線粒體tRNA-Lys(T7719G)基因變異對綿羊卵巢顆粒細胞生理功能的影響

呂世琪，馬曉菲，周榮艷，陳曉勇

(河北農業大學動物科技學院，河北 保定 071000)

顆粒細胞是卵泡的重要組成成分，可分泌多種卵泡發育所需的因子調控卵母細胞的生長、分化、成熟和閉鎖。顆粒細胞的存活與否、存活狀況能夠直接影響卵泡的發育過程和是否正常發生閉鎖反應。綿羊一生中大約有106個卵泡，而大部分的卵泡會在體內發生閉鎖，喪失排卵和激素釋放功能[1]。引起卵泡閉鎖的主要原因是顆粒細胞的凋亡[2]。顆粒細胞凋亡涉及到內質網、死亡受體和線粒體三個途徑，但主要是由線粒體途徑導致的，半胱氨酸蛋白酶家族(caspase家族)是線粒體凋亡途徑的最后執行者，在細胞中以非活性狀態存在，直到細胞凋亡被觸發[3]。線粒體會釋放多種蛋白質，比如細胞色素C從而誘導細胞凋亡，這一途徑會導致細胞損傷。研究表明，在赤霉烯酮的作用下，雞原代顆粒細胞中的PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活，自噬水平升高，促進細胞色素C的產生及釋放，進一步誘發細胞中線粒體為主導的細胞凋亡啟動，最終導致雞顆粒細胞凋亡[4]。

線粒體是為細胞生存提供能量的動態細胞器。線粒體的融合和分裂在正常情況下保持動態平衡[5]。Drp1和Mfn2作為線粒體融合和分裂必需蛋白質，已有研究表明，Drp1下調或Mfn2上調均會抑制線粒體通透性轉化膜的開放，導致線粒體膜電位降低，甚至細胞壞死及凋亡[6]。線粒體為細胞正常功能運轉提供能量供應，其功能下降直接導致卵巢顆粒細胞功能降低，進而降低卵母細胞質量，引起卵巢儲備功能減退[7]。研究表明mtDNA突變、缺失或功能障礙可對卵母細胞成熟、受精及胚胎發育過程造成不良影響[8-9]。

本團隊前期研究發現線粒體基因組tRNA-Lys7 719位點存在T→G變異(T7719G)，該變異與綿羊產羔數相關[10]，顆粒細胞與卵泡關系密切，且對于卵泡的生長發育非常重要，tRNA-Lys(T7719G)變異是否影響顆粒細胞生理功能未見報道。為此，本試驗以該基因變異對綿羊顆粒細胞生理功能的影響開展研究，為線粒體基因變異與顆粒細胞功能相關研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物及樣品采集

綿羊卵巢材料來源于河北省保定市唐縣屠宰場。屠宰后取卵巢組織用溫生理鹽水沖洗后，置于含有1%雙抗和37 ℃生理鹽水的保溫壺中，在4 h內送至實驗室。

1.1.2 主要試劑與耗材

組織基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；Annexin V-FITC雙染細胞凋亡檢測試劑盒，江蘇凱基生物技術股份有限公司；2×TaqPCR Master Mix，北京博邁德基因技術有限公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；線粒體分離試劑盒，AngleGene公司；BCA蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.3 引物設計

參考NCBI中GenBank綿羊線粒體基因組序列(AF010406.1)，利用Primer Premier 6設計覆蓋綿羊線粒體tRNA-Lys序列引物，該引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。上游引物序列為：5′-CTACGGTCAATGCTCAGAA-3′ ；下游引物序列為：5′-GTTGTGGTAGAAGTTGTGTT-3′。引物擴增產物大小為290 bp。

1.2 試驗方法

1.2.1 卵巢組織提取DNA

按照組織基因組DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取，通過紫外分光光度計測定DNA樣品在260 nm、280 nm處的OD值，計算DNA含量和OD260/OD280的比值，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。

