反應條件：95 ℃ 8 min；93 ℃ 25 s，54 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，共37 個循環；72 ℃ 10 min。將PCR 產物膠回收后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。利用BLAST 軟件與NCBI 公布的15 株RA 參考菌株進行同源性比對，并用MegAlign 繪制系統發育進化樹。

1.7 血清型分型

參考文獻[5]方法，采用玻片凝集法進行RA血清分型。同時設各血清型陽性菌株為陽性對照，以PBS 和大腸桿菌為空白對照和陰性對照。3 min內RA 凝集抗原與相應血清型血清出現顆粒狀凝集者判為陽性，否則判為陰性。

1.8 藥敏試驗

參照美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）推薦的K-B 法進行16 種抗菌藥敏感性檢測。以大腸埃希菌CMCC（B）44102 為質控菌株，按照CLSI—2017 年版標準判斷抗菌藥敏感、中介和耐藥。

1.9 動物回歸試驗

隨機選取1、2、11 血清型RA 各1 株，接種于含有5%犢牛血清的TSB 液體培養基中進行增菌培養。取培養好的菌液進行10 倍倍比稀釋，每個稀釋度菌液各取100 μL均勻涂布于綿羊血平板，37 ℃厭氧培養24 h 后進行活菌計數，計算菌液濃度，配制濃度為1×109CFU/mL 的菌液作為RA 攻毒菌液。將20 只未免疫7 日齡健康雛鴨隨機分為1 個對照組和3 個試驗組，5 只/組。試驗組雛鴨分別腿部肌肉注射1、2、11 血清型RA 菌液，0.5 mL/只，對照組注射等量生理鹽水。注射完畢后分組飼養，連續7 d 每日觀察雛鴨發病情況。

2 結果

2.1 分離培養

將病料分別接種于巧克力瓊脂培養基和MAC，結果有12 份病料在巧克力瓊脂培養基表面出現邊緣整齊、半透明、表面光滑濕潤的露滴狀菌落（圖1-A），而MAC 未見菌落生長。革蘭氏染色鏡檢，可見兩端鈍圓、單個或成對排列的革蘭陰性短小桿菌（圖1-B）。

圖1 分離菌株菌落形態及革蘭氏染色鏡檢結果

2.2 生化鑒定

將12 株純培養分離菌分別接種于微量生化鑒定管。結果（表1）顯示，所有分離菌生化反應結果均與RA 一致。結合培養特性、菌體形態和生化反應結果，初步判定12 株分離菌均為RA，分別命名為LS-RA01～12。

表1 分離菌生化鑒定結果

2.3 PCR 鑒定

隨機選取5 株分離菌進行PCR 擴增。結果（圖2）顯示，均獲得長度約為1 450 bp 的PCR 擴增產物。將分離菌株16S rRNA 基因測序結果與NCBI數據庫公布的15 株RA 參考菌株進行核苷酸同源性比對，發現核苷酸同源性達98.6%～99.9%。系統進化樹（圖3）顯示，5 株分離菌株與15 株RA 參考菌株親緣性較近，其中，LS-RA02、LS-RA011與LS-RA05 株親緣性相近，LS-RA07 與LS-RA08株親緣性相近。結合分離菌的培養特性、生化試驗特性及16S rRNA 基因測序結果，證實這5 株分離菌均為RA。

圖3 系統進化樹

2.4 血清型鑒定

采用玻片凝集法對12 株分離菌進行血清型分型。 結果顯示：LS-RA01～05、LS-RA08、LS-RA09 為血清1 型， 共7 株；LS-RA06、LSRA07 為血清2 型，共2 株；LS-RA10～12 為血清11 型，共3 株。

2.5 藥敏試驗

采用K-B 紙片擴散法對12 株RA 進行藥敏試驗。結果（表2）顯示，所有菌株均對丁胺卡那、慶大霉素、新霉素和阿莫西林耐藥，對頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢氨芐敏感；對復方新諾明、氨芐西林、氟苯尼考、四環素、多西環素、恩諾沙星、諾氟沙星、阿米卡星、紅霉素的耐藥率為25.00%～58.33%。

表2 藥敏試驗結果

2.6 動物回歸試驗

攻毒8 h 后，3 個試驗組雛鴨均表現精神萎靡、縮頸、不愿走動、食欲減退；24 h 后，均出現神經癥狀、眼鼻分泌物增多、腹瀉，其中血清2 型試驗組有1 只雛鴨死亡；48 h 后，血清1 型、2 型、11型試驗組分別有2、4、2 只雛鴨死亡，死亡率為40%（8/20），56 h 后，3 個試驗組所有雛鴨均死亡。對照組雛鴨未見發病。剖檢（圖4）可見：病死雛鴨心包膜增厚、出血，表面附著纖維素性滲出物；肝臟腫大、質脆、散在分布點狀結節和纖維素性薄膜、肝周炎；腦膜水腫增厚、充血。臨床癥狀及病理變化與臨床發病鴨一致。

