迷迭香酸-鋅配合物的抗氧化和抗菌性研究

蔣騁昊，卞晶晶，謝海峰*

1南京醫科大學口腔醫學院，江蘇 南京 210029；2南京醫科大學附屬口腔醫院修復科，江蘇省口腔疾病研究重點實驗室，江蘇省口腔轉化醫學工程研究中心，江蘇 南京 210029

從天然植物中提取的酚類化合物，因其強大的抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒等生物活性而受到廣泛關注，作為天然來源的抗氧化劑具有極大的生物和經濟利用價值［1-2］。由于羧基或羥基的存在，酚類化合物可以與金屬離子配合形成絡合物，優先結合位點受多酚結構、金屬離子類型和周圍介質酸堿度的影響［3］。已經發現配合物的生物學性質在絡合時增強，配合物具有比游離配體更高的生物學效應［4］。例如桑黃素與氧釩（oxovanadium，IV）絡合后提高了對超氧自由基和羥基自由基的清除活性［5］。木犀草素-鐵配合物具有增強的抗氧化和抗炎活性［6］。由此可見，金屬離子與多酚絡合是提高多酚生物活性和生物利用度的重要途徑。

迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）常見于迷迭香、鼠尾草、薄荷等植物中，是一種具有1個羧基、2個帶有鄰苯二酚結構的苯環（A和A’）、不飽和碳碳雙鍵和酯基團的酚酸［7］。RA的生物活性包括抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗過敏、抗腫瘤和神經保護等，通過清除自由基和活性氧在生物系統中表現出強大的抗氧化能力，其抗氧化性高于維生素E［8］。比較多種羥基肉桂酸衍生物的抗氧化性，RA 活性最高（RA>綠原酸>咖啡酸>阿魏酸>香豆酸）［9］。RA通過減少小鼠單側輸尿管梗阻側腎皮質脂質過氧化物的產生而發揮抗氧化應激作用，改善腎間質纖維化［10］。RA 通過調節NF-κB 和JNK、MAPK 信號通路來改善脂多糖誘導的炎癥［11］；可能通過抑制機體炎癥水平和糾正免疫功能紊亂的途徑，加速大鼠口腔潰瘍的愈合［12］。同時RA對多種細菌具有抑制和殺傷作用，如表皮葡萄球菌、葡萄球菌、糞腸球菌等［13］。

金屬離子是人體不可或缺的元素，參與機體各種活動，其中鋅（zinc，Zn）參與2 000 多種轉錄因子的構成，并作為300多種酶的輔助因子［14］。Zn直接或間接介導抗氧化作用，可以結合蛋白質和肽中的硫醇和巰基，保護脂質雙分子層免受氧化，穩定細胞膜［15］。Zn還參與骨細胞的能量代謝，可刺激成骨細胞增殖分化，促進膠原蛋白合成，抑制破骨細胞骨吸收而發揮理想的成骨活性［16］?？咕允荶n最為熟知的特性［17］。已發現多種多酚與Zn離子螯合后，生物活性增強，如槲皮素-Zn配合物增強了抗氧化性，綠原酸與Zn絡合后抗氧化和抗菌水平提高［18-19］。RA 具有可以和Zn 離子結合的羧酸和鄰苯二酚結構，據此推測RA和Zn離子絡合后可能會增強抗氧化性和抗菌性，并促進成骨細胞增殖。

本研究合成了RA 與Zn 的配合物（RA-Zn），并利用掃描電鏡、紅外光譜和紫外-可見光譜分析合成前后的結構。選定4 種多酚（漆黃素、葒草苷、RA、丹參酚酸B），利用細胞增殖實驗評價它們對成骨細胞的增殖作用，同時評價RA-Zn 和RA 的促細胞增殖作用、抗氧化性和抗菌性，為探究RA-金屬配合物的生物活性機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

