基于CRISPR/Cas9技術PCSK9基因敲除小鼠模型的構建及表型驗證

托羅娜依·米吉提, 陳小翠, 崔元峰, 阿比旦·阿卜杜如蘇力, 陳邦黨, 馬秀敏

(新疆醫科大學1附屬腫瘤醫院醫學檢驗中心, 烏魯木齊 830000, 2基礎醫學院, 烏魯木齊 830017;3第一附屬醫院臨床醫學研究院, 烏魯木齊 830011)

前枯草桿菌蛋白原轉換酶9(Preprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)是一種主要由肝臟合成的絲氨酸蛋白酶,由12個外顯子組成,位于染色體1p32.3上。PCSK9蛋白由N-端信號肽、前結構域、催化結構域和C-端結構域構成[1-2]。PCSK9是膽固醇穩態的重要調節因子[3],不僅與常染色體顯性遺傳高膽固醇血癥相關,還能夠有效調節體內脂質代謝水平,根據PCSK9對低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)調節作用的不同,可分為功能獲得性突變(Gain-of-function,GOF)和功能缺失性突變(Loss-of-function,LOF)[4-5]。功能缺失性突變(Y142X或C679X)導致PCSK9合成、自身催化裂解、成熟和分泌障礙,使其在血漿中的水平降低,肝臟低密度脂蛋白受體(Low-density lipoprotein LDL receptor,LDL-R)的表達增加,LDL-C濃度降低,循環中的甘油三酯和膽固醇水平降低,對心血管疾病(CVD)具有保護作用[6]。而PCSK9功能獲得性突變(D374Y)導致LDL-R降解增強,肝細胞表面LDL-R水平降低,血漿LDL-C水平升高,最終導致高膽固醇血癥,進而引發心血管疾病[7-8]。由于PCSK9功能缺失性突變會引起LDL-C水平降低,因此成為降脂治療藥物的干預靶點,目前在臨床上廣泛應用的PCSK9單克隆抗體alirocumab和evolocumab,能夠將LDL-C從基線水平降低60%,同時血清甘油三酯(Triglyceride,TG)降低15%[9],有研究證實,在動脈粥樣硬化(ApoE KO)小鼠模型中使用PCSK9抑制劑可以有效減輕斑塊面積[10],延緩動脈粥樣硬化疾病的進展,而PCSK9的過度表達則造成主動脈膽固醇的聚集和更為嚴重的動脈粥樣硬化表型[11]。

近年來,PCSK9抑制劑被證實具有良好的降脂、抗炎、降低心血管風險作用,主要適用于治療純合子型家族性高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化性心血管疾病[12]。研究表明PCSK9與血脂異常、糖尿病、非酒精性脂肪肝等代謝性疾病密切相關[13],但其作用機制尚未完全闡明。本研究利用CRISPR/Cas9技術構建全身性PCSK9基因敲除(PCSK9 KO)小鼠,并通過q-PCR、Western Blot證實獲得全身性PCSK9基因敲除小鼠,對其表型進行初步驗證,為進一步研究PCSK9在心血管疾病中的作用機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物遺傳背景為C57BL/6J的雄性野生型(WT)小鼠購自上海南方模式生物科技股份有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(滬)2019-0002,飼養于新疆醫科大學動物實驗中心SPF級屏障系統中,環境溫度控制在22～25℃,相對濕度達40%～70%,光暗周期12 h,空氣潔凈度達1萬級,自由進食和飲水。本實驗經新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗醫學倫理委員會批準實施(審批號:20211018-03)。

