黃連厚樸復方水提物對雞柔嫩艾美耳球蟲病的療效試驗

莫家豪，楊蒙，向俊，張志丹，張麗芳，張歌音，楊金琳，黎江*，司紅彬*

(1. 廣西大學動物科學技術學院，廣西畜禽繁育與疾病防控重點實驗室，廣西 南寧 530004；2. 廣西百色隆林各族自治縣天生橋鎮農業農村綜合服務中心，廣西 百色 533400)

雞球蟲病是發生在雞腸道內一種專一性寄生蟲傳染性疾病。隨著肉雞養殖企業的規?；l展，雞球蟲病的傳染性極速上升，導致每年全球禽業養殖損失超過140億美元[1]。柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)感染造成的危害最為嚴重?；疾∪怆u盲腸的上皮和固有層細胞受損，影響營養物質吸收，誘發潛在的致病菌感染[2]。臨床癥狀表現為采食量下降，飲水量上升，常出現鮮紅色血便。目前防治球蟲病主要是選擇用化學合成藥物，例如聚醚類離子載體抗生素(莫能菌素、鹽霉素)、三嗪苯乙腈化合物(地克珠利)和磺胺類(磺胺氯吡嗪鈉)等。但是，長期使用化學合成藥物可能導致球蟲的耐藥性增加，以及抗生素在肉蛋中高殘留等問題的發生。盡管球蟲疫苗研究是防治球蟲病的熱點之一[3]，但是球蟲疫苗的安全性值得關注，如果球蟲活體疫苗的穩定性較差，雞群很有可能暴發球蟲病。為維護我國動物源食品安全和公共衛生安全，農業農村部決定實施藥物飼料添加劑退出計劃。該計劃強調不可采用以往低劑量單藥治療疾病，抗生素防球蟲的替代方案需求迫在眉睫。中草藥天然植物具有多成分、多靶點、多作用和不易造成耐藥性等特點，已經逐漸受到家禽養殖業廣泛的關注。

雞球蟲病在中獸醫辨證中屬于由濕熱及外感蟲邪所引起濕熱血痢、蟲積證[4]，因此選用具有清熱燥濕、涼血止痢、驅蟲等中草藥治療雞球蟲病。前期研究表明[5-6]，厚樸及其復方具有抗球蟲作用，能有效地控制患病雛雞排出的卵囊數量、血便以及生長性能下降情況。為提升療效，根據雞球蟲病的臨床癥狀，配伍以黃連厚樸為主藥的復方，組方原則以清熱燥濕為主，涼血止痢和驅蟲為輔。黃連厚樸復方水提物(簡稱：連樸水提物)是以黃連厚樸藥對為主藥，綜合常山、馬齒莧和地錦草三味中草藥的復方水提物，具有驅蟲、止血痢、祛濕行運等功效。藥對黃連厚樸，以黃連降其熱火，以厚樸祛其濕熱，具備清熱、厚腸止痢、消脹止滿等功效，針對雞球蟲病引起的久痢不止等癥狀進行緩解；常山在機體主要的功效為消滅球蟲；馬齒莧清熱解毒、涼血止痢，配伍地錦草增強清熱解毒、治療血便的功效。五味藥組合發揮清熱祛濕、驅蟲止血痢等防治雞球蟲病的療效。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物與蟲株

300只1日齡雄性廣西黃羽肉雞購自廣西富鳳農牧有限公司，柔嫩艾美耳球蟲卵囊來源和保存于廣西大學動物科學技術學院中獸醫實驗室。

1.1.2 藥品及其制備

常山、馬齒莧、地錦草、厚樸、黃連均購自湖南省松齡堂中藥飲片有限公司。地克珠利由天津瑞普生物科技有限公司提供。分別稱取一定重量份配比的常山、地錦草、厚樸、馬齒莧和黃連后，逐一粉碎5～10 min、過50目篩后所得的粉末混合。將其組合粉末物加入蒸餾水浸泡4 h，隨后分別加入中藥質量10、8、6倍的蒸餾水進行煎煮。煮沸后改為文火繼續煎煮1 h，而后過濾到藥液。將3次過濾得到的藥液合并在一起，進行旋轉、蒸發濃縮藥液，使得藥液最終濃度為2 g/mL，所得藥液即為連樸水提物。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組及處理

