茉莉酸在L-谷氨酸誘導的番茄果實抗性中的作用

楊佳麗，韓 笑，王騰飛，狄建兵，劉亞平，王 愈*

（1 山西農業大學食品科學與工程學院 山西晉中030801 2 山西省果蔬貯藏保鮮與加工技術創新中心 山西晉中 030801）

鏈格孢菌（Alternaria alternata）是番茄果實發生病害的重要病原菌之一，由其引起的黑斑病不僅造成嚴重的經濟損失，而且產生的毒素會對人類健康產生巨大的威脅[1]。鑒于當前廣泛使用化學殺菌劑所帶來的生態環境和食品安全問題，迫切需要尋求更為安全、環保、有效的替代產品和技術[2-4]。目前，利用生物源或非生物源激發子通過誘導植物產生或提高自身抗性防御病害已成為研究熱點[5-8]。生物防治（如拮抗細菌、酵母菌和真菌等）作為近年來控制果蔬病害較為有潛力的新途徑，雖已有商業化產品上市，但仍有其不可忽視的局限性。相較于生物類激發子，化學類激發子實施簡單、易操作，受周圍環境因素影響較小，防效穩定，同時生產和貯藏成本也較低。常見的化學激發子有水楊酸及其類似物苯丙噻重氮、茉莉酸及茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）、殼聚糖、幾丁質、碳酸氫鹽類、可溶性鈣鹽、β-氨基丁酸和γ-氨基丁酸等。前期研究發現L-谷氨酸（以下簡稱“谷氨酸”）可以作為一種化學激發子，有效抑制果實上多種采后病原菌的侵染，且綠色安全，容易獲得，生產使用成本低，具有廣闊的商業應用前景，然而有關谷氨酸的誘抗機制研究較為有限[9-11]。近期有報道顯示，谷氨酸可能通過介入宿主的植物激素信號路徑來調控其對病原菌的抗性反應[12]。Goto 等[13]的轉錄組學分析表明，擬南芥根部經谷氨酸處理后會誘導水楊酸路徑相關的基因上調表達。Kadotani 等[14]利用谷氨酸處理水稻根部后提高了葉片組織對稻瘟病的抗性，其抗性機制可能部分依賴于水楊酸信號路徑。為進一步解析谷氨酸的誘抗機制，本文探討谷氨酸對另一種植物激素——茉莉酸相關路徑的影響。

植物在與病原菌的長期斗爭和協同進化中形成了一系列行之有效的防御體系，這一過程受到復雜的信號轉導網絡調控，其中植物激素在該信號系統中發揮重要作用，且不同的植物與病原菌互作會啟動或依賴不同的信號路徑[15-18]。植物激素在植物體內發揮其生理作用的機制較為復雜，從其合成、運輸、與膜受體結合，到完成信號感知傳遞，進而誘導特定的基因表達和生理反應，是一個連續且互為影響的過程[19]。茉莉酸作為植物激素中一類重要的信號分子，不僅調節植物多個生長發育過程，而且參與植物對生物和非生物脅迫的逆境響應[20-21]。一般來說，茉莉酸在植物體內的合成始于亞麻酸，而后經過脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）、丙二烯氧化物合酶（Allene oxide synthase，AOS）、丙二烯氧化物環化酶（Allene oxide cyclase，AOC）和12-氧植物二烯酸還原酶（12-oxo-Phytodieenoic acid reductase，OPR）催化和3 個β-氧化反應而形成[22]。當植物遭受到外界脅迫時，其體內的茉莉酸水平迅速上升，并在茉莉酸氨基酸合成酶（Jasmonate amino acid synthase，JAR）的催化下與異亮氨酸（Ile）結合生成茉莉酸的活性形式——JA-Ile 復合物，再與冠菌素不敏感蛋白1（Coronatine insensitive 1，COI1）COI1 結合，誘導JAZ（Jasmonate ZIM-domain，JAZ）蛋白釋放所結合的轉錄因子MYC2，最終啟動茉莉酸響應基因的應答[23-24]。然而，植物在應對病原菌侵染時，其體內的茉莉酸路徑是提高宿主對病原菌的抗性還是敏感性，這與具體的植物和病原菌互作體系密切相關。本文在前期研究基礎上，以番茄果實與鏈格孢菌互作為研究對象，從轉錄水平上分析谷氨酸對茉莉酸合成路徑和信號路徑的影響，解析谷氨酸響應病原菌侵染的抗性機制，為谷氨酸的商業化應用提供理論依據，也為采后病害控制策略提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的“千禧”番茄果實（Solanum lycopersicum L.cv.Qianxi）采摘于紅熟階段，選取無機械傷口及病蟲害侵染的果實備用；鏈格孢菌（CGMCC3.4578）購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

