藍莓花色苷生理活性、提取純化及穩態化研究進展

李梓旋，郭佳婧，蘇東林，單 楊

（1 湖南大學生物學院隆平分院 長沙410125 2 湖南省農業科學院農產品加工研究所 果蔬貯藏加工與質量安全湖南省重點實驗室 長沙 410125）

藍莓（Vaccinium uliginosum L.）是杜鵑花科越桔屬植物，為多年生落葉或常綠灌木，果皮藍色，果肉近白色，呈圓形，口感細膩，甜度適中，籽小皮薄[1]。藍莓富含膳食纖維、類黃酮、多酚、維生素等多種活性物質，是“漿果之王”，被聯合國糧農組織列為人類五大健康食品之一[2]。

花青素是植物界中含量最多的可溶于水的色素之一，是類黃酮化合物中的一個亞類[3-4]，普遍存在于藍莓、紫薯、葡萄和黑米等果蔬中，主要有矢車菊色素、天竺葵色素、芍藥色素、飛燕草色素、牽?；ㄉ?、錦葵色素6 類?；ㄇ嗨亟Y構中含有多個羥基，性質極不穩定，在自然界中主要是通過糖苷鍵與葡萄糖苷、鼠李糖苷、半乳糖苷、阿拉伯糖苷等形成花色苷?；ㄉ站哂锌寡趸?、抗炎、抗癌、降血脂、保護視力等多種功能活性[5]，由于其水溶性強，容易受到水分子的親核攻擊引起褪色，且難以通過被動運輸進入細胞中發揮作用，同時加工過程中的pH 值、溫度、光照、金屬離子、氧化還原劑和糖等也會影響其穩定性。本文綜述了藍莓花色苷的功能活性、提取純化方法和穩態化技術研究進展，以期為藍莓花色苷的高效利用和應用提供參考。

1 花色苷的簡介

1.1 花色苷的結構特性

花青素具有C6-C3-C6 碳骨架結構，其母核為2-苯基苯并吡喃[4]，化學性質活潑，通常以糖苷化的花色苷存在，根據苷元和糖苷配體的不同可形成多種花色苷，其結構如圖1 所示。

圖1 花色苷的基本結構Fig. 1 Basic structure of anthocyanins

1.2 花色苷的理化特性

花色苷可溶于水、乙醇、甲醇等溶劑，在水溶液中以黃鹽陽離子、醌型堿、假堿、查耳酮形式存在，這幾種形式隨水溶液的pH 值變化而發生可逆改變，同時，溶液的顏色也隨結構改變而改變，在酸性條件下呈紅色，在中性條件下呈無色，在堿性條件下呈藍色[6]?；ㄉ站哂? 種不同的吸收波段，分別是465～560 nm 的可見光區和270～280 nm 的紫外光區。

1.3 花色苷的功能活性

1.3.1 抗腫瘤 花色苷離體細胞試驗顯示其具有抗腫瘤活性[7]，主要是通過調控多個基因的表達和激活，其中涉及到了磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（PI3K/AKT）、細胞外信號調節激酶（ERK）、應激活化蛋白激酶（JNK）與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路中的基因?；ㄇ嗨貙ξ改c道癌癥的預防主要是由于其具有抗氧化、抗炎和抗增殖特性，以及其調節基因表達和代謝途徑以及誘導癌細胞凋亡的能力。Xue 等[8]的研究表明，藍莓提取物能夠提高HepG2 細胞的活性氧（ROS）含量，并誘導細胞凋亡，從而將HepG2 細胞阻滯在S期。

1.3.2 保護心血管 花色苷在血管內皮中可通過雙鏈轉運酶進行轉運，激活內皮一氧化氮合酶信號減少氧化應激[9]，可作為血管舒張劑[10]。低密度脂蛋白（LDL）的氧化會導致巨噬細胞白細胞在動脈壁的積累，斑塊破裂將氧化膽固醇沉積到動脈壁上引起動脈粥樣硬化，花色苷能增加血清抗氧化能力從而防止LDL 氧化和預防心血管疾病。

1.3.3 神經保護 腦組織由于需氧量大，且抗氧化防御能力較低，因此對ROS 和活性氮（RNS）特別敏感[11]，花色苷由于具有一個或幾個羥基的芳香環的化學結構，因此使其能夠接受來自ROS 或RNS 的未配對電子，穿過血腦屏障進入腦組織清除自由基，降低患神經退行性疾病和認知能力下降的風險。