300只1日齡廣西黃羽肉雞統一飼養至13日齡，隨機選取96只體重相近(±5g)的雛雞進行分組，共4組，每組3個重復，每重復8只?？瞻捉M，不感染球蟲+無藥物治療；攻蟲組，感染球蟲+無藥物治療；地克珠利組，感染球蟲+0.2 mL/L地克珠利，攻蟲當天給藥，連續飲水給藥8 d(14～22日齡)；連樸水提物組，感染球蟲+4 mL/L連樸水提物，攻蟲前1 d給藥，連續飲水給藥9 d(13～22日齡)。

14日齡早上9：00除空白組外(空白組灌服相同體積生理鹽水)，經口灌服2×104子孢子化卵囊至嗉囊。自感染球蟲后，每日檢測雞精神狀態、死亡情況、臨床癥狀。在攻蟲后的第5～7天，觀察糞便并記錄血便評分。在攻蟲后第6～8天收集糞便，統計每克糞便中卵囊數(OPG)。攻毒后第7天，記錄雛雞體重(末重)。在每個重復中隨機挑選雛雞頸椎脫臼處死，頸靜脈收集約6～7 mL新鮮雛雞的血液。血液4 ℃保存1～2 h，隨后3 500 r/min、5 min、4 ℃離心收集血清。血清保存-20 ℃冰箱，以便后續使用。

1.2.2 抗球蟲指標檢測

1.2.2.1 相對增重率

相對增重率=(感染用藥組的平均增重/不感染不用藥組的平均增重)×100%。

1.2.2.2 存活率

存活率=(每組雞總數-死亡數)/每組雞總數×100%。

1.2.2.3 血便評分

血便評分標準[7]：100%糞便不帶血記0分；1%～25%糞便帶血記1分；26%～50%糞便帶血記2分；51%～75%糞便帶血記3分；76%～100%糞便帶血記4分。

1.2.2.4 盲腸病變評分

依據Johnson和Reid[8]的標準，剖檢后根據盲腸病變的嚴重程度進行記分。無肉眼病變記0分；盲腸璧有很少散在出血點，腸壁不增厚，內容物正常記1分；病變數較多，盲腸內容物明顯帶血，盲腸壁較厚，內容物正常記2分；腸壁出血的數量較多，內容物明顯帶血，盲腸璧稍增厚記3分；盲腸中充滿大量的血液和腸芯，盲腸腫大，腸芯中含有糞渣或不含糞渣記4分。盲腸病變值=盲腸病變評分×10。

1.2.2.5 卵囊值評分[9]

在感染后第6.5、7、7.5、8天，統計雛雞中OPG。統計的方法如下：稱取1 g糞便放入玻璃燒杯中，加入10 mL的蒸餾水均勻攪拌，隨后吸取適量的溶液滴到血球計數板上，統計血球計算板里面的4個大方格中球蟲卵囊的數量。

計算公式為：OPG=4個計數室的平均值×105。如果顯微鏡下觀察到的卵囊數目非常多，可以選擇100或者1 000倍稀釋卵囊溶液。

卵囊比=(感染用藥組的卵囊數/不感染不用藥組的卵囊數)×100%。卵囊值評分：卵囊比0～1%記0分；1%～25%記5分；26%～50%記10分；51%～75%記20分；76%～100%記40分。

1.2.2.6 抗球蟲指數(ACI)

計算公式[10]：ACI=(相對增重率+存活率)-(盲腸病變值+卵囊值)。ACI在120以下為無效，120～160為差，160～180為良好，180以上為優。

1.2.3 雞外周血清細胞因子測定

使用南京博研生物科技有限公司試劑盒測定雛雞外周血清中的白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素10(IL-10)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平。

1.2.4 雞外周血清抗氧化指標水平測定

使用南京博研生物科技有限公司試劑盒測定雛雞外周血清中的總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的水平。

1.2.5 盲腸病理組織學分析

1.2.5.1 盲腸的采集以及固定

感染7 d后雛雞斷頸處死，取出雞的腸道組織，小心分離盲腸。手術鑷子固定盲腸近段，利用手術剪刀分離出2～3 cm的盲腸小段。將盲腸小段放入4%甲醛溶液中，每12 h更換一次甲醛溶液，直至溶液澄清。