L-谷氨酸，茉莉酸甲酯，上海阿拉丁生化科技股份有 限公司；RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，日本Takara Bio 公司。

1.2 儀器與設備

NanoDrop l000 超微量分光光度計、ABI QuantStudio 6 Flex 熒光定量PCR 儀，美國Thermo Fisher 公司；Thermal Cycler PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌孢子懸浮液制備 將鏈格孢菌接種到PDA 培養基上后置于25 ℃的培養箱中，培養7 d 后刮取適量孢子于無菌水中，利用血球計數板計數方法將孢子懸浮液調整至供試濃度。

1.3.2 果實處理 番茄果實在0.1%次氯酸鈉溶液中處理2 min，用水沖洗干凈后備用。參考Yang等[9]和Guo 等[25]的方法，將果實隨機分為2 組，分別浸泡于水（對照組）和0.1 mg/mL 谷氨酸溶液10 min，取出晾干后再將每組果實分別置入含有0 mmol/L 和0.1 mmol/L MeJA 的密閉容器中，處理24 h 后在果實赤道位置穿刺并形成大小深度統一的傷口（直徑3 mm，深2 mm），隨即接種10 μL 鏈格孢菌孢子懸浮液（104CFU/mL）。將處理完成的番茄貯藏于恒溫恒濕箱內（25 ℃，相對濕度約90%），定期觀察記錄果實的發病率。每個處理3個重復，每個重復25 個番茄果實。

1.3.3 茉莉酸路徑相關基因表達量的測定 按照

1.3.2 節所述處理方法，果實經水（對照組）或0.1 mg/mL 谷氨酸溶液處理后，將其貯藏于恒溫恒濕條件下，分別于12，24 h 和48 h 用手術刀切取番茄表皮組織，而后用液氮立即將組織樣品冷凍處理，并放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

參考Yang 等[9]的方法，利用實時熒光定量PCR 方法測定茉莉酸路徑相關基因（SlLOX1、SlAOS2、SlAOC1、SlCOI1、SlJAZ1、SlMYC2、SlPI-II）的表達量。番茄果實組織總RNA 的提取參照RNAiso Plus 試劑盒具體步驟說明進行，并利用超微量分光光度計確定樣品RNA 的質量和濃度，而后借助PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒合成cDNA，保存在-20 ℃冰箱中備用。利用ABI QuantStudio 6 Flex 熒光定量PCR儀進行PCR 反應，其反應條件參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行，并稍作修改：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，然后在60 ℃條件下復性30 s，往復循環42 次；溶解曲線的條件為95 ℃15 s，60℃1 min，95 ℃15 s。

Primer Premier 7.0 軟件（PREMIER Biosoft International）用于設計擴增目的基因引物，引物序列如表1 所示。以SlActin 為內參基因，基因的相對表達量利用2-ΔΔCt方法計算[26]。

表1 番茄果實茉莉酸路徑相關基因引物序列Table 1 Primer sequences of jasmonate pathway related genes in tomato fruits

1.4 數據統計分析

本試驗重復2 次以上直到2 次結果保持一致。試驗數據利用SPSS 19.0 軟件進行Ducan's 多重差異分析，P<0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 外源MeJA 和谷氨酸對番茄果實黑斑病的影響

植物在長期的進化過程中為了應對周圍逆境對其產生的傷害，形成了多重復雜的防御機制。在病原菌或其它化學和物理因子的誘導下，會使得植物體內某些潛在的抗性反應激發出來，進而使其獲得對生物或非生物逆境的抗性[5-8]。為了明確谷氨酸誘導抗性與植物茉莉酸路徑的相關性，利用外源谷氨酸和MeJA 處理番茄果實后觀察其對鏈格孢菌抗性的影響。如圖1 結果顯示，單獨經谷氨酸處理的果實發病率顯著低于對照組，這與前期研究結果一致，谷氨酸作為一種理想的化學誘導因子可以有效提高番茄果實對黑斑病的抗性[9]。然而，果實經MeJA 處理后與對照組的發病率無顯著差異，即使結合谷氨酸也未能進一步降低果實的發病率，推測茉莉酸在谷氨酸誘導番茄對鏈格孢菌的抗性中可能沒有發揮積極作用。