1.2 主要試劑與儀器基因組DNA提取試劑盒(Omega,貨號:D4035-01);一步法反轉錄熒光定量試劑盒(北京天根生化科技有限公司,貨號:FP313-01);QuantiNova SYBR Green 染料法PCR 試劑盒(QIAGEN GmbH,貨號:208054);2X Taq PCR mix(北京天根生化科技有限公司,貨號:KT202);BCA蛋白定量(賽默飛,貨號:23225);RNA提取(TRIzolTM)試劑(賽默飛,貨號:15596018);羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(abcam,貨號:ab6789);兔抗山羊 IgG-辣根過氧化物酶 (proteintech, 貨號:ab6721);ECL化學發光檢測試劑盒(biosharp公司);Wako LabAssay cholesterol/Triglyceride(DAOS method)試劑盒(日本和光純藥,貨號:635-50981,632-50991);PCSK9抗體(NOVUS,1∶100);LDL-R抗體(abcam,1∶1 000);HSP90抗體(proteintech,1∶1 000)。全波長酶標儀;低溫冷凍高速離心機(美國Thermo Scientific公司);冷凍研磨儀(浙江美壁儀器有限公司);凝膠成像分析儀ChemiDoc M、凝膠電泳儀以及PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司);瓊脂糖凝膠電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 單鏈向導RNA(Single guide RNA,sgRNA)靶點的選擇及sgRNA、Cas9體外轉錄、顯微注射及擴群 根據小鼠PCSK9基因的結構,利用非同源末端連接(NHEJ)修復引入突變的方式,通過在線sgRNA設計網站(http://crispor.tefor.net/)設計sgRNA,本研究敲除策略針對的轉錄本是(Ensembl號):PCSK9-201(ENSMUST00000049507.5),引導Cas9核酸酶定點發生剪切,敲除外顯子2～5片段,敲除策略如圖1。導致基因讀碼框發生移碼突變,最終使蛋白功能缺失,經活性檢測,確定序列為sgRNA 1(5′-3′): ACTGAGATGAGGTCATGCTGGG,sgRNA 2(5′-3′):CTTCCTGCTAAGCTTT-

GGCTGGG。在高倍顯微鏡下獲得及鑒定陽性基因敲除品系,用顯微操作器控制顯微注射針向C57BL/6野生型(WT)小鼠的受精卵中注射Cas9 mRNA和sgRNA,并將注射后的受精卵移植到假孕母鼠中,新出生的小鼠為F0代小鼠。由于受精卵早期卵裂速度很快,因此得到的F0代小鼠為嵌合體,通過傳代獲得具有穩定遺傳能力的F1代小鼠。

通過PCR擴增及測序方法鑒別出陽性F0代小鼠,挑選出陽性F0代小鼠與WT小鼠交配,獲得PCSK9敲除F1代雜合子小鼠,鑒定方法同F0代陽性小鼠。PCR反應條件為:94℃預變性3 min;98℃變性15 s,61℃退火15 s,68℃延伸4 min,共35個循環;最后68℃延伸5 min。將獲得的PCSK9雜合子小鼠通過自交得到F2代PCSK9基因敲除純合子(PCSK9-/-)小鼠,并進行敲除驗證和表型分析。

1.3.2 基因鑒定 (1)鼠尾基因組DNA提取:小鼠出生至2月齡后,剪取小鼠尾尖 0.5～1 cm,置于2 mL EP管中,參照Omega基因組DNA提取試劑盒操作方法,加入200 μL TL Buffer和25 μL OB蛋白酶,55℃水浴鍋過夜。次日,12 000 r/min離心5 min,轉移上清至DNA吸附柱,加入200 μL BL Buffer和200 μL無水乙醇,12 000 r/min離心1 min,棄廢液,加入500 μL HBC Buffer,12 000 r/min離心1 min,棄廢液,加入700 μL Wash Buffer 洗2次,將DNA吸附柱轉移到1.5 mL EP管,加入20 μL加熱至70℃的Elution Buffer,室溫靜置2 min,12 000 r/min離心1 min,收集DNA,NanoDrop 2000測定DNA純度。(2)PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳:鑒定引物序列(表1)由上海南方模式生物科技有限公司合成,PCR P1、P2、P3和P4反應體系如下(20 μL):2×Power Tag PCR Master Mix 10 μL,P1 0.5 μL,P2 0.5 μL,模板DNA 1 μL,滅菌ddH2O 8 μL。采用PCR 擴增儀進行循環擴增,反應條件:預變性95℃5 min;變性95℃ 15 s,復性60℃ 15 s,延伸72℃ 1 min,循環35次;最后延伸72℃5 min;12℃停留。取PCR產物8 μL,在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳分析,以110 V恒壓由負極向正極電泳 25 min,在化學發光凝膠成像系統中拍照分析。

