越南非洲豬瘟疫苗AVAC ASF LIVE（ASFV-G-ΔMGF）研究工作分析與思考

戈勝強，沙 洲，左媛媛，初薛霏，徐天剛，張永強，李金明，王志亮

（1. 中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；2. 青島市現代生物工程及動物疫病研究重點實驗室，山東青島 266032；3. 農業農村部動物生物安全風險預警及防控重點實驗室（南方），山東青島 266032；4. 山東農業大學，山東泰安 271018）

2023 年7 月，越南正式將非洲豬瘟（African swine fever，ASF） 弱毒疫苗NAVET-ASFVAC（ASFV-G-ΔI177L） 和AVAC ASF LIVE（ASFVG-ΔMGF）推向其全國市場，這是世界范圍內首次在一個國家全面實施ASF 疫苗防控措施。上述兩種疫苗均為引進的美國基因II 型非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）弱毒疫苗株，其中ASFV-G-ΔI177L為2020年研制的疫苗候選株，ASFV-G-ΔMGF 為2015 年研制的疫苗候選株。據越南媒體報道，NAVET-ASFVAC（ASFV-G-ΔI177L）在臨床試驗期間出現過接種豬發病死亡事件，但AVAC ASF LIVE（ASFV-G-ΔMGF）未有任何負面信息報道。相比ASFV-G-ΔI177L，ASFV-G-ΔMGF的系統研究資料相對較少，但是國內弱毒疫苗候選株HLJ/18-7GD[1]和CN2018 ΔMGF/ΔCD2v（數據未發表）中多基因家族（MGF）的敲除區域與其缺失位置相似，也可以為其提供一定研究補充資料。為此本文就越南ASFV-G-ΔMGF 疫苗種毒的核心研究數據及國內相關數據進行綜述，以期為我國相關研究及政策制定提供參考。

1 ASFV-G-ΔMGF 基因缺失株首次評價數據

2015 年，O'Donnell 等[2]根據以往自然缺失株（OURT 88/3 和E75）、細胞傳代適應株（BA71V和ASFV-G-P110） 和基因缺失株（Pr4Δ35 和MALΔSVD）的研究總結，判斷多基因（MGF）家族中的MGF360 和MGF505 蛋白編碼基因可能與病毒的毒力和復制相關，因此將基因II 型強毒株ASFV-G 基因組的27 928～35 487 bp 位置進行了人工敲除（長度7 558 bp，涉及MGF505-1R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF-14L、MGF505-2R 和MGF505-3R 等6 個蛋白編碼基因），結果發現ASFV-G-ΔMGF 毒力減弱且能誘導產生攻毒保護能力。這是第一次明確證明MGF蛋白為ASFV 的毒力決定因子，這也是第一個可對ASFV-G 產生攻毒保護的試驗性疫苗。

ASFV-G-ΔMGF 在細胞上的繁殖能力與其母本強毒株相似，不同劑量接種（102、104HAD50，肌肉注射，每組10 只）后，28 d 觀察期內無任何臨床異常表現。ASFV-G-ΔMGF 接種后會在血液中檢測到病毒，且病毒滴度與接種劑量呈一定正相關，但不同接種豬存在一定差異。102H A D50接種組的病毒血癥檢測結果顯示：3 頭接近臨界值（101.8HAD50/mL），6 頭為中等滴度（1 02～4H A D50/m L），1 頭滴度較高（105HAD50/mL），但在攻毒前所有血樣中均已檢測不到病毒。104HAD50接種組的病毒血癥滴度普遍高于1 02HAD50接種組，其中4 頭高于1 04HAD50/mL，6 頭最大滴度區間為103～104HAD50/mL。攻毒前，6 頭已轉為陰性，但仍有4 頭滴度為102～103HAD50/mL。