RA（純度>95%）、氯化鋅（ZnCl2）（上海麥克林公司）；CCK-8 試劑盒（Cell Counting Kit-8，Dojido 公司，日本）；α-MEM 培養基（Gibco公司，美國）；4%青霉素和鏈霉素（杭州碧云天公司）；胎牛血清（FBS，ExCell 公司，烏拉圭）；LB 液體培養基（上海阿拉丁公司）；小鼠顱骨前成骨細胞系MC3T3-E1（中國科學院上海細胞所）；金黃色葡萄球菌S.aureus（ATCC 25923，南京醫科大學江蘇省口腔疾病研究重點實驗室樣本庫）；總抗氧化能力檢測試劑盒2，2-聯氮-二-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽［2，2′-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS］（杭州碧云天公司）；掃描電子顯微鏡（MAIA3，TESCAN 公司，捷克）；微孔板分光光度計（PerkinElmer，Waltham公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 RA-Zn的合成

RA溶于10 mL無水乙醇中，使其濃度為0.01 mol/L，加入0.01 mol/L 的ZnCl2水溶液5 mL，采用NaOH 調節pH為8.5，室溫下反應24 h，3 500 r/min離心10 min，去除上清液，無水乙醇洗滌3次后，干燥得到RA-Zn。

1.2.2 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察

利用SEM拍攝RA和RA-Zn的表觀圖像。

1.2.3 紅外光譜分析

使用溴化鉀（KBr）將樣品制備為顆粒，并在400～4 000 cm-1范圍內監測RA和RA-Zn的紅外光譜。

1.2.4 紫外-可見光譜分析

利用NanoDrop 紫外光分光光度計記錄RA 及RA-Zn 的紫外可見光譜。采用摩爾比法確定Zn 離子與RA 的摩爾比。RA 和ZnCl2溶解于三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）緩沖液（pH=8.5）中，濃度為0.01 mol/L，通過保持RA的量不變而改變Zn離子摩爾量，使摩爾比［RA］∶［ZnCl2］=1∶0、10∶3、5∶2、2∶1、5∶3、20∶13、10∶7、5∶4、20∶17、10∶9、20∶19、1∶1、2∶3、5∶9、1∶2，記錄具有不同摩爾比溶液的光譜。

1.2.5 細胞增殖實驗

將MC3T3-E1 細胞以3 000 個/孔的密度分別接種在具有不同濃度（0、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L）的漆黃素、葒草苷、RA、丹參酚酸B的96孔板中，培養1、3 d 后吸出培養液，每孔加入100 μL含10%CCK-8的新鮮培養基，避光孵育2 h，在450 nm波長下測量吸光度值。以同樣的方法檢測RA和RA-Zn（100 μmol/L）培養1、3、5 d后的成骨細胞增殖情況。

1.2.6 ABTS法檢測RA和RA-Zn的抗氧化活性

分別取10 μL 200 μmol/L 的RA 和RA-Zn 與170 μL ABTS 工作溶液反應6 min。用微孔板分光光度計測量414 nm 處的吸光度值。使用濃度為0.15～1.50 mmol/L 的水溶性維生素E（Trolox）標準溶液建立標準曲線，比較樣品的抗氧化能力。

1.2.7 鐵還原抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）測定檢測RA 和RA-Zn 的抗氧化活性

分別取5 μL 200 μmol/L濃度的RA和RA-Zn與180 μL FRAP 工作溶液反應5 min。用微孔板分光光度計測量593 nm 處的吸光度值。使用濃度為0.15～1.50 mmol/L 的FeSO4水溶液建立標準曲線，計算樣品的抗氧化活性。

1.2.8 最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）法檢測RA和RA-Zn的抑菌作用

采用MIC 法研究了RA 和RA-Zn 對金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）生長的抑制作用。100 μL金黃色葡萄球菌（濃度為1×106CFU/mL）分別與100 μL不同濃度的RA 和RA-Zn 一起接種在96 孔板中，并在37 ℃、120 r/min 條件下孵育24 h。孵育后，在分光光度計中測量600 nm處的吸光度值。