1.2.2 PCR測序鑒定基因型

以綿羊卵巢組織為模板DNA，PCR擴增反應體系(25 μL)：Mix 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ddH2O 13.2 μL，模板DNA 1 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃延伸5 min。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，電泳電壓設為100 V，電流100 mA，時間30 min，觀察膠帶亮度及長度。將PCR產物進行測序，分析鑒定基因型。測序結果通過DNAMAN軟件對其數據進行拼接，運用Oligo 7 Primer Analysis Software將試驗綿羊序列與綿羊線粒體基因組標準序列(GenBank：AF010406.1)比對分析。

1.2.3 顆粒細胞的分離培養

選取G、T基因型母羊，采集雙側卵巢并使用生理鹽水、75%酒精清洗，放于含有1% 雙抗和37 ℃生理鹽水的保溫壺中，在4 h內送至試驗室。取出卵巢，用生理鹽水清洗數次直至液體清澈，洗凈后剪去系膜，75%酒精沖洗1次，再放入盛有生理鹽水的燒杯中，反復清洗3次；用鑷子夾取刀片，在細胞培養基中把卵巢的適當大小卵泡進行切割；將上述液體全部移入15 mL無菌離心管中，離心機參數設置為2 000 r/min，定時離心5 min，棄上清液，加入2 mL PBS吹打懸浮，2 000 r/min 定時離心5 min，棄上清液，重復2～3次，加入10%胎牛血清、1% 雙抗和DMEM細胞培養基，吹打懸浮細胞，在37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養24 h后觀察細胞貼壁情況。

1.2.4 顆粒細胞凋亡檢測

使用Annexin V-FITC雙染細胞凋亡檢測試劑盒進行檢測，反應結束后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 顆粒細胞分裂和融合相關蛋白表達水平檢測

使用線粒體分離試劑盒進行線粒體分離，參考BCA蛋白定量試劑盒中的說明書，對所制取的蛋白進行定量測量。使用參考文獻[11]中的Western blot方法檢測顆粒細胞內線粒體融合相關蛋白Mfn1、Mfn2和分裂相關蛋白Drp1、MFF的表達水平。其中一抗、二抗雜交稀釋信息如表1、2所示。采用BandScan 5.0軟件分析。

表1 融合分裂相關蛋白表達水平檢測一抗信息

1.3 數據統計分析

利用GraphPad Prism軟件進行方差分析，結果以“平均數±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 PCR擴增產物的測序

PCR擴增產物的測序表明線粒體tRNA-Lys基因編碼區7 719位點存在T→G變異(圖1)。

圖1 tRNA-Lys基因變異位點測序峰圖

2.2 卵泡顆粒細胞凋亡

將相同處理后的不同基因型的顆粒細胞在相同條件下培養后，檢測凋亡情況，結果表明：G基因型凋亡率和T基因型凋亡率相比顯著降低(P<0.05)，G基因型細胞凋亡率為T基因型的60%(圖2)?？梢娋€粒體tRNA-Lys(T7719G)變異對卵泡顆粒細胞具有明顯抑制凋亡的作用。

A.不同基因型使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；B. 不同基因型顆粒細胞總凋亡率。*表示P<0.05，下同。

2.3 線粒體融合分裂相關蛋白表達量

鑒定綿羊基因型，提取不同基因型顆粒細胞總蛋白，用Western blot方法檢測融合分裂相關蛋白相對表達量。結果表明(圖3)，不同基因型顆粒細胞Drp1、Mfn1、Mfn2相對表達量差異均不顯著(P>0.05)，G基因型細胞MFF蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。