1.2.5.2 盲腸組織切片的制作

盲腸按照包埋盒尺寸修整后，放入包埋盒并且標記。將包埋盒放至大燒杯中，流水沖洗約24 h。隨后脫水浸泡、浸蠟、包埋、蠟塊的切片和展片、脫蠟以及HE染色。最后將組織切片進行封片與鏡檢。在光學顯微鏡上觀察組織結構是否完整，細胞形態是否正常。

1.3 數據分析

使用SPSS軟件分析數據。雞體重、盲腸病變評分和OPG結果用“平均數±標準差” 表示。體重、血便評分、盲腸病變評分、OPG、血清細胞因子以及抗氧化指標采用單因素方差分析，鄧肯分析進行比較，P<0.05為差異顯著。采用Prism 9軟件進行圖型分析。

2 結果

2.1 相對增重比較

雛雞感染球蟲后臨床出現便血、采食量減少和生產性能下降等情況，表現為雛雞增重減緩，嚴重感染情況下甚至出現負增重。如表1所示，攻蟲組的雛雞相對增重率減少至55.67%。在使用連樸水提物后，相對增重率到達94.48%。

表1 各組體重信息

2.2 各組感染球蟲后的存活情況

如表2所示，感染球蟲后，空白組、地克珠利組和連樸水提物組的雛雞沒有死亡。攻蟲組在第5和第6天分別死亡2只和1只。

表2 各組感染后存活情況

2.3 血便評分

血便是雞球蟲病的主要臨床診斷特征。如表3所示，感染球蟲后的第5～7天，血便嚴重。與攻蟲組相比，連樸水提物組各階段的血便都顯著(P<0.05)下降。

表3 血便評分

表4 盲腸病變評分

2.4 盲腸病變評分

雛雞感染球蟲后，臨床癥狀表現為痢疾，排鮮紅色糊狀糞便。死亡雞解剖發現，雛雞皮膚干燥缺水，盲腸腫脹，腸壁不同程度出血點，盲腸無內容物，或腸壁細胞脫落形成腸芯或混合物形成血凝塊。攻蟲組雛雞發現盲腸出現不同程度的出血點、盲腸芯或血凝塊。連樸水提物組盲腸病變相比攻蟲組顯著下降(P<0.05)，表現為該組雛雞盲腸壁出血點減少，少量雞出現盲腸壁變厚現象，說明該組方能有效減少球蟲感染導致的盲腸病變，保護了腸道的健康。如表 4所示，攻蟲組和連樸水提物的盲腸評分別為28.50和15.00。

2.5 卵囊值評分

雞球蟲的生活史最后階段是排出卵囊，污染雞舍環境，傳播疾病。表5所示。與攻蟲組相比，連樸水提物組排出卵囊數量顯著性下降(P<0.05)，表明連樸水提物可以減少雞感染球蟲疾病期間卵囊的數量，降低卵囊進一步感染其他雛雞的風險。攻蟲組和連樸水提物組的卵囊值分別為40和10。

表5 卵囊值

2.6 抗球蟲指數

如表6所示，連樸水提物抗球蟲指數為169.48，達到良好的抗球蟲水平。

表6 抗球蟲指數

2.7 外周血清中細胞因子

雛雞在感染球蟲后，會導致外周血清中的促炎癥因子升高，進一步加劇腸炎的發生。如圖1所示，與空白組相比，促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)在攻蟲組中顯著上調(P<0.05)。在使用藥物治療后，與攻蟲組相比，地克珠利組和連樸水提物組顯著下調了促炎因子在外周血清的含量(P<0.05)。與空白組相比，攻蟲組的抑炎因子IL-10顯著上調(P<0.05)，提示炎癥的發生。在使用連樸水提物后，與攻蟲組相比，雛雞的IL-10在血清中的含量顯著上升(P<0.05)，從而提升抑制炎癥的效果。

2.8 抗氧化指標

如圖2所示，與空白組相比，攻蟲組的外周血清中抗氧化酶(T-AOC和SOD)顯著下調(P<0.05)。與攻蟲組相比，連樸水提物組的T-AOC和SOD水平顯著上調。與空白組相比，攻蟲組感染球蟲后MDA和NO含量顯著上調(P<0.05)。與攻蟲組相比，連樸水提物組的MDA和NO顯著性下降(P<0.05)。這些結果提示連樸水提物有效的減少雛雞因球蟲感染造成的氧化應激。

