鹽脅迫下氮素對花生種子萌發和種子際細菌菌群結構的調控

徐揚 張瑞英 戴良香 張冠初 丁紅 張智猛

（1.山東省花生研究所，青島 266100；2.山東省招遠市畢郭鎮人民政府，煙臺 265412）

花生是我國重要的經濟和油料作物之一，在國民生產中占有重要地位。隨著社會發展和居民膳食結構的改善，人們對于食用植物油的需求與日俱增。若通過擴大油料作物的種植面積，勢必會加劇糧油爭地的矛盾。我國鹽堿地面積遼闊，約3.6×107hm2［1］，因此，開發鹽堿地是緩解糧油爭地矛盾的可行措施之一?；ㄉ鷮俣箍乒痰魑?，耐瘠抗旱，并具備較強鹽堿耐受能力，是目前較適宜在鹽堿地區種植的經濟和油料作物之一［2-3］。鹽脅迫屬于復合脅迫，其引發的離子毒害和滲透脅迫可顯著抑制種子活力和發芽率，最終降低作物產量［4］。因此，提高鹽堿地花生發芽出苗率是保證鹽堿地花生產業發展的重要前提。

氮是作物生長發育必需的大量元素之一，是植物體內蛋白質、氨基酸、葉綠素等的重要組成成分［5］，也是鹽堿地極度缺乏的重要營養元素之一。因此，提高鹽堿地作物的氮素利用效率，對鹽漬化土壤保肥、作物增產增收具有重要意義［6］。目前，鹽堿地施氮主要涉及作物產量［7］以及養分積累和利用效率等方面的研究［8］。種子萌發前的營養狀況也會直接影響其萌發率和幼苗素質［9-11］，但鹽堿地氮素利用與種子萌發出苗間的關系目前研究較少。有研究發現合理增施氮肥可以提高鹽脅迫下偃麥草屬牧草的發芽率［12］；增施氮素也可提高甜高粱的發芽率，且NH4Cl 的促進效果優于KNO3［13］；低濃度氮肥雖然可以提高鹽角草種子的發芽率，但當氮濃度增加到357 mmol/L 時，發芽率隨氮素濃度增加而降低［14］。

鹽脅迫下適量氮肥施加有助于植物種子的萌發和幼苗的耐鹽，但過量的氮肥供應卻適得其反。因此，合理控制氮肥施加可有效提升作物在鹽環境下的生存。此外，近幾年越來越多的研究顯示，種子際微生物菌群結構與種子的萌發密切相關，鹽脅迫改變花生種子際土壤細菌菌群結構已有報道［3,15］，但鹽脅迫下氮肥施加與種子際菌群結構的關系仍然未知。

本研究以花生品種花育25（HY25）為研究對象，結合不同氮素水平，研究鹽脅迫下不同施氮量對花生發芽率和莢果產量的影響，并結合高通量測序技術進一步對種子際土壤細菌種類和菌群結構進行系統分析，旨在確立鹽脅迫下施氮對花生種子際土壤細菌群落結構平衡、種子發芽率和莢果產量的影響，為鹽堿地花生出苗、高產栽培提供依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

供試花生品種為HY25。供試土壤采自山東省萊西市望城鎮（36.86°N，120.53°E）耕地0-20 cm表層土，土壤類型為褐土，基礎養分：全氮1.21 g/kg、有機質12.8 g/kg、速效氮63.5 mg/kg、速效磷17.1 mg/kg、速效鉀95.3 mg/kg、pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗分別在山東省花生研究所日光溫室和萊西實驗站田間進行，均采用盆栽試驗。