A. 聚丙烯酰胺凝膠電泳；B. 定量分析。

3 討論

細胞凋亡是經過嚴格調控的一種細胞程序性死亡方式，其過程涉及一系列生化反應。線粒體凋亡途徑被認為是細胞死亡的主要模式，在細胞發育過程中扮演著重要的角色。在各種凋亡信號的刺激下，細胞內活性氧(ROS)水平升高，導致線粒體膜電位降低，膜通透性增加，細胞色素C從線粒體中釋放出來形成凋亡體復合物。隨后激活caspase家族中介導凋亡的caspase-9，活化的caspase-9進一步切割并激活凋亡執行蛋白caspase-3，進而促進線粒體的凋亡[12]。線粒體功能障礙會導致ROS增加，形成惡性循環。高水平的ROS可以損傷細胞內的DNA、蛋白質和脂質等分子，導致細胞死亡。因此，線粒體的功能維持對于細胞生存至關重要。顆粒細胞在卵泡發育和成熟過程中扮演著重要角色，其在調節和選擇原始卵泡池中的卵子與維持正常的卵泡閉鎖機制中發揮重要作用[13]。在卵泡發育的過程中，顆粒細胞數量會逐漸增加，并對卵母細胞發揮著重要的調節作用。當顆粒細胞受到外界或內部信號的刺激，或者受到自身功能異常的影響時，會發生凋亡現象，從而對卵母細胞產生負面影響，導致卵泡閉鎖。因此，顆粒細胞凋亡不僅是卵泡發育和成熟過程中的正常調節機制，也可能是卵泡閉鎖的重要原因之一[14]。本試驗研究比較了不同基因型顆粒細胞的凋亡率，結果表明G基因型變異對卵泡顆粒細胞有明顯抑制凋亡作用，線粒體tRNA-Lys(T7719G)基因變異可以促進細胞增殖。

線粒體不斷進行分裂和融合，在分裂和分化過程中，環境變化的適應程度對細胞的生存及生長非常重要。當線粒體受到損傷時，會通過一系列蛋白質的產生、組合，進而形成自噬體，此后與溶酶體進行結合，最終移除受損線粒體[15]。線粒體形態學的變化是線粒體功能損傷的表現，并與多種疾病相關[16]。Drp1參與兩種功能和機械上完全不同的裂變，一種是外周分裂，使受損的物質脫落成更小的線粒體，從而進行線粒體的自噬，當線粒體自噬機制產生障礙，將導致線粒體系統性功能下降或線粒體數量冗余，進而對細胞穩態產生影響并導致生物體發生相關疾??；另一種是中間區分裂，導致線粒體增殖[17]。位于線粒體內膜的MFF作為Drp1的受體，控制中間區分裂，在分裂過程中將Drp1聚集到線粒體，從而影響線粒體分裂[18]。對MFF下游蛋白Drp1的檢測結果顯示，不同基因型樣本間差異不顯著，可能是因為Drp1不存在實質性蛋白表達的增加。

人們對自噬進行大量研究，并將其視為非選擇性降解蛋白質及細胞器的重要細胞途徑之一。除非選擇性的自噬細胞途徑之外，選擇性的自噬活動在清除特定的細胞器方面也發揮了十分重要的作用，如細胞線粒體自噬、內質網自噬、核糖體自噬、溶酶體自噬等[19]。線粒體自噬的發生，是對線粒體功能障礙或損傷進行高度保守降解與清除的過程，同樣是線粒體應激反應與穩態調控的一個重要機制[20]。當線粒體自噬機制受阻，可導致線粒體功能降低或線粒體冗余從而影響細胞穩態，引起相關疾病[21-22]。目前認為線粒體的融合和分裂在線粒體自噬過程中發揮著重要作用。已有研究指出MFF的激活與線粒體分裂密切相關，是其重要調節機制[23]。本試驗發現融合相關蛋白Mfn1和Mfn2表達量在G、T基因型樣本間無顯著差異，而分裂因子MFF蛋白量在G基因型樣本中顯著增高，MFF蛋白量的降低可能是由基因自身蛋白表達缺陷造成的，也可能是因為T基因型變異導致線粒體內膜損傷，MFF代謝發生異常。肖敏[24]研究發現MFF的表達上調導致線粒體裂變增加，分裂加劇可以產生細胞生長和細胞增殖所必需的細胞器，同時通過線粒體自噬促進受損線粒體的消除。然而，如果線粒體自噬機制受阻，線粒體的功能會受到影響，可能會導致相關疾病的發生。研究發現冠心病相關的線粒體tRNA-Thr變異(G15927A)會引起細胞線粒體自噬增加和分裂障礙，線粒體分裂因子MFF在變異的細胞中均有顯著降低[25]。

4 結論

線粒體tRNA-Lys(T7719G)變異對綿羊卵泡顆粒細胞有明顯抑制凋亡作用，顯著提高分裂相關蛋白MFF表達水平，促進細胞分裂。