表1 引物序列信息

1.3.3 Western Blot檢測肝臟PCSK9及LDL-R蛋白表達,心臟、腦、腎臟及脂肪組織中PCSK9蛋白表達 使用RIPA裂解液裂解肝臟、心臟、腦、腎臟及脂肪組織,研磨機研磨,超聲破碎細胞,4℃下,13 000 r/min離心15 min,取上清,BCA蛋白定量,100℃金屬浴變性10 min,取60 μg蛋白提取液,室溫下SDS-PAGE分離蛋白,先以80 V恒壓電泳30 min,待樣品跑過濃縮膠后,再以110 V恒壓電泳90 min,用濕轉法以80 V恒壓3 h轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉液中封閉2 h,0.1% PBST 洗膜 5次,每次5 min。PCSK9(1∶100)、LDL-R(1∶1 000)及HSP90(1∶1 000)在4℃下孵育過夜。PBST洗膜5 次,每次5 min,孵育二抗(1∶3 000)2 h,同上洗膜,ECL發光液孵育后,取出PVDF膜于凝膠成像分析儀上進行曝光分析,以HSP90為內參照,Image Lab對目的蛋白與HSP90灰度的比值進行蛋白表達分析。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測肝組織PCSK9基因表達 使用TRIzol法提取肝組織總RNA,按照RNA逆轉錄試劑將RNA逆轉錄為cDNA,使用實時熒光定量PCR檢測試劑盒擴增基因片段,反應條件:95℃ 2 min;95℃ 5 s,60℃ 10 s,循環40次。以18S作為內參照,采用2-ΔΔCt法進行計算。其中所用引物:PCSK9上游引物為5′-TATCCCAGCATGGCACCAGA-3′,下游引物為5′-ATGGTGACCC-TGCCCTCAA-3′; 18S上游引物為5′-TTGACGG-AAGGGCACCACCAG-3′, 下游引物為5′-GCACCACCACCCACGGAATCG-3′。

1.3.5 血清膽固醇(TC)、TG水平檢測 小鼠飼養至4月齡,WT和PCSK9 KO小鼠禁食不禁水12 h后稱重,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠,心臟穿刺采血,血樣室溫放置1 h后,4℃冰箱放置2 h,4℃條件下以3 500 r/min離心15 min,收集血清樣本凍存。取2 μL血清,用Wako LabAssay cholesterol/Triglyceride (DAOS method)試劑盒測定。

2 結果

2.1 F1代小鼠的篩選F0代小鼠與WT小鼠雜交后得到F1代雜合子小鼠,通過基因測序結果顯示,目標區域缺失4 878個堿基對(圖2A)。F1代小鼠,PCR后P1和P2出現837 bp,P3和P4出現568 bp兩個條帶的則為F1代雜合(HE)小鼠,如圖2B。

注: A, PCSK9敲除前后測序結果對比; B, F1代雜合子PCR鑒定結果。

2.2 PCSK9基因敲除小鼠PCR鑒定將獲得的F1代雜合子小鼠自交獲得F2代小鼠,瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,P3、P4擴增出568 bp條帶的是WT小鼠,P1、P2擴增出837 bp條帶的是PCSK9基因敲除小鼠(圖3),繼續繁育擴群,獲得更多純合小鼠。

圖3 PCSK9 KO小鼠PCR鑒定

2.3 小鼠肝組織中mRNA表達水平q-PCR結果顯示,與WT小鼠(0.94±0.12)相比,基因敲除小鼠PCSK9 在轉錄水平表達量為0,差異有統計學意義(P<0.000 1),見圖4。

注: n=5, ****P<0.000 1。

2.4 PCSK9蛋白表達Western Blot檢測結果顯示,WT小鼠肝臟中PCSK9蛋白表達(1.000±0.250)較PCSK9 KO小鼠(0.007±0.003)升高;PCSK9 KO小鼠肝組織中LDL-R蛋白表達(3.42±0.56)較WT(1.00±0.21)顯著升高,差異有統計學意義(P均<0.000 1)(圖5A)。在PCSK9 KO小鼠心、腦、腎、脂肪組織中幾乎檢測不到PCSK9蛋白表達,證明成功構建獲得PCSK9基因敲除小鼠(圖5B)。