田間盆栽試驗采用直徑32 cm，高26 cm 的盆栽塑料盆，每盆裝土25 kg，裝土、施肥、混鹽（NaCl）后將栽培盆置于溝深10 cm 的畦田中。設置兩種鹽濃度和3 個施氮水平，分別為非鹽脅迫的原土土壤（萊西試驗站田間0-20 cm 土層土壤）和3‰含鹽土壤，均為施用氮肥（尿素）0（N）、90（M）和180（H）kg/hm2三個水平。3‰鹽脅迫處理以NaCl 含量進行調節，NaCl∶土壤=3∶1 000（質量比）；氮肥以尿素形式施入，施氮量分別為不施氮（N）、每盆施氮0.72 g（M，90 kg/hm2）、每盆施氮1.44 g（H，180 kg/hm2）3 個水平［16］。非鹽堿原土和鹽土3 個施氮量處理分別計為不施氮（CN，SN）、施氮90 kg/hm2（CM，SM）、施氮180 kg/hm2（CH，SH），裝盆前將稱好的NaCl 和氮肥以盆為單位與土壤混勻后，每盆灌水3 000 mL 以沉實土壤，自然蒸發至合適土壤墑情備播。選取經晾曬剝殼后飽滿、無破損的花生種子5 kg，用0.5%的次氯酸鈉消毒后，再用無菌水沖洗5-6 次后備用。每盆播種7 粒并將各粒間距均勻分布，播深3 cm，均保持種子橫向播入，待花生出苗后進行間苗，每盆留長勢一致的4 株花生。6 次重復，隨機排列，管理同常規大田，成熟期以盆為單位收獲、考種、計產。

1.2.2 花生種子發芽率統計和種子際土樣的采集 另選用高10.5 cm、上內徑12.5 cm、下內徑8.5 cm 的圓臺形塑料營養盆缽，每缽裝土0.75 kg，鹽脅迫與施氮處理同上。鹽、氮肥與土壤混合均勻后，每缽澆50 mL 無菌水，置于人工氣候室中（25℃，16 h 光照/8 h 黑暗，土壤濕度保持60%-70%）沉實、蒸發、備播。每盆播10 粒種子，均勻分布于每缽的播種土層，每粒種子的間距均保持≤20 mm，播深均為3 cm，保持種子橫向，重復10 次，共播種240 盆。自播種之日起每天進行種子發芽率統計，播種后1 d開始測量不同處理種子下胚軸長度，連續統計10 d。每天隨機選取3 盆進行種子發芽率調查，計算其發芽率（胚根頂破種皮3 mm 視為發芽）。所有試驗進行3 次生物學重復。

種子際土壤樣品采集于播種后3 d 開始，此時大部分種子的胚根已伸出，為胚根伸長期［3］。分別采集不同處理的種子際土壤樣本。各處理以盆缽為單位將其移至滅菌的錫箔紙上，在超凈工作臺上采取各盆缽中種子周圍1-10 mm 土壤，混合均勻后裝入無菌袋中封存。采集的自然空白土壤作為對照（CK），外施氮肥原土種子際土壤樣品分別命名為CNS（氮用量0 kg/hm2）、CMS（氮用量90 kg/hm2）和CHS（氮用量180 kg/hm2）；外施氮肥鹽土種子際土壤樣品分別命名為SNS、SNS 和SHS。每6 盆相同處理所取的土壤樣品混合為1 個生物學土壤重復樣本，共進行3 次生物學重復?？瞻淄寥罉颖痉謩e命名為CK1、CK2、CK3；外施氮肥原土種子際土壤樣品命名為CNS1、CNS2、CNS3，CMS1、CMS2、CMS3，CHS1、CHS2、CHS3；外施氮肥鹽土種子際土壤 樣品命名為SNS1、SNS2、SNS3，SMS1、SMS2、SMS3，SHS1、SHS2、SHS3。上述所有樣品的菌群測序，在北京百邁克生物科技有限公司同批次進行。

發芽率（%）=（發芽種子數/供試花生種子總數）×100%［17-18］。

1.2.3 16S rRNA 測序利 用PowerSoil? DNA Isolation kit（MoBio Laboratories,Inc.,Carlsbad,CA,USA）試劑盒對采集的不同處理土壤樣本提取DNA，并進行濃度（分光光度計）和純度（瓊脂糖凝膠電泳）檢測［19］。以檢測合格的土壤樣品DNA 為模板，利用16S 測序引物338F（Forward primer：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（Reverse primer：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）進行土壤細菌V3-V4 區域擴增。利用MiseqPE300 平臺進行雙端測序，利用FLASH 20 進行序列拼接，用Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME）對原始數據進行質控過濾。最后利用Usearch 平臺（version 7.0，http://drive5.com/uparse/）在相似 性97% 水 平上對序列進行聚類，將相似度高于97%的定義為一個聚類操作分類單元OTUs（operational taxonomic units），通過比對SILVA 細菌16S rRNA 數據庫（Release 119，http://www.arb-silva.de）獲得OTU 分類學注釋，確定不同分類水平［18］。所有16S rRNA 測序的原始序列已上傳NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1013931），序列號為BioProject PRJNA1013931。

