β-受體激動劑類藥物人工抗原合成方法研究進展

孫曉亮，王曉茵，方漢卿，宋翠平，趙思俊，曹旭敏，李木子

（中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032）

β-受體激動劑是一類化學合成的具有苯乙醇胺結構的藥物，可促進蛋白同化，提高瘦肉率，個別不法分子將其用于畜禽養殖，以達到非法牟利的目的。長期或大劑量使用β-受體激動劑類藥物能引發畜禽生理系統中毒，導致心臟顫動、心動過速、神經過敏、肌肉顫動、意識模糊，甚至中毒[1-4]。因此，包括我國在內的許多國家都禁止克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等β-受體激動劑用于食品動物養殖。

為了加強β-受體激動劑類藥物的殘留監管，國內外學者對該類藥物的檢測方法開展了廣泛而深入的研究。目前對β-受體激動劑類藥物進行殘留檢測的方法有液相色譜法[5]、液相色譜-串聯質譜法[6]、氣相色譜-串聯質譜法[7]等定量確證檢測方法，以及酶聯免疫吸附測定法[8]、膠體金試紙法[9]等免疫快速檢測方法。其中，免疫分析方法主要基于抗原抗體的特異性反應，具有操作簡便快速、靈敏度高、檢測成本低等優點，已被廣泛應用于大批量畜禽產品的快速篩查工作。

抗體是開展免疫檢測的核心成分，獲得特異性好、親和力強的抗體已成為科研工作者追求的目標，而合成高效的人工抗原是獲得高質量抗體的前提[10]。β-受體激動劑類藥物屬于小分子化合物，不具有免疫原性，只有將其與載體蛋白偶聯后制備成完全抗原，才可刺激淋巴細胞產生特異性抗體，用于免疫分析。在大多數情況下，半抗原的活性基團不能直接與載體蛋白偶聯，需要交聯劑對其反應基團進行活化，只有這樣才能在溫和條件下與載體偶聯。根據半抗原活性基團的不同，選擇適當的偶聯方法，得到偶聯率均一、穩定的人工抗原，是合成方法的關鍵。本文基于常見的β-受體激動劑類藥物不同的化學結構類型，對其人工抗原的合成和鑒定方法進行了綜述，以期為小分子化合物免疫分析工作研究提供理論參考。

1 β-受體激動劑人工抗原合成

根據藥物的化學結構，常見的β-受體激動劑類藥物可分為苯酚型和苯胺型2 種，含有的活性基團分別為羥基（-OH）和氨基（-NH2），可直接利用該活性基團進行化學合成反應，也可以在羥基位引入含羧基（-COOH）的側鏈，或將硝基（-NO2）通過還原反應得到氨基（-NH2），再與載體蛋白偶聯。

1.1 苯酚型β-受體激動劑人工抗原合成

1.1.1 碳二亞胺法 碳二亞胺法通常以碳二亞胺為脫水劑，將分子中的羧基和氨基偶聯形成酰胺鍵。該偶聯條件溫和、操作簡便，但由于碳二亞胺沒有選擇性，為減少載體蛋白的羧基與氨基發生縮合，而導致載體蛋白之間偶聯，一般是先將含羧基的半抗原與碳二亞胺活化，再加入載體蛋白反應，形成完全抗原。栗慧等[11]采用該方法制備特布他林人工抗原，獲得了高靈敏度和特異性的特布他林多克隆抗體，血清效價達1:32 000 以上。

1.1.2 活潑酯法 活潑酯法是在碳二亞胺法的基礎上優化的方法。通常在避光條件下，N-羥基丁二酰亞胺中的羥胺鍵與半抗原分子中的羧基反應，得到活性中間體，再與載體蛋白偶聯，形成酰胺鍵；半抗原的羧基被活化后，更有利于與蛋白的氨基偶聯形成新的酰胺鍵，避免了碳二亞胺對載體蛋白的直接作用，從而降低載體蛋白間的偶聯，該方法在人工抗原的合成中應用廣泛。陳觀銀等[12]采用該方法合成沙丁胺醇人工抗原，制備的抗體對沙丁胺醇的半數抑制濃度（IC50）為0.746 ng/mL，與其他同類結構藥物的交叉反應率均小于0.015%，篩選出的雜交瘤細胞株培養上清液中抗體效價達1:128 000，小鼠腹水中抗體效價達1:2 560 000，具體合成路線如圖1 所示。郭東光等[13]采用該方法合成齊帕特羅人工抗原，制備了特異性強、靈敏度高的齊帕特羅抗體，血清效價在1:6 400 以上，與克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、鹽酸多巴胺、溴布特羅、西馬特羅和特布他林等均無交叉反應。