圖4 對照組和試驗組雛鴨臨床癥狀及病理變化

3 討論

RA 是一種有莢膜、不形成芽孢、無內孔、不能運動的革蘭氏陰性桿狀細菌，屬于黃桿菌科里默氏桿菌屬，可以通過呼吸道和皮膚傷口水平傳播，也可垂直傳播[6]。由于當前多種病原微生物混合感染的情況非常普遍，加之臨床癥狀、病理變化相似甚至相同，臨床上區分RA 與其他病原體（大腸桿菌、沙門氏菌和多殺性巴氏桿菌）感染十分困難，因此對病原微生物進行實驗室檢測很有必要。值得注意的是，已有研究[7]報道，不同來源RA 的生化特性存在部分差異，絕大部分RA 不發酵碳水化合物，僅少數菌株可發酵葡萄糖、果糖和麥芽糖等，而本研究中12 株RA 生化特性一致，具體原因需要進一步研究分析。

本研究采用細菌培養、生化試驗和16S rRNA方法對疑似感染RA 鴨鵝的40 份病料進行了病原學檢測，檢出12 株RA。結果提示，近年來臨沭縣部分鴨鵝養殖場持續流行的以流鼻涕、咳嗽、鼻竇炎、腹瀉和神經癥狀（如斜頸、頭部震顫和跛行）等為特征的疫病可能與RA 感染有關，也可能存在與其他病原繼發或者混合感染的情況。Lyu等[8]報道，山東省鴨疫里默氏桿菌病總體流行率為16.76%（171/1 020），低于本研究結果，這可能與抽樣數量、采樣部位以及不同地區等因素有關。丹麥RA分離率為90%[9]，印度鴨疫里默氏桿菌病患病率為40%，死亡率為75%[10]，說明部分國家和地區RA感染較為嚴重，且流行率差別較大。

細菌血清型鑒定有助于疫苗開發和應用，提高疫病防治效果。RA 的血清學分型鑒定方法主要有試管凝集試驗和玻片凝集試驗[11]。RA 血清型復雜，本研究利用玻片凝集法對12 株分離菌株進行血清分型鑒定，發現血清1 型占比最高（58.33%），說明血清1 型為臨沭縣RA 流行的優勢血清型。受病料來源局限，未檢出其他血清型，但不排除當地存在其他血清型流行。呂澤昊等[12]報道，山東省部分地區RA 流行菌株大多為血清1、2、6 和7 型。吳彩艷等[13]研究發現，廣東省存在RA 分離株血清1、2、3、5、6、7、8、10 型流行，其中以1 型為優勢血清型。在迄今為止報道的21 種RA 血清型中，我國已經分離鑒定了13 種，其中血清型1和2 是引起鴨疫里默氏桿菌病暴發最常見的病原體[14]。國外也流行多種RA 血清型[8]：丹麥大多數RA 為血清4 型；血清1 型是匈牙利最常見的RA血清型，占菌株總數的64.5%；越南RA 血清型10占多數。由此可見，國內外RA 血清型流行種類較多，血清1 型為優勢血清型，應重點關注。此外，一個地區RA 的血清型會隨氣候、季節變化，并且存在高比例、不可分型的RA 菌株[15]。因此，建議定期監測本地區RA 流行情況，根據其流行菌株選擇合適疫苗進行防控。

RA 對氨基糖苷類、大環內酯類、頭孢菌素類等多種抗生素具有天然耐藥性，是一種多重耐藥細菌[16]。用抗生素防治RA 感染同時也增加了耐藥菌株的出現和傳播。從RA 耐藥性來看，不同地區、時間分離的RA 耐藥性差異較大[17]。éva 等[18]報道，匈牙利大多數RA 對氟苯尼考、氨芐西林、青霉素、磺胺甲惡唑-甲氧芐啶和大觀霉素敏感，而對四環素、氟甲喹、鏈霉素和紅霉素的耐藥率相對較高，且根據菌株的地理來源，耐藥模式顯示出一些變化。本研究對12 株RA 進行耐藥性檢測發現，所有菌株對丁胺卡那、慶大霉素、新霉素和阿莫西林耐藥，而對頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢氨芐敏感，與朱元軍等[19]和王慶云等[20]報道基本一致，而與呂澤昊等[21]、陳棟等[22]和朱玲玲等[23]報道有所不同，這可能與菌株的生物特性、養殖環境和藥物使用習慣等密切相關。已有研究[5]表明，細菌的耐藥性與生物被膜的形成有關。因此，在使用抗菌藥防治RA 感染前應結合藥敏試驗結果選用敏感藥物，從而提高藥物防治成效。

在動物回歸試驗中，3 種血清型RA 感染雛鴨后，臨床癥狀和病理變化與臨床自然感染RA 鴨表現一致，均具有眼鼻分泌物增多、頭頸歪斜、抽搐和運動障礙等癥狀，剖檢可見明顯的纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎，最終攻毒組雛鴨全部死亡，說明3 種血清型RA 對雛鴨均具有較強的致病力，提示當地鴨疫里默氏桿菌病死亡率較高可能與流行菌株毒力較強有關。

4 結論

臨沭縣RA 感染較普遍，主要流行血清1 型，同時也存在血清2、11型。RA流行菌株致病力較強，對常用抗菌藥的耐藥情況不容樂觀。建議加強定期病原學監測和耐藥性分析，結合本地菌株生物學特性針對性選擇疫苗和抗菌藥防治，以提高RA 防控效果。