1.3 統計學方法

所有實驗數據使用GraphPad Prism8 和Origin軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey’s 或Dunnett’s 檢驗。所有實驗至少重復3次，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 合成的RA-Zn的結構

RA 是由1 個羧基、2 個帶有鄰苯二酚結構的苯環、不飽和碳碳雙鍵和酯基團組成，其中羧基和鄰苯二酚結構參與Zn2+絡合，RA-Zn的可能結構如圖1所示。

圖1 RA-Zn配合物的合成Figure 1 Synthesis of RA-Zn complex

2.2 SEM分析

通過SEM 觀察到RA 結構比較松散，RA-Zn 則形成更大更均勻的晶體（圖2）。

圖2 RA和RA-Zn的SEM圖像Figure 2 SEM images of RA and RA-Zn

2.3 紅外光譜分析

RA 的紅外吸收光譜中觀察到羧酸的-OH 在3 514～3 160 cm-1內（圖3），而在RA-Zn中減少，表明羧酸的羧基參與RA-Zn絡合。在RA光譜中1 725 cm-1處代表羧基振動的譜帶在RA-Zn 中消失，同樣提示RA中羧酸結構參與金屬螯合反應。

圖3 RA和RA-Zn的紅外光譜圖Figure 3 Spectra of RA and RA-Zn detected by Fourier transform infrared spectosopy

2.4 紫外-可見光譜分析

為了研究RA-Zn 的組成，應用了摩爾比法。隨著RA/Zn2+摩爾比的增加，282、326 nm 處的譜帶強度增加，在374 nm 處又出現了新的譜帶（圖4），代表金屬與酚的相互作用，表明鄰苯二酚結構參與了金屬離子配位。通過摩爾比法繪制在λ=374 nm 處的不同摩爾比RA/Zn的吸光度曲線。RA/Zn的比例接近2，證明兩者的摩爾比為2。

圖4 不同摩爾比RA/Zn的紫外-可見光譜Figure 4 UV-Vis spectra of RA/Zn with different molar ratios

2.5 細胞增殖活力分析

觀察4種多酚作用第1天和第3天影響MC3T3-E1細胞增殖的情況，結果表明1×10-4mol/L 的RA 促進細胞增殖的作用最明顯（圖5A），優于其他3 種多酚（漆黃素、葒草苷、丹參酚酸B），作用第5 天RA-Zn促進細胞增殖的效果優于RA（P<0.05，圖5B）。

圖5 CCK-8法檢測細胞增殖情況Figure 5 Cell proliferation detected by the CCK-8 assay

2.6 RA和RA-Zn的抗氧化活性分析

通過ABTS+的清除評估RA 和RA-Zn 的供氫能力，200 μmol/L RA-Zn 具有比RA更高的ABTS+陽離子自由基清除水平，約是RA 的2 倍（圖6A）。通過RA和RA-Zn將Fe3+還原為Fe2+的能力評估其抗氧化性，200 μmol/L RA-Zn 具有比RA 更好的還原能力（圖6B），差異有統計學意義。

圖6 RA和RA-Zn的抗氧化活性測定Figure 6 Determination of antioxidant activity of RA and RA-Zn

2.7 比較RA和RA-Zn的MIC

圖7 為MIC 法研究不同濃度的RA 和RA-Zn 對金黃色葡萄球菌的生長抑制情況。RA 濃度為25～200 μmol/L 時，細菌生長沒有顯著變化，RA≥400 μmol/L 時抑制細菌生長的作用，與對照組比較差異才有統計學意義（P<0.05，圖7）。但RA-Zn≥25 μmol/L時，抑制細菌生長的作用與對照組比較差異就有統計學意義（P<0.05，圖7），并有劑量依賴性，抗菌效果優于RA。

圖7 MIC 法測定RA 和RA-Zn 對金黃色葡萄球菌的生長抑制作用Figure 7 Determination of the growth inhibitory effects of RA and RA-Zn on Staphylococcus aureus using MIC method