1.2.4 生物信息學分析 利用Mothur 軟件（version v.1.30，http://www.mothur.org/）進行細菌群落α 多樣性分析。使用主成分分析（principal component analysis,PCA）、樣本層次聚類分析（hierarchical clustering tree）和ANOIMS 分析完 成β 多樣性 分析［20］。通過RDA（redundancy analysis）預測分析土壤細菌菌群結構與土壤理化因子間的相關性［21］。利用百邁客云數據分析平臺（http://www.biocloud.net/）對細菌16S rRNA 測序數據進行分析。

1.2.5 數據處理 采用SPSS 18.0 軟件中Student’s t-test（P＜0.05）和單因素方差分析（one-way ANOVA）進行統計學方差分析。利用Excel 2003 和GraphPad Prism 7 軟件作圖，圖表中數據為平均值±標準差。

2 結果

2.1 鹽脅迫下氮肥施用量對花生種子萌發的影響

由圖1 可知，正常條件下，各氮肥處理間花生發芽率隨時間變化基本一致，至6 d 時均達100%，但3 d 時CM 和CH 較CN 的發芽率分別提高47.54%和18.17%。與正常條件相比，鹽脅迫處理顯著降低了種子的發芽率。鹽脅迫下不同氮肥用量間的發芽率存在差異，隨施氮量的增加呈先提高后降低的趨勢，SN 發芽速率慢、發芽率低，SM 萌發速率和發芽率均較高，至10 d 時，SN 發芽率最低（65.9%）、SH 次之（76.0%）、SM 發芽率最高（79.3%）。表明鹽脅迫抑制花生種子萌發，施加氮肥可部分緩解這種抑制效果，但過高的氮肥用量對花生種子萌發有負作用。綜上，最適氮肥施用量為90 kg/hm2。

圖1 鹽脅迫下不同氮肥施用對花生萌發的影響Fig.1 Effects of different nitrogen fertilizer applications on peanut germination under salt stress

2.2 鹽脅迫下氮肥施用量對花生產量和產量構成因素的影響

由表1 可知，與正常條件相比，鹽脅迫處理顯著降低了花生莢果產量，SN、SM、SH 各水平的百果重和百仁重分別較對照CN、CM、CH 降低10.87%、10.34%、10.30% 和10.18%、9.10%、10.24%。鹽脅迫下，與未施氮SN 相比，SM 水平的百果重、百仁重和出米率分別增加9.06%、8.85%和7.02%；SH 水平的百果重、百仁重和出米率分別增加9.56%、8.89%和7.44%。綜上，鹽脅迫顯著降低花生產量，施氮可以提高花生產量，由各產量構成因素的綜合提高所致。此外，因高氮與中氮對產量無顯著差異（表1），從經濟環保角度出發，最適氮肥施用量為90 kg/hm2。

表1 不同處理條件下花生產量構成因素統計Table 1 Statistics of yield components of peanut under different treatments

2.3 α多樣性分析

α 多樣性分析可以檢測土壤微生物群落的豐富度和多樣性，其中，稀釋性曲線（rarefaction curve）分析顯示，各樣本在測序量達到1 500 時，所有土壤樣本曲線均趨于平緩，說明測序深度足夠，基本覆蓋所測樣本內的所有物種（圖2-A）。等級豐度曲線（rank abundance curve）能直觀地顯現各樣本中OTUs 的均勻度和豐富度（圖2-B），各物種的相對豐度在不同土壤樣本中按從高到低依次排列，當OTU 數量大于1 250 時，相對應的物種相對豐度較低，但曲線較平緩，物種分布較均勻。物種累計曲線（species accumulation curves）初始表現為急劇上升，由于隨著初始抽樣量的加大，群落中大量的物種被發現，而至1 860 抽樣量時，物種累積速率變得緩慢，曲線不再急劇上升而是趨于平緩，表明抽樣量充分，可進行數據分析（圖2-C）。