免疫豬攻毒（ASFV-G，103HAD50，肌肉注射）后，21 d 觀察期內，所有豬只均存活。但體溫監測結果顯示，102HAD50接種組有3 頭，104HAD50接種組有4 頭體溫一過性升高。攻毒后第4 天或第7 天的病毒血癥監測顯示，102HAD50接種組中，3頭檢測為陰性，6 頭滴度區間為102～103HAD50/mL，1 頭為104.55HAD50/mL。利用建立的疫苗株和攻毒株鑒別PCR 方法檢測，結果3 頭同時檢出疫苗株和攻毒株，5 頭檢測出疫苗株。104HAD50接種組中，3頭檢測為陰性，4 頭滴度區間為102～104HAD50/mL，3 頭滴度區間為104～107HAD50/mL（最高為106.12HAD50/mL）。鑒別PCR 檢測結果顯示，4 頭同時檢出疫苗株和攻毒株，剩余6 頭均檢測出疫苗株。以上數據說明，雖然ASFV-G-ΔMGF 免疫后可以保護豬只抵御強毒株攻擊，但在30%～40%的豬體中仍能檢測到強毒株感染，此外在出現一過性體溫升高的接種豬中大多數（6/7）能檢測到強毒株核酸。以上試驗數據說明，使用ASFV-G-ΔMGF作為減毒活疫苗仍存在一定安全風險，需要進一步評估其接種動物導致慢性病發展的長期影響。2020 年Chen 等[1]對構建的多種ASFV 基因缺失株HLJ/18-6GD（刪除編碼MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L 和MGF360-14L 蛋白的基因）進行了安全性評價。雖然HLJ/18-6GD 與ASFV-G-ΔMGF 兩個毒株使用的母本種毒不同，后者構建使用的種毒是格魯吉亞分離株（ASFV-G），前者構建使用的種毒是黑龍江2018 年分離株（HLJ/18），但這兩個種毒均為基因II 型強毒株，序列高度相似。因此，HLJ/18-6GD 的相關研究數據可以為ASFV-G-ΔMGF 提供一定參考（表1）。HLJ/18-6GD 接種豬后（103和105TCID50，肌肉注射），21 d 觀察期內無體溫及臨床異常表現，表明其具備良好安全性。攻毒后HLJ/18-6GD 接種豬觀察期內均存活，但其心、肺、脾、扁桃體、胸腺和5 個淋巴結（腸淋巴結、腹股溝淋巴結、頜下淋巴結、支氣管淋巴結和胃肝淋巴結）可檢測出不同拷貝數病毒，表明該缺失株具備一定功效。

表1 ASFV-G-ΔMGF 和HLJ/18-6GD 疫苗株首次評價相關數據資料

表2 ASFV-G-ΔMG 和HLJ/18-6GD 疫苗株毒力返強試驗相關數據資料

2 二次接種及傳代細胞培養株驗證

為進一步評價ASFV-G-ΔMGF 的安全性和有效性，受碩騰公司（Zoetis）委托和資助，德國弗里德里?！だ辗蚶昭芯吭海‵riedrich-Loeffler-Institut，FLI）開展了對該毒株的相關評價[3-4]。此次試驗共設置了2 組研究，分別使用了2 種細胞擴繁種毒，A 組使用的是外周血單核細胞（PBMC），B組使用的是一種商品化傳代細胞系（背景不詳，由碩騰公司提供）。A 組和B 組均進行了2 次肌肉注射接種（間隔3 周），每組5 頭豬，A 組接種劑量為104HAD50，B 組為103HAD50。兩組豬接種后均表現正常，只有1 頭豬（B 組）在第12 天時體溫升至40.5 ℃但很快恢復。病毒血癥監測結果顯示：A 組接種后有2 頭豬出現病毒血癥，基因拷貝數分別為2.8×100copies/5 μL（第7 天）和2.0×102copies/5 μL（第21 天）；B 組接種后有2 頭豬出現低拷貝病毒血癥，基因拷貝數分別為3.5×100copies/5 μL（第7 天）和1.0×100copies/5 μL（第14 天）。

2 次免疫后（第42 天），兩組均使用基因II型Armenia 2008 強毒株進行口鼻腔攻毒（鼻腔接種0.5 mL，口腔接種1.0 mL）。后經重新滴度評估，A 組接種滴度約為104HAD50，B 組約為105HAD50。兩組攻毒后，在28 d 觀察期內均沒有任何體溫和臨床異常表現。排毒/帶毒檢測結果顯示，A 組拭子全部為陰性，但有2 頭豬出現病毒血癥，基因拷貝數分別為2.0×10-1copies/5 μL（攻毒后第4 天）和3.7×10-1/3.2×10-2copies/5 μL（攻毒后第10/14 天），最終只有1 頭豬的剖解組織樣本檢測為陽性，分別為肺臟（1.1×100copies/5 μL）和腘淋巴結（8.7×101copies/5 μL）。相反，B 組所有拭子、血樣和組織樣本全部為陰性。病理觀察結果顯示：A 組中除有1 頭豬存在輕度肺實變，腎臟與胃肝淋巴結變暗變紅外，其余豬只沒有任何病理形態學異常；B 組中除有3 頭豬的氣管、支氣管、腎臟和胃肝淋巴結變暗變紅外，其余臟器和豬只沒有任何表觀異常。以上數據說明：2 次免疫后攻毒，90%的豬（9/10）在試驗結束時已無法從組織和血液中檢測到疫苗株和攻毒株；使用商品化傳代細胞系繁殖的種毒（B 組）與使用外周血單核細胞繁殖的種毒（A 組）在動物試驗評價中差異不顯著。比較之前單次接種的動物試驗數據[2]，2 次免疫接種可以進一步減少病毒血癥，效果更好。