圖1 活潑酯法合成沙丁胺醇人工抗原技術路線圖

1.1.3 混合酸酐法 混合酸酐法是在胺的作用下，分子中的羧基與氯甲酸異丁酯反應，生成混合酸酐活性中間體，再與載體蛋白偶聯，得到相應的人工抗原，其操作過程簡單，應用較為廣泛。于洪俠等[14]采用該方法制備萊克多巴胺人工抗原，利用間接競爭ELISA 法檢測到抗血清效價高于1:6 000，IC50為10 ng/mL，與克倫特羅、沙丁胺醇和特布他林的交叉反應率均小于0.01%，具體合成路線見圖2。崔芳微等[15]采用該方法成功合成了沙丁胺醇人工抗原。沙丁胺醇與載體蛋白BSA 的偶聯比為17:1，免疫后兔血清抗體效價為1:102 400，IC50為24.84 μg/L；特異性鑒定結果顯示，沙丁胺醇多抗血清與側鏈上含有叔丁基官能團的結構類似物具有較強的交叉反應，但是與其他同類分子（如齊帕特羅、西馬特羅、萊克多巴胺和多巴胺等）不存在交叉反應。Liang 等[16]采用該方法合成了沙丁胺醇人工抗原，通過動物免疫及單抗制備，獲得了靈敏度高、交叉反應性強的沙丁胺醇單抗，IC50為0.27 ng/mL，可以同時識別特布他林、西布特羅、克倫特羅和溴布特羅等38 種β-受體激動劑。

圖2 混合酸酐法合成萊克多巴胺人工抗原技術路線圖

1.1.4 琥珀酸酐法 琥珀酸酐法是將分子中游離的-OH 與琥珀酸酐反應，引入一個琥珀酸酐碳連接臂，生成含有活性-COOH 的半抗原，再與蛋白反應，得到暴露出母核結構的人工抗原。Wu 等[17]采用該方法得到沙丁胺醇人工抗原，制備的抗體靈敏度高，IC50為0.028 μg/L，與克倫特羅（139.6%）和溴布特羅（225%）具有高度交叉反應性，具體合成路線見圖3。

圖3 琥珀酸酐法合成沙丁胺醇人工抗原技術路線圖

1.1.5 羰基二咪唑法 羰基二咪唑法基于化合物的羥基與羰基二咪唑反應，得到咪唑甲酸酯，然后載體蛋白中的N-親核試劑進攻羰基，形成肽鍵，得到完全抗原。曹碧云[18]采用該方法合成了沙丁胺醇人工抗原，具體合成路線見圖4。

圖4 羰基二咪唑法合成沙丁胺醇人工抗原技術路線圖

1.2 苯胺型β-受體激動劑人工抗原合成

克倫特羅、西馬特羅等藥物由于苯環具有伯氨基，屬于苯胺型β-受體激動劑。氨基作為活性化學基團，常用的偶聯方法有戊二醛法、重氮化法、異氰酸酯法、曼尼希反應法等。

1.2.1 重氮化法 重氮化法是含氨基藥物人工抗原合成最常用的方法。在低溫條件下，胺與亞硝酸鹽在過量酸（比如鹽酸）的作用下反應，生成重氮鹽；再與蛋白質分子中酪氨酸殘基鄰位反應，得到人工抗原。Cao 等[19]采用該方法合成苯乙醇胺A 人工抗原，制備的抗體具有較高靈敏度，IC50低于0.48 ng/mL，與克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺等9 種該類藥物的交叉反應率小于0.39%，具體合成路線見圖5。職愛民等[20]采用該方法合成西馬特羅人工抗原，經免疫試驗證實，獲得了高滴度的西馬特羅抗體，抗血清效價均達1:1 000 以上，IC50為86.9 ng/mL。Wang 等[21]也采用該方法合成克倫特羅人工抗原，利用該抗原獲得了具有廣譜性的克倫特羅單抗，可識別23 種β-受體激動劑及其類似物，并建立了競爭抑制酶聯免疫吸附分析方法。

圖5 重氮化法合成苯乙醇胺A 衍生物人工抗原技術路線圖

1.2.2 戊二醛法 戊二醛法反應條件溫和，將含有氨基的半抗原、載體蛋白和戊二醛以五碳橋連接，形成半抗原-戊二亞胺-BSA 人工抗原。但該方法選擇性差，容易造成載體間的偶聯。王耀等[22]采用該方法將戊二醛分子中的兩個醛基分別與鹽酸阿可樂定和BSA 的氨基反應形成席夫堿，一步合成可樂定人工抗原，得到的人工抗原有較好的免疫效果，小鼠多抗血清效價達1:12 800 以上，IC50為82.75 ng/mL，具體合成路線見圖6。