圖2 α 多樣性分析Fig.2 α diversity analysis

2.4 β多樣性分析

β 多樣性利用各樣本序列間的進化關系及豐度信息來計算樣本間距離，反映樣本間是否具有顯著的微生物群落差異，其中包括主坐標分析（principal component analysis,PCA），是研究數據相似性或差異性的可視化方法，如圖3-A 所示，正常條件下不同氮肥處理種子際土壤組間CNS、CMS、CHS 與空白對照組CK 菌群相似度大，差異較小，基本分布于同一象限；鹽脅迫下，不同氮肥處理種子際土壤組間SNS 和SMS 較相似，位于PC1 正半軸，SHS 位于PC1 負半軸，差異較大，分布于不同象限。鹽與非鹽處理種子際土壤組間比較顯示，鹽處理3 個組與非鹽處理3 個組差異均較大，分布在不同象限，說明鹽處理對花生種子際土壤細菌菌群結構影響較大。β 多樣性中樣本層次聚類分析（hierarchical clusteringtree）顯示除SHS 外，同一樣本的3 次重復間差異較小，聚集到同一分支，說明3 次平行重復性較好；但鹽與非鹽處理聚集于不同分支，距離較遠，差異較大；而鹽或非鹽脅迫下不同氮素處理組間差異較小，距離較近（圖3-B）。另外，ANOIMS 相似性分析顯示，不同處理組間差異較大，同一處理組內3次重復之間差異較?。≧2=0.348，P=0.001，圖3-C）。由此可知，鹽處理對花生種子際細菌群落結構影響較氮肥處理大，3 次平行重復性好，數據可信度較高。

圖3 β 多樣性分析Fig.3 β diversity analysis

2.5 物種組成及樣本間差異比較

2.5.1 全樣本門水平菌群結構分析 由圖4-A 可見，各條件下的花生種子際土壤樣本均以變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）及芽孢桿菌門（Gemmatimonadetes）等為共有優勢菌門，其相對豐度之和占總菌量的93%以上，但在不同樣本中存在明顯差異。正常條件下，不同氮素處理組間菌群結構差異較??；鹽脅迫下，SMS 和SHS 中變形菌門較無氮處理SNS 提高38.54%和76.69%，放線菌門較SNS 降低10.24%和58.16%。除SHS，鹽處理顯著降低變形菌門的豐度，SNS 和SMS 分別較對照CNS 和CMS 降低51.53%和33.40%；但顯著提高酸桿菌門的豐度，SNS 和SMS 分別較對照不同氮肥處理組提高89.66%和92.31%。另外，SNS 中綠彎菌門的豐度顯著高于CNS，約高25.67%，SMS 中芽孢桿菌門豐度顯著低于CMS，約29.45%；高氮處理SHS 與對照CHS 間無顯著差異。鹽處理改變種子際土壤細菌菌群結構，但是高氮處理可以一定程度上緩解鹽脅迫造成的菌群結構的變化。

圖4 物種組成及樣本間差異比較Fig.4 Comparison of species composition and differences between diverse groups

2.5.2 全樣本綱、目、科水平菌群結構分析 綱水平的分析結果（圖4-B）顯示，不同處理情況下的種子際土壤優勢菌綱均主要為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）、桿菌綱（Bacilli）、擬桿菌綱（Bacteroidia）和梭狀芽孢桿菌（Clostridia）。除SHS處理組，鹽處理顯著降低α-變形菌綱和γ-變形菌綱的相對豐度，但顯著提高放線菌綱的相對豐度。目水平的分析結果（圖4-C）顯示，不同土壤優勢菌目均主要為鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、乳酸桿菌目（Lactobacillales）、微球菌目（Micrococcales）、梭菌目（Clostridiales）、黃色單胞菌目（Xanthomonadales）和uncultured_bacterium_c_Subgroup_6?？扑椒治鼋Y果（圖4-D）顯示，不同種子際土壤鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）相對豐度最高，乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）次之。