3 野豬口服接種評價

為評價ASFV-G-ΔMGF 作為野豬口服疫苗的可能性，碩騰公司聯合德國FLI 進行了野豬口服接種的免疫攻毒評價。研究[3]發現：8 頭6 月齡野豬口腔接種ASFV-G-ΔMGF（105HAD50）后，28 d 觀察期內無任何臨床異常表現；病毒血癥監測結果顯示，在第21 天有3 頭豬檢測為陽性，基因拷貝數分別為9.7×101、3.3×101和1.2×100copies/5 μL。

疫苗接種后第28 天，使用基因II 型Germany 2020 強毒株進行口鼻接種攻毒（鼻腔接種0.5 mL，口腔接種1.0 mL，104HAD50），結果有2 頭豬自第5 天時出現食欲減退和活動減少，并最終分別在第8 天和第9 天死亡。另有3 頭豬雖然在第5 天和第9 天出現了輕微的食欲和活動減少，但最終都恢復正常。排毒/帶毒檢測結果顯示，攻毒后第21天有3 頭豬的血液樣品檢測為陽性，2 頭死亡豬的所有臟器檢測均為強陽性（高達105gc），3 頭豬的個別組織/淋巴結檢測為弱陽性（小于10 gc），3 頭豬的組織樣品檢測為陰性。病理觀察結果顯示，2 頭死亡豬病變較重，出現漿液性腹膜炎和胸腔積液，脾臟腫大，腎臟、各種淋巴結和胃腸道輕度至重度出血等。剩下的6 頭豬表現非常輕微的病變，包括肝、胃和腎淋巴結變紅，其中3 頭豬的脾臟表現輕度至中度腫大、易碎等。該試驗發現，口服免疫接種后并非所有豬都能產生抗體（第21 天轉陽率為50%），較明顯的趨勢是但凡產生抗體的豬都能產生攻毒保護能力。有趣的是，有2 頭抗體陰性豬也最終抵御了強毒株攻擊，其原因可能是，豬只之間的個體差異，Germany 2020 或有一定毒力減弱，或免疫接種誘導產生了一定保護等。

綜上所述，1 次單劑量口服接種至少可以使50%的野豬產生攻毒保護能力，但不可否認，可能由于病毒攝入的差異，口鼻接種存在一定的不確定性，而動物的行為、唾液中的蛋白酶水平以及黏膜的易感性等都可能存在差異，進而導致整個試驗系統/數據出現偏差。

4 毒力返強評價

根據獸醫產品注冊技術要求國際合作準則中關于毒力返強的試驗要求（歐盟文件EMA/CVMP/VICH/1052/2004）[6]，德國FLI 開展了該毒株的毒力返強相關評價[5]。該試驗將疫苗種毒在豬體內連續傳5 代（每組10 頭豬，肌肉注射）。第1 代接種劑量為1.75×106HAD50/mL，接種后第7 天（據之前試驗數據，此時的病毒含量最高[3]）測定血液和組織中的病毒含量，將最高滴度的組織懸浮液接種第2 代，后面以此類推。經計算，第1 代至第4代制備的組織懸浮液（等同于第2 代至第5 代的病毒接種液）的滴度分別為104.25、102.25、104.00和105.75HAD50/mL。臨床觀察數據顯示：第1 代接種豬無發熱及臨床異常；第2 代接種豬有3 頭豬出現了一過性體溫升高，體溫最高為40.4 ℃；從第3代開始，有接種豬出現最高42.1 ℃的高燒（接種后第5 天和第6 天）；第5 代時，10 頭接種豬中有9 頭出現過41 ℃的體溫（部分持續超過1 d），伴隨著體溫升高，部分豬只還出現了輕度至中度的食欲和精神不振等。雖然有體溫升高，但最終所有豬只均恢復正常。在第5 代的21 d 觀察期結束時，所有豬只在臨床上是健康的，但其中1 頭豬（21 號）在接種后立即出現了右前腿感覺和運動功能完全喪失。經地塞米松治療無效后，出于倫理考慮，該豬只在第7 天時被實施安樂死。病理檢測結果顯示，第1 代到第5 代的豬均能檢測到極少的病變，即淋巴結輕微腫大和肺實變等，但將病變與傳代次數進行分析時，未發現相關性及差異。以上數據說明，隨著傳代次數增加，病毒似乎有毒力變強跡象，但并不十分明顯。