1.3.4 減輕氧化應激反應 低濃度活性氧對人體免疫系統、細胞信號傳導和其它正常身體功能很重要，而ROS 過量則會引起細胞損傷，導致炎癥、心血管疾病、癌癥和衰老等退行性疾病[12]。線粒體是細胞內ROS 的主要來源，通過呼吸鏈滲漏電子，ROS 在線粒體中的積累會導致線粒體膜的去極化，在心肌細胞等高能量消耗細胞中，線粒體活性受損會干擾葡萄糖和脂肪酸代謝引起心肌疾病，而花色苷及其代謝物原兒茶酸可以降低線粒體ROS 濃度減輕損傷[13]。

1.3.5 預防肥胖和糖尿病 肥胖是能量攝入和消耗不平衡引起的脂肪組織積累過多，通常與各種代謝紊亂有關，也增加了患2 型糖尿病、心血管疾病、糖尿病、脂肪肝、癡呆和骨關節炎等疾病的風險?；ㄉ湛筛纳浦炯毎δ?，緩解代謝綜合征和肥胖。尤麗等[14]研究發現，藍莓花色苷能提高2型糖尿病模型小鼠糖代謝水平，促進胰島素分泌，減少胰島抵抗，顯著降低總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白LDL 的含量，升高高密度脂蛋白（HDL）膽固醇的含量，且為劑量-效應關系。

1.3.6 調節腸道菌群 腸道菌群的變化被認為是多種疾病的原因[15-20]，如胃腸道疾?。ㄑ装Y性腸?。?、神經系統疾?。ň穹至寻Y和帕金森?。?、代謝綜合征、心血管疾病和糖尿病等?；ㄉ战涍^小腸代謝吸收后，不能被降解的部分（?；幕ㄉ眨M入結腸作為益生元調節菌群，如促進乳桿菌和雙歧桿菌等的定植[21]。Huang 等[22]研究表明灌胃11 周矢車菊素-3-葡萄糖苷【7.2 mg/（kg·d）】和花色苷提取物【8.0 mg/（kg·d）】可以調節高脂肪高糖飲食引起的小鼠腸道菌群變化，增加了門擬桿菌門細菌的豐度，降低了厚壁菌門細菌的豐度。

1.3.7 改善視力 隨著手機和電腦等電子產品的普及，越來越多的人因為用眼過度導致眼酸、眼脹，誘發多種眼部疾病。藍莓花色苷可有效保護眼部微血管、改善血液循環，加速視紫質再生。楊丹等[23]研究表明藍莓花色苷可通過調控PI3K/AKT信號通路蛋白，使糖尿病視網膜病變大鼠的視網膜視野灰度值、黃斑水腫厚度下降，減輕視網膜氧化應激損傷和炎癥反應。

1.3.8 其它功效活性 藍莓花色苷還具有抗衰老[24]、抗疲勞[25]、抗抑郁[26]、提高認知功能[27]等作用。王紫玉等[25]利用含藍莓花色苷的谷物（LH）發酵物灌胃小鼠，結果表明，LH 干預組的小鼠負重游泳時間顯著增加，且體內乳酸的積累量顯著降低，肝糖原儲備量顯著增高。羅麗平等[26]用乙醇提取藍莓花色苷并灌胃抑郁小鼠，可顯著提升抑郁小鼠的糖水偏好，顯著縮短小鼠懸尾時間。Boespflug等[27]研究表明，連續16 周在日常飲食中加入藍莓補充劑，受試者在工作記憶負荷的情況下表現出大腦活動明顯增強。

2 藍莓花色苷的提取與純化

2.1 藍莓花色苷的提取方法

藍莓花色苷的提取方法主要包括溶劑萃取法、酶法提取、微波輔助提取法、超聲輔助提取法、超臨界流體萃取法、超高壓輔助提取法、亞臨界水提取法等，詳見表1。其中，溶劑提取是基于相似相溶的原理，利用甲醇、乙醇、丙酮等有機試劑進行提取，因操作簡單而被廣泛使用，還可輔助酶法和超聲等技術加速細胞結構破壞，促進花色苷釋放，以縮短提取時間和提高提取效率。

表1 藍莓花色苷的提取方法Table 1 Extraction methods of blueberry anthocyanins

2.2 藍莓花色苷的純化方法

經過初提之后的花色苷粗提物通常還有有機試劑和糖類、蛋白質、脂肪等大分子雜質的殘留，因此需進一步純化?；ㄉ占兓姆椒ㄖ饕写罂讟渲兓?、制備型高效液相色譜、離子交換樹脂層析、膜分離法，詳見表2。其中大孔樹脂法因具有價廉、操作簡單、純化效果好等優點而被廣泛使用，同時，也可將多種純化方法聯合使用，逐級分離，獲得高純度花色苷樣品。

