羊肚菌菌種不同保藏方法保藏效果比較

查 波 王文麗 余文娟 崔文浩*

（1 衢州市農業林業科學研究院，浙江衢州 324003；2 江山市長臺鎮經濟生態辦公室，浙江衢州 324003；3 開化縣楊林鎮農業農村辦公室，浙江衢州 324003）

截至2022年，浙江省衢州市羊肚菌栽培面積達113.33 hm2，產業規模位居浙江省前列。但當地生產用菌種仍然為從四川省、山東省引進的母種或原種，再由本地農戶擴繁為栽培種。羊肚菌菌種在保藏、流通環節極易發生老化退化現象[1-2]，存在減產或絕收的風險。因此如何保藏羊肚菌菌種以維持其活力成為衢州市羊肚菌產業升級的主要目標。

研究表明：目前業界普遍采用的食用菌菌種保藏技術中，液氮超低溫保藏法、冷凍干燥法保藏真菌有很好的效果[3-4]，但需要專業設備，購買和使用成本高，一般菌種廠難以負擔。為此試驗選擇幾種低溫保藏技術[5-6]，結合羊肚菌的特點選擇干子實體作為菌種保藏試驗對象[7]，研究各保藏方法對羊肚菌菌種活力、菌絲生長速度及產量等的影響，通過比較分析從中篩選出簡便、經濟、能有效保持菌種質量的羊肚菌菌種保藏方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）供試菌株。六妹羊肚菌M.sextelata栽培菌株，由四川菌益儂農業科技有限公司提供。

（2）培養基及試劑。母種培養基為馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養基（PDA）：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL。原種、栽培種培養基均為小麥60%、木屑30%、腐殖土7%、石膏1.5%、石灰1.5%。礦物油（bioMerieux，SA生產），用前將礦物油裝入錐形瓶中，放入高壓滅菌鍋滅菌25 min，靜置沉淀3～5 d，60 ℃烘烤12 h，等內部水分蒸發后，冷卻備用。無菌蒸餾水，將去離子水裝入錐形瓶中，放入高壓滅菌鍋滅菌25 min，冷卻備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 母種制備

1.2.1.1 組織分離

采收菌蓋未完全展開的幼嫩羊肚菌，確保子實體內部與外界無接觸。在無菌環境下，用75%醫用酒精消毒子實體表面，切開子實體，挑取菌蓋和菌柄相連處的內部菌肉，接入PDA平板，置于20 ℃培養室避光培養。

1.2.1.2 菌種純化

接種塊菌絲萌發后，挑取菌落尖端轉接到空白PDA平板，12～24 h后觀察菌絲形態，若菌絲為無色、細長、根根分明，可確定為羊肚菌母種。

1.2.2 5種羊肚菌菌種保藏方法

方法1：斜面保藏。無菌環境下將母種接種至斜面培養基上，用硅膠塞封口，置于20 ℃培養室避光培養。菌絲即將長滿斜面時，及時轉移到4 ℃冰箱內保藏。

方法2：蒸餾水保藏。用6 mm打孔器在母種平板上取菌塊3～5塊，置于2 mL無菌凍存管中，加入1 mL無菌蒸餾水淹沒菌塊。蓋緊蓋子，用封口膜封口后，轉移到4 ℃冰箱內保藏。

方法3：礦物油保藏。用6 mm打孔器在母種平板上取菌塊3～5塊，置于2 mL無菌凍存管中，加入1 mL礦物油淹沒菌塊。蓋緊蓋子，用封口膜封口后，轉移到4 ℃冰箱內保藏。

方法4：烘干子實體保藏。選擇商品性好的羊肚菌子實體，采取熱風烘干。初期溫度設定為35 ℃，烘3～4 h；中期按每小時升溫2～3 ℃達50 ℃，烘4～5 h；最后溫度上升至53～55 ℃，烘3～4 h。待子實體含水量下降至10%，完成烘烤。用密封袋將羊肚菌干菇密封，保藏于陰涼、干燥的環境中。

方法5：風干子實體保藏。陰涼干燥環境下，選擇商品性狀好的羊肚菌子實體放在竹篩上，用吹風機吹5～7 d，等子實體收縮固定，含水量下降至10%后完成風干。用密封袋將干菇密封保藏。

1.2.3 菌種活化

1.2.3.1 方法1、2、3保藏的羊肚菌菌種的活化

無菌條件下接種至PDA平板中，于20 ℃避光培養。接種塊菌絲萌發后，挑取菌落尖端轉接到空白PDA平板培養基，觀察菌絲形態。

1.2.3.2 方法4、5羊肚菌干子實體的活化

用無菌風吹30 min，放入無菌水中浸泡1 h。取出后用無菌吸水紙吸干表面水分，放入75%酒精中浸泡1 min后取出，蒸餾水漂洗2遍，吸干表面水分。用解剖刀切取0.5 cm×0.5 cm的菌塊，接種至空白平板上，于20 ℃避光培養。接種塊菌絲萌發后，挑取菌落尖端轉接到空白PDA平板培養基培養，觀察菌絲形態。