每一代接種豬第7 天剖殺的組織樣品（脾臟、扁桃體、肺臟、淋巴結和血液等）病毒載量檢測結果顯示：第1 代接種豬的組織病毒拷貝數均小于7.2×101copies/5 μL，其中還有2 頭豬未檢測到病毒核酸；第2 代接種豬的組織病毒拷貝數均小于7.2×101copies/5 μL，其中還有5 頭豬未檢測到病毒核酸；從第3 代開始，每頭豬的組織樣品中至少有1 份檢測為陽性，最高拷貝數可達1.8×103copies/5 μL；到第4 代時，所有樣品均檢測為陽性，最大拷貝數為2.6×103copies/5 μL；最后在第5 代時，所有樣品均檢測為陽性，血液滴度與第4 代相似，但組織中的拷貝數略低于第4 代（第21 天剖解），其中在第7 天被實施安樂死的21 號豬拷貝數最大，達2.6×103copies/5 μL。以上數據說明，隨著傳代次數增加，病毒感染程度有變強跡象，但這也可能是由接種劑量增大導致的。

對各代次代表樣品進行病毒全基因測序，結果在第4 代的2 個樣品中發現了1 個基因組5'末端出現大范圍基因缺失的變異株（命名為ΔMGFnV）。ΔMGFnV 除缺失11 197 bp（涉及18 個基因）外，還在基因組3' 端出現了1 個18 592 bp 的重復序列。該重復序列以反向互補方向與5'端結合，導致29 個基因重復。隨后進一步對所有樣品進行復檢，結果發現該變異株在第1 代接種豬（1081 號）中就已出現，該變異株與原始種毒混合存在；第2 代接種豬中，有2 頭豬感染ΔMGFnV，其中1 頭是混合感染；第3 代和第4 代所有接種豬均感染ΔMGFnV，且每代次均有9 頭豬是混合感染；至第5 代時，4 頭豬單一感染ΔMGFnV，6 頭豬同時感染ΔMGFnV 和原始種毒。以上數據說明，ΔMGFnV 在出現變異后的混合連續傳代過程中，感染比例逐步增加，呈現出更強的復制能力。雖然第5 代接種豬中，單獨感染ΔMGFnV 的豬和混合感染的豬沒有臨床差異，但第5 代接種豬體溫普遍上升等情況的出現可能與ΔMGFnV 有關。Chen 等[1]的毒力返強試驗顯示：對6 頭豬接種HLJ/18-6GD（107TCID50，肌肉注射）第1 代后，體溫正常，但有4 頭豬血液帶毒（滴度最高為6.1 log10），1 頭豬脾臟帶毒；第2～6 代均使用上一接種代次的帶毒血液進行接種（第2～5 代接種3 頭豬，第6 代接種5 頭豬），結果自第2 代開始，血液和組織的帶毒比例和滴度逐漸升高，第5 和第6 代時，絕大多數評價組織（心臟、肝臟、脾臟腎臟、扁桃體和胸腺等）和淋巴結（腸、腹股溝、頜下、支氣管和胃肝淋巴結）均已帶毒，病毒血癥滴度最高達9.4 log10，且最終每組均有1 頭豬死亡。以上數據說明，HLJ/18-6GD 有毒力返強風險。

5 小結

AVAC ASF LIVE（ASFV-G-ΔMGF）使用的細胞系為DMAC（Diep's Macrophage cell）。該細胞系是一種永生化的傳代細胞系（具體背景不詳）。AVAC ASF LIVE 在越南的成功上市，首次將ASFV 傳代細胞系適應株應用于臨床研究，這對于ASF 疫苗研究具有重要意義。相比原代細胞培養的疫苗候選株（如ASFV-G-ΔI177L、HLJ/18-7GD、CN2018 ΔMGF/ΔCD2v 和CN2018-LVR等），傳代細胞培養的疫苗候選株批次之間差異可能更小，細胞質控可能更便捷，這使得AVAC ASF LIVE（ASFV-G-ΔMGF）具有更可靠的生產優勢。但結合現有的種毒試驗數據（原代細胞培養、傳代細胞培養、相似種毒且缺失基因相似）分析，ASFV-G-ΔMGF 似乎優勢并不明顯，特別是ASFVG-ΔMGF 接種后未能清除強毒株感染，且毒力返強數據并不理想。國內研究證明，與ASFV-G-ΔMGF類似的HLJ/18-7GD（分別刪除編碼MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L 和CD2v 蛋白的基因）對妊娠母豬具備良好的安全性[1]。但與ASFV-GΔI177L相似，ASFV-G-ΔMGF仍缺乏很多研究數據，如是否能發生垂直傳播、基因重組，以及基因I 型的交叉保護能力等。這使得大規模應用后不確定性事件仍有可能發生，因此仍需進行嚴密監測評估，不斷優化毒株工藝（如2 次免疫等），以最大化發揮弱毒疫苗的功效。