表2 藍莓花色苷的純化方法Table 2 Purification methods of blueberry anthocyanins

3 藍莓花色苷的穩態化研究

3.1 花色苷微膠囊化技術

花色苷的活性作用主要取決于其在機體內的生物利用度，由于體內酸堿性環境和酶等的作用，其生物利用度較低?；ㄉ帐紫冉浛跀z入，雖然口腔pH 值為7.4 且含有大量唾液淀粉酶，但由于作用時間較短，因此只有少部分花色苷會被降解，大部分花色苷則進入胃腸道中。胃部pH 值為1～3，因此花色苷能夠穩定存在，只有少量花色苷在鈉依賴性葡萄糖共轉運體1 的作用下以完整的形式被細胞吸收[46]。腸道是花色苷吸收的主要部位，花色苷在腸道pH 值6～7 的環境下發生大量分解，降解產物通過小腸黏膜進入血液，參與體循環，經腸細胞生物轉化后轉運到肝細胞，引起一系列水溶性偶聯代謝產物迅速釋放到肝腸循環系統并隨尿液排出?；ㄉ瘴茨苓M入體循環的降解產物最終進入pH 值為7～8 的結腸中，被微生物分解成小分子的酚酸。多項研究表明，由于花色苷在機體內環境中的不穩定性，使其未達吸收部位就會被降解，攝入富含花色苷的食物或花色苷提取物后，在血漿中檢測到的預測代謝物僅占攝入含量的1%。目前，包埋遞送技術是保護花色苷不被降解和提高生物利用度的有效手段，主要有噴霧干燥、冷凍干燥、乳化、凝膠、層層自組裝、多電解質絡合等。

噴霧干燥是最常用的包埋技術之一，得到的顆粒含水量較低，而干燥過程中設備進風口溫度通常為130～170 ℃，會引起花色苷發生降解[47]，冷凍干燥技術可有效解決以上問題，多項研究表明，冷凍干燥可以更好的保持花色苷的抗氧化活性和穩定性。然而，物料經過冷凍干燥后易結塊，存在粒度難以控制、制備的顆粒滲透性高等問題[47]。

分子包埋法[48]是通過氫鍵、范德華力和疏水作用將一種材料從分子層次上嵌入到另外一種材料中，此法生產的制品，其芯、壁結合牢固，顆粒大小分布均勻，具有較好的穩定性。然而，該方法對內芯材料的要求較高，若芯材超過壁材分子的疏水區容納能力則無法實現芯材的有效包埋。

反溶劑沉淀法[49]是將壁材物質溶解在一種沸點比水低、與水不相溶且易揮發的有機溶劑中，再加入芯材和表面活性劑后形成的油包水型乳狀液。在此基礎上，制備含有膠體穩定劑的水溶液，將油包水乳化液加入其中，揮發去除有機溶劑后凍干獲得微膠囊。此法所制得的微球，其粒徑可達到納米級別，但包埋率低，約達40%。

凝聚微膠囊化是指一種或多種水膠體與初始溶液分離，使用同樣的反應介質，在懸浮或乳化的活性組分周圍沉淀出新的凝聚相，常用的壁材一般為蛋白質、多糖等大分子成分，根據選擇壁材的數量可劃分為簡單凝聚和復合凝聚兩種類型，前者是只有一種壁材，后者則是通過改變溶液的pH值使多糖和蛋白質帶著相反電荷，再利用靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用等聚合形成微膠囊。復合凝聚法具有制備條件溫和、芯材損耗少、包埋率較高、高溫高濕條件下穩定等優點，但存在成本高、僅能包埋不溶于水的芯材等缺點。Shaddel等[50]通過對花色苷進行雙重乳化，形成W1/O/W2型乳液后加入明膠和阿拉伯膠溶液，通過靜電相互作用實現花色苷的高效包埋，其包埋率可以達到81.12%，載藥量為33.53%。

3.2 藍莓花色苷微膠囊化壁材

常見的包埋材料包括乳清蛋白、酪蛋白、明膠、殼聚糖、阿拉伯膠、果膠等，這些成分因具有良好的生物相容性、生物可降解性、成膜性、營養價值，通常被用作生物活性成分的遞送。同時，由于蛋白質和多糖的結構特點，使其在體內能夠對酶、pH 值等條件的改變做出響應，實現芯材的靶向釋放。