2.5.3 全樣本屬水平菌群結構分析 在屬層次上的分析發現，所有菌屬的相對豐度均小于18%，菌屬數量較多，未命名菌屬比例較高，表明花生種子際土壤細菌菌群多樣性高，菌群構成較復雜（圖5-A）。不同土壤優勢菌屬除鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其他均為uncultured_bacterium。鹽處理顯著降低鞘脂單胞菌屬的相對豐度（圖5-A-B），SNS、SMS 和SHS 分別較對照不同氮素處理組降低70.62%、55.77%、17.21%；但乳酸桿菌屬和uncultured_bacterium_f_Micrococcaceae 的相對豐度顯著提高（圖5-A-B），其在SNS 中較對照分別提高73.20%和34.00%，在SMS 較對照提高2.01倍和2.41 倍。鹽脅迫下，不同氮素處理組間屬水平差異較大，SMS 和SHS 中鞘脂單胞菌屬較無氮處理SNS 分別提高41.46%和1.26 倍，乳酸桿菌屬較SNS分別降低18.60%和24.01%。屬水平上，鹽處理與非鹽處理樣品間菌種豐度整體差異較大。

圖5 屬水平物種組成及樣本間差異比較Fig.5 Comparison of bacterial composition and differences between diverse groups at the genus level

2.6 Lefse多級物種差異判別分析樣本間差異

通過對不同處理花生種子際與非種子際土壤間進行不同分類水平上的Lefse 顯著差異分析，結果（圖6）表明，花生種子際與非種子際原土土壤間共有20 個顯著差異細菌，種子際土壤中共有16 個表達豐度具有顯著差異的細菌，CNS 包括Bacillales（芽孢桿菌目、芽孢桿菌科和芽孢桿菌屬）、Gemmatimonadales（芽單胞菌目和芽單胞菌科）、Sphingomonadales（鞘脂單胞菌目、鞘脂單胞菌科、鞘脂單胞菌屬）、Betaproteobacteriales、Burkholderiaceae（伯克氏菌科）和Massilia（馬賽均屬）；CMS 包括Xanthomonadales（黃單胞菌目、黃單胞菌科、溶桿菌屬）、Beijerinckiaceae（拜葉林克氏菌科）和Methylobacterium（甲基桿菌屬）；非種子際原土土壤CK 共有4 個顯著差異細菌，包括Chitinophagales（噬幾丁質菌目、噬幾丁質菌科）、Sphingobacteriales（鞘脂桿菌目）、Ramlibacter（分支菌屬）和uncultured_bacterium_f_Burkholderiaceae。3種不同施氮量種子際鹽土之間共有33 個顯著差異細菌，SNS 種子際土壤中共有22 個顯著差異細菌，包括Lactobacillales（乳酸桿菌目、乳酸桿菌科、乳酸桿菌屬）、Clostridiales（梭菌目、消化鏈球菌科）、Terrisporobacter（土孢桿菌屬）、Solirubrobacterales（土壤紅桿菌目、土壤紅桿菌科）、Nocardioidaceae（類諾卡氏菌科、類諾卡氏菌屬）、Micrococcales（微球菌目、微球菌科、uncultured_bacterium_f_Micrococcaceae）、Prevotellaceae（普雷沃氏菌科）、Intrasporangiaceae（間孢囊菌科和uncultured_bacterium_f_Intrasporangiaceae）和多個未知菌種；SMS 種子際土壤中共有6 個顯著差異細菌，包括Caulobacterales（柄桿菌目、柄桿菌科）、Cytophagales（噬纖維菌目）、Hymenobacteraceae（薄層桿菌科）、Pontibacter（海洋桿菌屬）和未知菌屬uncultured_bacterium_f_Nocardioidaceae；SHS種子際土壤中共5個顯著差異細菌，包括Bacteroidales（擬桿菌目）、Xanthobacteraceae（黃色桿菌科）和未知菌目uncultured_bacterium_c_Subgroup_6。Lefse 多級物種差異判別分析顯示不同處理土壤具有特殊顯著富集菌株。