3 討論

酚類化合物的結構多種多樣，從簡單的酚酸（如阿魏酸、沒食子酸和咖啡酸）到單寧和類黃酮等多酚。它們可通過酚的活性羥基轉移氫原子來清除自由基，與促氧化金屬螯合和引導酶失活或活化等途徑發揮抗氧化作用，以對抗多種疾病，包括糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化等［20］。多種多酚與金屬絡合后其性能增強，應用范圍擴大。在骨組織工程中，許多類黃酮金屬配合物在促進血管生成、增強成骨細胞分化和礦化方面具有巨大前景，如水飛薊賓-Zn 配合物通過調節miR-590/Smad7 信號通路促進成骨細胞分化，同時表現出促血管生成和抗菌性［21］。槲皮素與銅絡合后促進成骨細胞分化和血管生成［22］。

RA 作為天然的多酚化合物，已被證明可以通過RANKL/RANK/OPG 途徑促進成骨細胞分化和礦化［23］，本研究中的細胞增殖實驗結果表明其比漆黃素、葒草苷和丹參酚酸B 具有更好的促成骨細胞增殖作用，表明RA 具有在骨組織工程中應用的強大潛力。已有研究探索了RA與堿金屬（鋰、鈉、鉀）結合后的結構及抗氧化活性，結果表明配合物抗氧化性提高，其中與鈉結合后抗氧化性最高［24］。選擇合適的金屬離子對提高生物活性非常重要，得益于Zn離子的抗氧化、促成骨和抗菌等作用，RA 與Zn2+絡合后的生物活性得到進一步增強。紅外和紫外光譜結果表明RA的鄰苯二酚和羧基結構參與絡合Zn離子，兩者摩爾比值為2，也證實了RA-Zn的成功合成。兩者結合發揮協同效應，RA-Zn 可進一步促進成骨細胞增殖，其ABTS+自由基清除活性約是RA的兩倍，還原Fe3+的能力強于RA，因此RA-Zn 的抗氧化性增強，同時抑制金黃色葡萄球菌的能力也顯著提升。過高濃度的Zn 離子將通過促進細胞內活性氧過量產生誘導細胞凋亡，不利于細胞黏附增殖，因此適當的Zn 離子對生物安全至關重要［25］。RA與Zn 的絡合為引入Zn 離子提供了便利且有效的途徑，可避免過高濃度Zn 離子的釋放，生物安全性得到了保障。RA 和Zn 離子的絡合是相互促進的正效應，但是，過量的RA-Zn 對機體可能會產生不利影響，需要嚴格把控使用濃度，這需要進一步的探索。

生物體內的過量自由基可能導致蛋白質、核酸、脂質等分子的損傷，從而破壞細胞穩態和促進凋亡，除了機體內產生內源性抗氧化分子抵抗氧化損傷，通過食物或外源性補充抗氧化劑是對抗氧化應激相關疾?。ㄌ悄虿?、心臟病、高血壓、癌癥和退行性疾病等）的有益途徑［26］。同時，由于目前抗生素的過度和不當使用，對新型抗菌劑的需求不斷提升，而天然來源的抗菌劑被視為一種有前途的解決方案［27］。RA-Zn是新型抗氧化劑和抗菌劑的有力候選者，它對成骨細胞的促進增殖作用提示其可能在骨組織工程中有潛在應用價值，可將其添加到口腔種植體材料表面、生物支架、水凝膠等材料內以促進骨再生，這需要進一步研究。

綜上所述，RA 和Zn 之間存在協同抗氧化和抗菌潛力，兩者絡合后產生了一種新的復合物，相比RA，復合物消除ABTS+自由基、還原Fe3+和抑制金黃色葡萄球菌的能力增強，同時表現出更強的促進成骨細胞增殖作用，配合物可以作為單個生物活性劑，或應用至各種生物材料中以增強抗氧化或抗菌能力，但仍需要未來進一步研究。