注:A,小鼠肝組織PCSK9、LDL-R蛋白表達水平(n=5, ****P<0.000 1); B, PCSK9在不同組織中的表達水平(n=3)。

2.5 PCSK9基因敲除對小鼠血清TC、TG水平的影響與WT小鼠相比,PCSK9 KO小鼠循環血清總膽固醇(TC)濃度顯著降低(90.75±17.81 mg/dLvs54.19±2.42 mg/dL),甘油三酯(TG)濃度顯著降低(81.26±11.98 mg/dLvs50.92±11.93 mg/dL),差異有統計學意義(P均<0.001)。

3 討論

血脂異常是冠心病發病的重要危險因素之一,其中高膽固醇血癥是誘發冠心病和動脈粥樣硬化的關鍵風險因素[14-15],因此降低血液中LDL-C的水平成為防治動脈粥樣硬化及冠心病極具價值的治療手段。體內外實驗和人類基因組研究表明,PCSK9是一種主要由肝臟合成的、在小腸和腎臟中表達較少[16],在膽固醇代謝中起關鍵作用的酶。有研究表明,PCSK9功能獲得性突變是家族性高膽固醇血癥的原因,而功能缺失性突變降低了LDL-C水平,由此認為PCSK9是降低膽固醇的生物靶點[17]。

本研究利用 CRISPR/Cas9 系統,將PCSK9基因2-5號外顯子(exon 2-5)區域進行有效敲除,使該編碼區域 4 878 bp 的基因序列缺失,造成PCSK9基因蛋白讀碼框移碼,功能缺失,成功構建了全身性PCSK9基因敲除小鼠模型,使該品系在后續繁育保種過程中具有遺傳穩定性的特點[18],是一個高效快速獲得PCSK9基因敲除小鼠的方法。

PCSK9通過降解肝細胞表面的LDL-R來調節血脂代謝。臨床研究顯示,使用PCSK9抑制劑通過阻斷PCSK9與LDL-R的結合,增加LDL-R的表達,促進肝細胞對LDL-C的清除,從而將血液中LDL-C從基線水平降低53%至56%,同時血清TG亦顯著降低[19-21]。重組腺相關病毒載體介導PCSK9基因靶向轉染小鼠肝臟以及PCSK9轉基因小鼠模型中,PCSK9通過降低肝臟LDL-R表達,顯著增加血漿膽固醇、甘油三酯和LDL-C水平[22-23]。本研究發現全身性PCSK9基因敲除小鼠,其血清TC、TG水平較WT小鼠顯著降低,且肝臟組織中LDL-R蛋白顯著上調,與既往報道相一致。本研究利用全身性PCSK9基因敲除小鼠模型,進一步證實PCSK9是調節肝臟脂質代謝的關鍵性蛋白酶,PCSK9介導LDL-R降解可能是其調節血脂異常的關鍵機制,PCSK9可作為防治血脂異常的藥物研發的干預靶標。因此,通過敲低或者阻斷PCSK9的合成和分泌,可能成為調脂治療和防治動脈硬化性心血管疾病的有效干預策略。

PCSK9主要在肝細胞中合成,在小腸、腎臟、胰腺β細胞、巨噬細胞和血管平滑肌細胞甚至脂肪細胞中也有表達,PCSK9在多種器官和細胞中的表達意味著除控制LDL代謝之外,可能還發揮多種生物學功能。研究發現PCSK9在中樞神經系統發育、動脈粥樣硬化發病、免疫應答和腫瘤發生等多種生物學功能中發揮作用[24]?；谶z傳學的研究資料顯示,在PCSK9基因功能缺失性突變的健康人群中,PCSK9基因功能的缺失與血漿LDL-C水平顯著下降及冠心病發病率降低密切相關[25]。條件性敲除僅能研究靶基因在特定組織或細胞中的功能,因此,本研究構建全身性PCSK9基因敲除小鼠模型,能夠更好地模擬人PCSK9基因功能缺失的臨床特征,初步驗證其表型并探討PCSK9基因缺失對血脂水平的影響及其可能的機制,可為后續研究PCSK9在脂代謝紊亂相關疾病中的分子調控機制及藥物研發奠定實驗基礎。