圖2 各組抗氧化相關指標的變化

2.9 盲腸病理組織學分析

通過光學顯微鏡觀察(圖3)感染后第7天盲腸的形態變化情況?？瞻捉M緣狀紋完整沒有斷裂，腸上皮完整，固有層的細胞完整，腸腺豐富規律。攻蟲組中，盲腸緣狀紋模糊不清、脫落至腸腔，內容物中存在大量即將排出體外的卵囊；盲腸腺體被密集的卵囊占據，腸腺完全消失，固有細胞排列疏松，組織間伴隨大量的炎性細胞浸潤。地克珠利組中，緣狀紋無明顯斷裂較為完整；腸腺與攻蟲組相比數量較為豐富、排列較為緊密；組之間有大量的炎性細胞浸潤。連樸水提物組中，可見緣狀紋存在部分斷裂脫落，腸腺較為豐富，但形態較??；組織間有不同程度炎性細胞浸潤。

箭頭指向的是炎癥細胞浸潤，圓圈內的是球蟲卵囊。

3 討論

柔嫩艾美耳球蟲感染會刺激CD4+T細胞和CD8+T細胞增殖，而后分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等細胞因子引發炎癥反應[11]。有研究證明，柔嫩艾美耳球蟲感染雞體內后，可以被雞特定受體ChTLR15特異性識別，進而激活 ChTLR15/NLRP3炎癥信號通路，引起通路中關鍵因子ChTLR15、MyD88、NF-κB、NLRP3的mRNA表達上調，進一步上調炎癥因子IL-1β等細胞因子水平，加劇炎癥反應發生[12]。細胞在正常的生理活動情況下會產生活性氧(ROS)，而低水平的ROS可以正向調節機體的生理活動過程[13]。感染球蟲的雛雞，腸黏膜細胞會遭受破壞而后死亡。在這個過程中，機體會產生大量ROS，其中包括NO，用于清除病原體。但是累計的大量NO會表達細胞毒性，進而加劇腸道的內環境惡化，同時也會導致氧化和抗氧化失去平衡。柔嫩艾美耳球蟲會抑制腸道內的抗氧化功能[14]，致使過氧化產物MDA水平的升高，抗氧化酶T-AOC、CAT、SOD的含量下降，同時也會繼發感染細菌疾病引發壞死性腸炎的發生，使得腸道的健康進一步破壞[15]。本研究中，攻蟲組血清的抗氧化指標和炎癥指標也有相同的趨勢，即炎癥因子和氧化因子顯著上調。使用連樸水提物后可以下調部分的炎癥因子和氧化因子，改善腸道的炎癥反應。從切片可以發現，雛雞在感染柔嫩艾美耳球蟲7 d后，盲腸的上皮和腺體被大量的蟲卵寄生；子孢子入侵腸黏膜上皮細胞和腸腺細胞，逐步形成裂殖體；裂殖體破裂釋放更多的子孢子，導致腸道黏膜遭受破壞并脫落，這會引起毛細血管出血，脫落細胞與血液混合物形成的“盲腸芯”，阻礙盲腸營養物質的吸收，進一步導致雛雞疾病惡化。使用連樸水提物治療后，相比于攻蟲組，連樸水提物組的腸上皮絨毛和腸腺更完整，炎性細胞浸潤減少。這些結果綜合表明，連樸水提物可以保護腸道細胞的完整性，減少炎癥細胞浸潤的發生，從而達到治療雞球蟲病的效果。

綜上所述，本研究使用純天然的植物中草藥治療球蟲病，結果表明連樸水提物的抗球蟲指數為169.48，達到良好抗球蟲效果，能有效地減少柔嫩艾美耳球蟲感染造成的盲腸病理損傷、卵囊的排出數量以及血便的數量，恢復其生長性能；連樸水提物可以降低促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的含量，提升抑炎因子(IL-10)的含量，從而達到降低炎癥的發生；連樸水提物可以提高雛雞感染期間抗氧化酶(T-AOC和SOD)的含量，減少脂質過氧化物MDA以及NO的含量，達到抗氧化應激的效果。因此，連樸水提物可能通過下調炎癥因子和過氧化物水平，上調抑炎因子和抗氧化酶的水平，達到減緩炎癥、氧化應激對雛雞在患球蟲病期間的影響。這種作用可以減少血便、卵囊排出和盲腸損傷，從而保護了腸道健康，提升雛雞的生長性能。因此，連樸水提物有望成為抗生素以及化學合成藥物的替代藥物。