不同品牌膠體金免疫層析試紙條/卡檢測牛羊布魯氏菌病的效果分析

汪洪冰，郭永祥，張朝陽，黃建龍，張 坤，林 源

（湖南省動物疫病預防控制中心，湖南長沙 410014）

布魯氏菌?。╞rucellosis，以下簡稱布?。┦怯刹剪斒暇鷮偌毦腥緦е碌娜双F共患傳染病，在世界范圍內嚴重威脅人類健康并影響畜牧業發展[1]。血清學診斷是布病初篩和確診的主要臨床診斷方法。國家標準《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T 18646—2018）和世界動物衛生組織（WOAH）推薦的布病血清學診斷方法主要有虎紅平板凝集試驗（RBPT）、試管凝集試驗（SAT）、補體結合試驗（CFT）及酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等。然而近些年，膠體金免疫層析技術作為一種新型快速發展的免疫學檢測技術，因其成本低廉、檢測速度快、操作簡便、特異性強、靈敏度高、結果可靠，無需特殊儀器設備等優點[2-4]，已被廣泛應用于動物病毒、細菌等病原檢測，并已成為獸醫臨床診斷動物疫病最簡單、快速、敏感、特異的免疫學檢測技術之一。盡管早期已有相關研究將此技術與其他布魯氏菌檢測方法進行了比較，但同時運用不同品牌膠體金免疫層析試紙條/卡（簡稱試紙條/卡）檢測牛羊布魯氏菌的報道較少見。本研究為比較不同品牌試紙條/卡檢測性能，利用抗體布魯氏菌陰陽性血清，對6 種試紙條/卡的準確性及敏感性進行驗證，并對經RBPT 初篩和競爭酶聯免疫吸附試驗（cELISA）復核的臨床血清樣品進行檢測比對，以期為利用試紙條/卡進行布魯氏菌快速檢測提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

布魯氏菌企業標準陰性血清和陽性血清（以下簡稱標準陰陽性血清），批號50042308，有效期至2023 年12 月14 日，購自青島立見生物科技有限公司；臨床血清樣品，來自某實驗室，其中羊血清34 份（陰陽各17 份）、牛血清44 份（陰陽各22 份）。所有血清樣品均已按GB/T 18646—2018 標準完成了RBPT 初篩和cELISA 復核，無明顯溶血等情況。

1.2 試劑

在有效期內的6 個品牌（A—F）試紙條/卡，購自湖南省政府采購電子賣場某供應商。

1.3 方法

1.3.1 準確性比較 直接選取標準陰陽性血清，按試紙條/卡使用說明書進行檢測，每種試紙條/卡重復檢測3 次，以了解不同品牌試紙條/卡對標準陰陽性血清檢測的準確性。

1.3.2 檢出限試驗 將標準陽性血清按比例依次稀釋到1:256，選擇不同稀釋倍數陽性血清，按試紙條/卡使用說明書進行檢測，以了解試紙條/卡對陽性血清檢測的靈敏度。

1.3.3 臨床樣品檢測 選取經RBPT 初篩和cELISA 復核的臨床血清樣品，分羊、牛不同畜種，按試紙條/卡使用說明書對臨床血清樣品進行檢測，以了解不同品牌試紙條/卡對臨床樣品的檢測效果。

2 結果與分析

2.1 準確性

經3 次重復檢測，各試紙條/卡對標準陰陽性血清的檢出率均為100%，表明各品牌試紙條/卡的檢測準確率高，穩定性好。

2.2 靈敏度

如表1 所示：各試紙條/卡對不同倍比稀釋的標準陽性血清檢測結果不同，C、D 試紙條/卡敏感性最高，對1:2～1:256 不同倍比稀釋的陽性血清檢出率均為100%；B 試紙條/卡敏感性一般，對1:2～1:16 不同倍比稀釋的陽性血清檢出率為100%；A、F 試紙條/卡敏感性較差，僅能檢出1:2～1:4 低倍比稀釋的陽性血清；E 試紙條/卡敏感性和穩定性相比最差。

表1 不同品牌試紙條/卡對不同倍比稀釋標準陽性血清樣品的檢測結果

2.3 臨床血清樣品檢測

如表2、3 所示：各試紙條/卡對臨床陰性血清樣品的檢測準確率均為100%。對臨床羊陽性血清樣品的檢測結果差異較大，其中B 試紙條/卡陽性檢出率最高（70.59%），其次為F 試紙條/卡陽性檢出率（64.71%），A 試紙條/卡陽性檢出率最低（5.88%）；對臨床牛陽性血清樣品的檢測結果整體優于羊陽性血清樣品，但不同試紙條/卡的檢測結果仍然存在差異，E、F 試紙條/卡陽性檢出率最高（100%），其次為A、D 試紙條/卡（68.18%），B、C 試紙條/卡最低（50.00%）。