圖6 Lefse 多級物種層級樹圖Fig.6 Lefse hierarchical tree of species

2.7 花生種子際細菌代謝功能KEGG分析

KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）是指對OTU 豐度表進行標準化處理，以觀測不同樣品間微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化，從而研究種子際菌群為適應環境變化而發生的代謝改變情況。選取每個樣本在各注釋層級上最大豐度排名前25 的功能信息，生成代謝功能相對豐度柱狀堆積圖如圖7 所示。主要的代謝功能有全局與概述圖譜（global and overview maps）、糖代謝（carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）、能量代 謝（energy metabolism）、輔助因子和維生素代謝（metabolism of cofactors and vitamins）、膜轉運（membrane transport）、核酸代謝（nucleotide metabolism）、翻譯（translation）、復 制和修復（replication and repair）和信號轉導（signal transduction）等，占80%以上。一些重要的代謝活動如糖代謝、膜轉運和核酸代謝在鹽脅迫處理的樣本中略有提高，一些重要的應激相關反應如信號轉導和細胞生長與凋亡（cell growth and death）在鹽脅迫處理的樣本中降低（圖7），但施加氮肥后這些應激反應豐度升高，可能與提高種子際菌群的脅迫應激有關，該過程可能是氮肥利用微生物幫助花生種子應對鹽脅迫的重要機制之一。

2.8 環境因子關聯性分析

Redundancy analysis（RDA）分析有助于明確種子際細菌群落與土壤氮和鹽含量之間的關系（圖8）。門水平細菌菌群與土壤鹽（S）和氮（N）含量的關系分析顯示，厚壁菌門、放線菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、Rokubacteria 在S 箭頭的正方向上，與土壤含鹽量成正比；擬桿菌門、芽孢桿菌門、變形菌門、疣微菌門落在S 箭頭的反方向上，與土壤含鹽量成反比；浮游菌門與S 箭頭幾乎垂直，相關性較低。酸桿菌門、Rokubacteria、變形菌門在N 箭頭的正方向上，說明土壤中氮含量越高，這些細菌門的豐富度越高；放線菌門、綠彎菌門、浮游菌門、擬桿菌門、芽孢桿菌門在N 箭頭的負方向上，說明土壤中N 含量越高，這些細菌門的豐富度越低；厚壁菌門和疣微菌門與N 箭頭幾乎垂直，相關性較低（圖8-A）。屬水平細菌菌群與土壤鹽和氮含量的關系分析顯示，擬桿菌屬（Bacteroides）、Escherichia-Shigella（埃希氏-志賀菌屬）、RB41、Clostridium_sensu_stricto_1、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、Terrisporobacter 在S 箭頭的正方向上，與土壤含鹽量成正比；芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘脂單胞菌屬、溶桿菌屬（Lysobacter）在S 箭頭的負方向上，與土壤鹽含量成反比。擬桿菌屬、Escherichia-Shigella（埃希氏-志 賀菌 屬）、RB41、Clostridium_sensu_stricto_1、芽孢桿菌屬、鞘脂單胞菌屬在N 箭頭的正方向上，說明土壤中氮含量越高，這些細菌屬的豐富度越高；乳桿菌屬、Terrisporobacter、鏈球菌屬在N 箭頭的負方向上，說明土壤中氮含量越高，這些細菌屬的豐富度越低；溶酸菌屬與氮箭頭幾乎垂直，相關性較低（圖8-B）。

圖8 RDA 分析Fig.8 Redundancy analysis

3 討論

鹽脅迫通過滲透脅迫、離子失衡和氧化毒害來抑制種子萌發和植物生長，造成作物減產［22］。本研究表明，鹽處理顯著降低了花生發芽率和莢果產量，而施用氮肥可以緩解鹽分對作物生長的抑制作用。隨著施氮量的增加，花生發芽率先升高后降低，表明過高氮素對鹽脅迫下種子萌發起反作用?；ㄉa量隨施氮量增加呈上升趨勢，但高氮與中氮間無顯著差異，表明氮肥的過量施用對花生產量而言也是無益的，只會導致氮肥利用率的下降，但對生態環境構成重大的潛在威脅［23］。本研究經過不同濃度的氮肥施用分析，表明3‰鹽脅迫下花生的最適施氮量為90 kg/hm2。鹽脅迫下，施用NH4NO3能有效緩解木麻黃幼苗受到的鹽害程度，以0.75 g/L NH4NO3處理下幼苗生長生理指標表現最佳［24］；鹽處理后紫花苜蓿相對飼草價值隨著施氮量的增加而增加，以225 和300 kg/hm2氮肥處理最佳［25］；氯鹽脅迫下西瓜生長和生理活性適宜施氮量為0.14-0.18 g/kg［26］。不同植物鹽脅迫下最適施氮量有差異，但合理施氮，能在一定程度上緩解鹽分對植物生長的抑制作用。