圖1 谷氨酸和MeJA 對番茄果實發病率的影響Fig. 1 Effects of glutamate and MeJA on disease incidence of tomato fruit

2.2 谷氨酸對番茄果實茉莉酸合成路徑的影響

植物體內的茉莉酸是由亞麻酸經LOX、AOS、AOC、OPR 等一系列酶催化和3 個β-氧化反應合成，為了進一步分析谷氨酸對番茄果實茉莉酸路徑的影響，利用實時熒光定量PCR 測定了茉莉酸合成路徑上編碼關鍵酶的基因如SlLOX1、SlAOS2和SlAOC1 的相對表達量。如圖2a 所示，經谷氨酸處理后SlLOX1 基因的轉錄水平在12 h 和48 h 顯著低于對照組，分別為對照的0.66 倍和0.15 倍；SlAOS2 在24 h 和48 h 時也被谷氨酸顯著下調表達，尤其在48 h 時基因相對表達量約為對照組的0.61 倍（圖2b）；對于SlAOC1，圖2c 結果顯示其轉錄水平在整個處理期間被谷氨酸下調。以上結果說明谷氨酸對果實的茉莉酸合成可能有一定的抑制作用。

圖2 谷氨酸對番茄果實茉莉酸合成路徑相關基因表達的影響Fig. 2 Effect of glutamic on the expression of genes related to the jasmonate synthesis pathway in tomato fruits

2.3 谷氨酸對番茄果實茉莉酸信號路徑的影響

在植物體內，茉莉酸作為植物激素或信號分子誘導的一系列反應依賴于其信號傳導路徑。茉莉酸可通過其活性形式JA-Ile 結合COI1 誘導JAZ 降解，進而釋放轉錄因子MYC2，誘導茉莉酸應答基因的表達[23-24]。如圖3a 所示，作為茉莉酸信號系統核心元件之一的COI1，其轉錄水平在谷氨酸的刺激下被迅速強烈下調表達，在12 h 時約為對照組的0.34 倍。對于信號系統的負調控因子JAZ，編碼JAZ 蛋白的SlJAZ1 基因經谷氨酸處理后則上調表達。同時，轉錄因子SlMYC2 在谷氨酸處理24 h 之前其基因表達被顯著抑制，分別為對照組的0.47 倍（12 h）和0.65 倍（24 h）。另外，由茉莉酸誘導的蛋白酶抑制劑SlPI-II 與SlCOI1 變化規律一致，其基因表達水平也被谷氨酸快速下調，在12 h 和24 h 時分別為對照組的0.34 倍和0.50倍。也就是說，谷氨酸處理番茄果實后可能從轉錄水平上抑制了茉莉酸誘導的信號路徑。

圖3 谷氨酸對番茄果實茉莉酸信號路徑相關基因表達的影響Fig. 3 Effect of glutamic on the expression of jasmonate signaling pathway related genes in tomato fruits

3 討論

作為植物體內的一種基本氨基酸，谷氨酸不僅參與多種蛋白或非蛋白氨基酸的合成（如γ-氨基丁酸、脯氨酸和精氨酸等與抗逆性相關的物質），且在響應逆境脅迫中發揮著重要作用。當植物受到外界環境脅迫時，其體內的某些生理代謝過程可能通過谷氨酸相關路徑參與調控，從而增強對各種逆境脅迫的適應性[27]。在鹽脅迫下，植物體內的谷氨酸水平會通過谷氨酰胺合成酶的激活發生變化以應對外界脅迫[28]。在干旱脅迫下，由谷氨酸介導的脯氨酸和γ-氨基丁酸合成路徑會大大增強[29]。在鈣脅迫下，谷氨酰胺合成酶的同工酶被誘導表達以加強谷氨酰胺的合成，同時對不同細胞內的其它氮代謝關鍵酶如谷氨酸合成酶、谷氨酸脫氫酶也有一定影響[30]。然而，關于谷氨酸在植物響應病原菌侵染中的報道還較少。有研究發現谷氨酸還可以作為植物體內一種遠距離傳遞的傷信號分子，同時因其綠色安全、使用方便簡單、成本低廉等優點也被視為一種理想的化學抗性誘導因子，有效激發植物的抗病反應[31]。然而，目前有關谷氨酸對植物的抗性調控機制依然知之甚少。最近的證據顯示，谷氨酸介入了植物激素水楊酸合成和信號路徑，其對病原菌的抗性機制可能部分依賴于水楊酸路徑[12]。前期的研究也證實，番茄果實經谷氨酸誘導處理后其體內的水楊酸合成路徑和信號路徑相關基因上調表達[9]。以上研究促使繼續探究另外一種植物激素茉莉酸在谷氨酸誘導抗性機制中的作用。