表2 不同品牌試紙條/卡對臨床羊血清樣品的檢測結果

表3 不同品牌試紙條/卡對臨床牛血清樣品的檢測結果

3 討論

膠體金免疫層析法是將膠體金標記技術、免疫檢測技術和蛋白層析技術相結合的以硝酸纖維膜為載體的固相膜免疫分析技術[5]，具有簡便、省時、樣本用量少、結果易判讀等特點，常在資源匱乏或非實驗室環境中進行目標物的定性、半定量和定量檢測。應用范圍包括生物醫學中的病原體、藥物、激素和代謝物檢測，植物檢疫，獸醫、飼料/食品和環境指標的測試。2019 年，國家衛生健康委員會發布《布魯氏菌病診斷》（WS269—2019），新增了膠體金免疫層析法診斷布病的參考標準，并將其作為布病初篩試驗之一。在動物疾病的臨床檢測及防控上，膠體金免疫層析技術近年來也有大量的創新和應用，新材料、新儀器和新技術的發展給膠體金免疫層析技術帶來更多可能[6]。全國動物衛生標準化技術委員會對《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T 18648—2018）進行修訂立項，在新修訂的征求意見稿[7]中將免疫層析抗體檢測方法列入布病的免疫學診斷方法。這預示著膠體金免疫層析技術在布病診斷上將發揮越來越重要的作用。

在早期報道中，有研究者對膠體金免疫層析法與其他布病診斷方法進行了比較[8-13]，也有用膠體金免疫層析法橫向比較牛/羊血清樣品檢測效果的研究[14-16]，結果均顯示膠體金免疫層析法具有較高的特異性和敏感性，適應于布病初篩。本研究發現不同品牌試紙條/卡對企業提供的標準布魯氏菌陰陽性血清均敏感，但檢出限并不一致，這說明即使是同一種檢測方法，不同試紙條/卡的檢測結果也存在差異。同時，應用同一品牌試紙條/卡分別檢測牛羊陽性血清時，其檢測結果也不相同。B 試紙條/卡對臨床羊陽性血清樣品的檢出率達70.59%，對臨床牛陽性血清樣品的檢出率僅為50%；A 試紙條/卡對臨床羊陽性血清樣品檢出率僅為5.88%，但對臨床牛陽性血清樣品的檢出率卻達68.18%；E、F 試紙條/卡對臨床羊陽性血清樣品的平均檢出率為61.76%，但對臨床牛陽性血清樣品卻100%檢出。這與劉麗婭等[16]在對布病不同初篩方法及診斷試劑檢測差異性分析時所發現的“應用同一方法，采用不同試劑結果存有差異；應用同廠家試劑，檢測牛、羊血清，敏感及特異性結果也有不同”，具有相似性。準確檢疫和快速診斷是預防和控制布病的關鍵。在開展布病凈化時，建議先通過動物布病國家標準診斷技術與試紙條/卡進行效果比對，根據對比結果選擇敏感性較好、準確性較高的商品化試紙條/卡用于快速檢測和現場診斷。但初篩完成后，仍需用敏感性、特異性均好的其他檢測方法進行復檢，確保檢測結果的準確性。

膠體金免疫層析法是根據待測物與相應抗體劑量-反應曲線進行定性和定量檢測的，因此為了得到準確結果，必須有相對于待測物的過量抗體，包括捕獲抗體和金標抗體（免疫膠體金）[17-19]。有文獻[12]報道布魯氏菌抗原間交叉反應，類風濕因子、嗜異性抗體等內源性干擾物質，標本凝固不全便開始離心，血清中殘留的纖維蛋白原粘附硝酸纖維素膜（NC 膜）等外源性因素，以及試紙條/卡本身質量問題、溶血、乳糜血等原因，均可對膠體金檢測結果造成干擾。因此選擇高質量試紙條/卡的同時，規范的樣品采集、預處理方法，合適的分析物濃度等對提高檢測靈敏度至關重要[20]。本研究發現不同品牌試紙條/卡對臨床陽性血清樣品的檢測結果差異性較大，這可能與各品牌試紙條/卡在生產過程中膠體金顆粒大小的均勻度、濃度，抗原抗體比例，以及NC 膜、金標墊等材料質量密切相關[21]。同時，本研究也發現不同品牌試紙條/卡對標準陽性血清、臨床陽性血清樣品的檢測結果差異較大，這可能與標準陰陽性血清制備以及檢驗的程序化、制度化密切相關，相比臨床陰陽性血清，標準陰陽性血清的均勻性、穩定性優勢更加明顯。建議各相關生產廠家應建立統一的產品標準生產程序和判讀標準，從膠體金、抗體等原料的質量，膜材的處理，到試紙的組裝、儲存等加強品控管理，確保生產出特異、靈敏且經濟實惠的試紙條/卡，以利于生產實際中布病的初步檢測和大批量篩查[16]。

檢測結果除與試紙條/卡產品質量參差不齊有關外，還可能與采樣動物的健康狀況、近期飼料添加劑及藥品使用情況，染疫動物體內抗體消長變化情況，以及臨床樣品的前期處理和檢測時的環境溫度、試劑溫度、樣品溫度、判讀時間和加樣量等具有一定相關性[19]。在獸醫臨床快速檢測和現場診斷中，建議詳實了解采樣動物飼養背景、健康狀況，采用規范的采樣方法和血液樣品預處理方法，嚴格對照試紙條/卡產品說明進行檢測操作，以便充分發揮膠體金免疫層析檢測的優勢。