3.2.1 多糖 多糖在遞送系統中具有較高的包封效率、高耐酸性、高溶解性和高耐熱性等優點?？捎糜诨ㄉ瞻竦亩嗵侵饕屑讱に豙51]、殼聚糖及其衍生物[52-53]、果膠[54]、黃原膠[55]、麥芽糊精[56]、海藻酸鹽[57]、卡拉膠[58]、硫酸軟骨素[59]等，這些物質的羥基、羧基和氨基等親水官能團可在上皮和黏膜的糖蛋白中與生物分子共價結合；還可通過氫鍵相互作用、疏水相互作用、靜電相互作用等方式和花色苷結合。

由于單一的多糖無法達到穩定花色苷和靶向釋放的效果，因此在包埋過程中多采用2 種或者3 種具有不同性能的多糖進行復合，詳見表3。

表3 用于花色苷遞送的多糖基壁材Table 3 Polysaccharide base wall materials for anthocyanin delivery

3.2.2 蛋白質 蛋白質因具有乳化性、溶解性、凝膠性、生物可降解性、生物相容性等優點可用于花色苷的遞送。目前涉及的蛋白質基遞送系統主要包括乳清蛋白[62]、酪蛋白[63-65]、大豆蛋白[66]、牛血清白蛋白[67]等。在油-水或氣-液界面上，蛋白分子側鏈上的親水基團（如賴氨酸、天冬氨酸或脯氨酸）及疏水基團（如酪氨酸或色氨酸）可在輸送系統中起到乳化劑的作用[58]。由于花色苷和蛋白質之間的非共價鍵、氫鍵、靜電相互作用、范德華力和親核基團之間的共價鍵等可使其自發結合[59]，結合類型取決于花色苷分子的性質以及蛋白質的側鏈基團和酰胺鍵，結合強度可改變花色苷-蛋白質聚集顆粒的功能，詳見表4。

表4 用于花色苷遞送的蛋白質基壁材Table 4 Protein base wall materials for anthocyanin delivery

花色苷與蛋白質結合后能顯著提高其抗氧化活性和穩定性，防止褪色和失活。蛋白質與花色苷的相互作用也可以改變蛋白質的二級結構，從而改善其性能。相比于單一的蛋白質或花色苷分子，二者結合之后形成的顆粒的總粒徑可能會有所增加，在較高的花色苷濃度下，分子之間的相互作用以及基團之間的物理振動和拉伸可能會使得尺寸減小。由于具有較小粒徑的分子更容易被機體吸收，因此在選擇花色苷的包封材料時，粒徑的顆粒之間的分散性應該作為包封效果的評價指標之一。蛋白質基遞送系統容易受到生物機體內蛋白酶的消解作用，蛋白質具有的等電點使其容易受到pH 值的影響發生聚集和沉淀，導致生物利用率下降。Lang 等[65]對比了α-酪蛋白和β-酪蛋白對藍莓花色苷的穩定效果，兩種蛋白均能提高藍莓花色苷在腸道消化過程中的穩定性，保護其抗氧化能力，且α-酪蛋白的效果優于β-酪蛋白。

3.2.3 多糖-蛋白質 單一的包埋壁材并不能完全實現花色苷的控制釋放和靶點遞送，因此可將多種類型壁材復合使用以彌補單一材料的缺陷。如多糖和蛋白質復配的遞送體系中，多糖提供穩定的空間結構來防止蛋白質降解沉淀，蛋白質則提供良好的乳化和溶解作用，協同花色苷發揮生理功效。Cui 等[68]通過酪蛋白（CA）和羧甲基纖維素（CMC）的自組裝制備納米復合物來包埋藍莓花色苷，結果表明配合物Ⅲ（CA-CMC-ACNs）的尺寸最小為209.9 nm，而配合物II（CMC-ACNs-CA）的包埋率（EE）最高（44.23%）。Ma 等[69]使用明膠和殼聚糖包埋藍莓花色苷，包埋率為83.81%，在室溫下穩定，15 d 后的保留率為50%。

4 結語

我國藍莓資源十分豐富，其主要活性成分花色苷雖具有多種功能活性，但存在穩定性差、體內生物利用度低等問題。傳統的花色苷提取純化技術大多集中在有機溶劑提取上，因此，有必要從綠色環保和節能增效兩方面出發，創新花色苷綠色提取純化和穩態化調控技術，實現花色苷功能及應用的品質提升，為促進我國水果產業健康高質量和可持續發展提供參考。