圖6 戊二醛法合成可樂定人工抗原技術路線圖

1.3 苯胺型和苯酚型β-受體激動劑二聚體人工抗原合成

大多數的人工抗原是一種半抗原偶聯一種載體蛋白，只針對一類β-受體激動劑，檢測目標也僅限于某一特定類型。多分析物免疫具有高通量、高效率和低樣品消耗等優勢，近年來多重識別特性的廣譜抗體引起學者的關注。Liu 等[23]通過重氮化將克倫特羅（苯胺型β-受體激動劑）和萊克多巴胺（苯酚型β-受體激動劑）兩種半抗原偶聯到同一載體蛋白上，制備二聚體人工抗原，達到一次試驗同時測定兩類β-受體激動劑的效果，具體合成路線見圖7。間接酶聯免疫吸附法測定的滴度結果顯示，2 只免疫新西蘭兔產生的抗血清滴度均超過1:128 000，并將多克隆抗體與銪納米顆粒結合形成探針，建立了基于銪納米顆粒的熒光側向流動免疫分析方法，可同時檢測8 種苯胺類和1 種苯酚類β-受體激動劑。

圖7 重氮化法合成克倫特羅和萊克多巴胺二聚體人工抗原技術路線圖

2 β-受體激動劑人工抗原鑒定

人工抗原合成后，需要對產物進行鑒定或表征，以判斷偶聯是否成功，通常采用紫外光譜法、電泳法、紅外光譜法和核磁共振法等進行鑒定。

2.1 紫外光譜法

由于藥物、載體蛋白及二者偶聯物的最大吸收波長不同，因此可以測定偶聯前后最大吸收波長的變化，來證實完全抗原是否偶聯成功，該方法操作簡便，常用于人工抗原鑒定。宋珊珊等[24]比較了萊克多巴胺（RAC）、BSA 和RAC-BSA 的紫外光譜圖，發現RAC、BSA 的紫外吸收峰分別在269、278 nm 處，RAC-BSA 在200～400 nm 處有特征吸收峰，且出現相應的光譜疊加現象，認為RAC 與BSA 偶聯成功。

2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳法

蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠電泳中根據分子大小不同而呈梯度分開，藥物與載體蛋白結合后分子質量發生變化，使得電泳條帶位置不同。周景明等[25]采用該方法鑒定克倫特羅人工抗原，發現BSA 及雞卵清蛋白的涌動速度比偶聯物的涌動速度快，偶聯物的電泳條帶較載體蛋白明顯滯后，說明克倫特羅與載體蛋白偶聯成功。

2.3 紅外光譜法

紅外光譜圖具有高度專屬性和特異性，根據譜圖中吸收峰的波長、強度和形狀可以判斷分子中的基團，直觀反映物質結構特征。劉紅梅等[26]從RAC-BSA 紅外光譜中看到3 294 cm-1處有氨基N-H 吸收峰，1 658 和1 538 cm-1處有酰胺吸收峰，說明含有BSA 結構；RAC-BSA 和RAC 在833 cm-1處有相似的吸收峰，而BSA 在此處無吸收，說明含有RAC 結構，據此推測RAC 和BSA偶聯成功。

2.4 核磁共振法

核磁共振氫譜可以用來確定分子結構，每種含氫化合物都有自己獨特的波譜圖，通過不同的化學位移和自旋偶合來表征化合物結構。Lommen等[27]用該方法對非諾特羅抗原進行檢測，分析氫化學位移特征，確定偶聯反應成功。非諾特羅的特征化學位移在δ= 0.95、2.43、2.60、2.77、2.82、4.41、5.95、6.52 和6.82 處，經過20 h 的反應，這些共振（除δ= 5.95）降低到原始振幅的70%，在δ= 5.95 處共振幾乎消失。該共振來自非諾特羅的雙酚側質子，其在高pH 值下與溶劑（D2O）中的氘緩慢交換，使非諾特羅共振振幅降低了30%，相當于平均30 個非諾特羅分子結合到1 個BSA分子中。于洪俠等[14]也通過核磁共振法鑒定了RAC-BSA 偶聯物。

3 展望

免疫分析法具有操作快速、靈敏度高、檢測成本低等優點，可以突破常規儀器分析的局限，在β-受體激動劑類藥物殘留檢測中得到廣泛應用。制備具有良好免疫原性的人工抗原，是免疫分析技術的基礎。反應位點、連接臂及長度、載體連接方式和偶聯比等都是影響人工抗原免疫原性的重要因素。計算機輔助藥物設計、分子模擬技術等，由于可預測半抗原與潛在免疫特性之間的關系，有助于開發性能更穩定、免疫原性更高的人工抗原，近年來極大推動了半抗原分子結構設計和合成工作，具有較大的發展潛能。