1.2.4 菌種菌絲生長速度測定

將活化后的羊肚菌菌種轉接至空白PDA平板后，觀察并記錄其萌發率，測定計算菌絲長速。菌絲長速以平板中羊肚菌菌絲直徑增長量除2再除以菌絲生長用時。每個處理重復3次。

待羊肚菌菌絲長滿平板后，用12 mm打孔器取菌塊5塊，接種至原種培養袋內，待菌絲長至培養袋約三分之一時，劃線測定菌絲生長量。菌絲長速以栽培袋菌絲生長量除以菌絲生長用時。每個處理重復3次。

1.2.5 出菇試驗

于衢州市農業林業科學研究院東湖基地進行栽培試驗。

11月初，翻耕基地單體大棚內土壤，耙平做畦。畦寬1 m，畦間溝寬50 cm，以畦面長度6 m為一個小區。2022年11月18日，待羊肚菌菌絲長滿栽培種栽培袋后，每個處理隨機播種3個小區，共播種15個小區。按照大田栽培模式進行出菇管理。統計每小區的羊肚菌產量、單菇質量、折干率等。

1.2.6 數據分析

數據用WPS進行記錄和差異性分析。

2 結果與分析

2.1 不同保藏方法保藏菌種轉接培養結果

試驗分別在6月28日（保藏 3個月）、9月28日（保藏6個月）取出菌種，活化后轉接至空白母種培養基中觀察菌絲生長速度。由圖1可見，5種保藏方法的菌種萌發率均為100%，但保藏6個月菌種間菌絲生長速度有差異。由表1可知，保藏3個月后，方法4的菌絲生長速度顯著快于方法1，其他處理菌絲生長速度無顯著性差異；保藏6個月后，方法1、2、3的菌絲生長速度均顯著慢于3個月前，方法5的菌絲生長速度沒有顯著變化，方法4的菌絲生長速度最快（圖1），與方法1、2、3、5有顯著差異，且顯著快于保藏3個月的菌種。

圖1 5種保藏方法保藏羊肚菌菌種6個月后轉接PDA平板后萌發狀態

表1 不同保藏方法保藏菌種轉接培養結果

2.2 不同保藏方法保藏菌種轉接原種培養效果

觀察結果，5種保藏方法保藏菌種轉接原種培養基后均能萌發。菌絲生長速度的測定結果由表2可知，菌種保藏3個月轉接原種培養基后，原種菌絲生長速度5種方法間無顯著差異；菌種保藏6個月，方法1、2、3、5的原種菌絲生長速度均顯著慢于保藏3個月，方法4無顯著變化。5種保藏方法中，方法4的菌絲生長速度最快，且與方法1、2、3、5有顯著差異。方法3的菌絲生長速度最慢，且與方法4、5有顯著差異。

表2 不同保藏方法保藏菌種轉接原種培養基后培養結果

2.3 不同保藏方法保藏的羊肚菌菌種出菇試驗結果

由表3可知，應用方法4保藏的菌種現原基最早，方法1保藏的菌種原基形成最晚（圖2）；應用方法1保藏的菌種產量最低，為138 g（/6 m2）。由圖2可見，應用方法2、3保藏的菌種畦面能形成大量的原基，但大部分原基枯萎死亡，不形成子實體，產量低。應用方法4保藏的菌種產量最高，為2 711 g（/6 m2），顯著高于其他保藏方法的菌種。應用方法3保藏的菌種單菇質量最大，但主要是畸形菇，經濟性狀差。應用方法4、5保藏的菌種鮮菇折干率較高，均為15.77%。

圖2 5種保藏方法保藏的羊肚菌菌種播種65 d后原基形成情況

表3 不同保藏方法菌種出菇試驗結果

3 小結與討論

試驗結果表明，PDA斜面保藏菌種方法方便簡單，但當該方法保藏菌種超過6個月時，轉接后菌絲生長速度出現明顯下降，鮮菇產量、單菇質量和折干率最低。說明此時羊肚菌菌種失去活力，不宜用于生產。推測原因是羊肚菌菌絲在4 ℃條件下仍然能緩慢生長，超過3個月后易發生老化退化現象。

方法2、方法3利用蒸餾水和礦物油隔離菌種和空氣接觸，創造缺氧環境，降低菌種代謝活動。礦物油保藏的菌種活化培養菌絲生長速度最低，可能是礦物油對菌種萌發有影響。兩種方法保藏的羊肚菌菌種出菇試驗中均表現羊肚菌子實體經濟性狀差，說明蒸餾水、礦物油不宜用于長期保藏羊肚菌菌種。

烘干后羊肚菌子實體保藏6個月后，組織分離活化培養，菌絲生長速度較保藏3個月有所加快。從出菇試驗看，現原基早，小區產量、折干率最高?？梢?，烘干法能有效保持羊肚菌活力，可用于羊肚菌菌種的較長期保藏。