種子際是種子表面1-10 mm 內受種子萌發影響且存在相互作用的微區域［27］。種子際細菌可以調控種子的脅迫應答，對種子萌發具有重要影響［28-30］。本研究發現，不同處理下花生種子際優勢菌門均為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門及芽孢桿菌門，與之前報道的花生種子際主要優勢菌門類型相同［3,27］，但是相對豐度排序有差異，推測與不同地區的土壤性質有關。本研究分類到變形菌門在7 個供試土壤樣品中均最多，與前人研究結果相同［27-28］。

種子際土壤中的有益菌株和有害菌株均會影響種子的萌發及幼苗的后續生長。RDA 分析發現，鹽脅迫下的氮肥施加可以顯著提高擬桿菌屬、芽孢桿菌屬、Escherichia-Shigella、鞘脂單胞菌屬的相對豐度。通過氮肥施加，不僅補充了土壤的氮庫，還刺激了鞘脂單胞菌屬的增加［31］，其適應性強，是一類豐富的新型微生物資源，可用于芳香化合物的生物降解［32］，對于土壤中殘留農藥污染修復和地力提升具有重要作用［33-34］。土壤中擬桿菌屬的相對豐度與皂苷類化感物質的含量顯著負相關［35］。因此，擬桿菌屬相對豐度的增加能更有效地降解皂苷類化感物質，緩解連作障礙，有助于降解土壤中化感自毒物質［36］。芽孢桿菌屬具有固氮、磷酸鹽增溶、吲哚-3-乙酸生成能力，能產生抗菌促生物質，促進植物對鈣、鎂、磷等元素的吸收，改良土壤環境，進而促進植物生長和抗逆抗病性［37-39］。溶桿菌屬細菌對線蟲和植物病害具有生防作用，是土壤中的重要有益細菌［40］。鏈球菌屬是常見的化膿性球菌，是降低土壤質量的生物污染源之一［41］。鹽脅迫處理導致有害的鏈球菌屬增多，有益菌株芽孢桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、溶桿菌屬降低，這些菌群結構的變化降低了花生的萌發能力和生長潛力。鹽脅迫下施氮則可提高多種有益菌的相對豐度，其中擬桿菌屬和鞘脂單胞菌屬能夠參與清除土壤中殘留的有毒物質，并產生抗菌促生物質，對土壤修復和地力提升有促進作用。芽孢桿菌屬可以增強土壤中氮磷鉀鈣鎂等營養元素的釋放。

鹽脅迫影響花生種子際菌群的功能豐度譜，糖代謝、膜轉運和核酸代謝在鹽處理樣本中均有所提高。海藻糖和芽子堿被認為是重要的耐鹽增強劑，其含量的提升可能有助于鹽脅迫下的種子萌發［3］。鹽脅迫下，信號轉導和細胞生長與凋亡等脅迫應激活動在施氮后提高。經研究細菌信號轉導豐度的提高，可能與花生耐鹽提升有關［19,42］。另外有報道顯示細胞生長與凋亡途徑與土壤污染物降解和地力提升有關［43］，可能對花生生長和脅迫應答有幫助。因此，鹽脅迫下施氮可能通過調控細菌代謝活動增強花生的脅迫應答能力。研究不同氮肥施用量對鹽脅迫種子際菌群結構的影響，通過有益菌株分離、純化與培養，精細調控菌群配比，為通過種子包衣途徑改善種子際微生態環境，提高種子萌發出苗健苗率和鹽堿地花生生產力提供理論依據和技術支撐。

4 結論

鹽脅迫下適量施氮可以提高花生發芽率和莢果產量，最佳施氮量為90 kg/hm2。合理施氮除提高土壤氮庫外，還能在一定程度上提高土壤中有益菌屬擬桿菌屬、芽孢桿菌屬、鞘脂單胞菌屬的相對豐度，對土壤修復和地力提升有一定的幫助。