本研究中，外源施加谷氨酸可以顯著提高番茄果實對腐生型真菌鏈格孢菌的防御能力，有效抑制病原菌的侵染進程，然而當其結合MeJA 處理則明顯降低了果實的抗性，這暗示茉莉酸可能在谷氨酸的誘導抗性機制中起著負向調控作用。事實上，有研究顯示茉莉酸路徑通過促進番茄植株體內真菌的生長提高了對鏈格孢菌侵染的敏感性，且侵染過程依賴于JAI1 調節的茉莉酸路徑[32]。Egusa 等[33]比較了鏈格孢菌對番茄茉莉酸缺失型突變體DEF1 與野生型植株的侵染能力，發現DEF1 對病原菌的抗性較高，也就是說在番茄與鏈格孢菌互作中，茉莉酸路徑可能促進了寄主的發病過程。為了進一步明確茉莉酸在谷氨酸抗性機制中的作用，本文研究了谷氨酸對番茄果實茉莉酸合成路徑和信號路徑的影響。結果顯示，茉莉酸合成路徑上編碼關鍵酶的SlLOX1、SlAOS2 和SlAOC1 基因表達不同程度的被谷氨酸所抑制。同時，在茉莉酸合成受到抑制的情況下，作為茉莉酸活性形式JA-Ile 受體的SlCOI1 也被谷氨酸顯著下調表達，致使其誘導JAZ 降解的程度下降（Sl-JAZ1 上調表達）。相應地，由于JAZ 無法移除從而釋放轉錄因子MYC2，使得MYC2 轉錄水平也顯著下降?？梢?，谷氨酸處理也抑制了果實中茉莉酸誘導的信號路徑。另外，茉莉酸路徑標志物-蛋白酶抑制劑SlPI-II 基因的下調表達也進一步證明了谷氨酸對茉莉酸路徑的抑制作用。這與前人結果類似，Jia 等[17]和Zhang 等[32]的研究發現番茄植株的茉莉酸不敏感突變體JAI1 對鏈格孢菌的抗性提高可能與茉莉酸路徑上相關基因如LOXD、AOS2、PI-II 的表達受到抑制有關，尤其是PI-II基因在突變體JAI1 中幾乎無表達。張麗平[19]以鏈格孢菌產生的毒素與番茄葉片互作體系為研究對象，揭示了茉莉酸合成路徑和信號路徑正向參與調控了由毒素所誘導的細胞程序化死亡，這有利于以死亡細胞或組織為營養來源的腐生型病原菌的侵染。事實上，植物在應對病原菌侵染時，宿主細胞處于活性還是死亡狀態與谷氨酸代謝相關路徑密切相關[34]。前期研究報道了谷氨酸可以有效誘導谷氨酸代謝路徑（如谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶循環、γ-氨基丁酸支路、三羧酸循環等）上的關鍵酶和基因表達，同時還可以提高抗氧化酶系統活性，也就是說谷氨酸可能是通過激活上述路徑抑制活性氧的大量積累和宿主細胞死亡來抵御腐生型病原菌的侵染[9]。綜上推斷，本研究中谷氨酸可能是通過抑制番茄果實的茉莉酸相關路徑來降低由病原菌誘導的細胞死亡，從而提高果實對鏈格孢菌侵染的防御能力。

4 結論

在番茄果實與鏈格孢菌互作中，谷氨酸對病原菌的抗性機制可能與茉莉酸路徑被抑制有關。有趣的是，前期研究發現經谷氨酸處理的番茄果實其體內的水楊酸路徑被激活，這與水楊酸和乙烯/茉莉酸信號路徑相互拮抗的多項研究報道一致。植物體內的各條激素信號路徑并非孤立存在，而是有錯綜復雜的交談機制，精細調控著植物的防御系統。然而，本文僅對茉莉酸路徑做了初步探討，后續還需對不同植物激素信號路徑之間的互作做進一步的研究，為谷氨酸在農業領域內的商業化應用提供更為充分的理論依據，同時也為控制病害策略提供新的視角。