基于可降解兩性離子聚碳酸酯納米膠束的設計合成及其血液長循環研究

張 平，徐云燕，陳 瑩，王 可，陳 維，張慶明*

1東部戰區總醫院藥劑科，江蘇 南京 210002；2中國藥科大學工學院，江蘇 南京 210009

納米載體遞送化療藥物在腫瘤治療領域具有獨特優勢：增強難溶性藥物的溶解度和穩定性；提高藥物在體內的靶向分布，增加藥物生物利用度；減少藥物不良反應。然而，納米遞送系統在腫瘤治療過程中仍然存在不足之處：納米顆粒在進入體內血液循環時易被單核吞噬系統清除；同時在進入體內后，納米粒子表面會被血液中復雜的蛋白成分所吸附，導致“蛋白冠”的形成，使納米粒子的穩定性降低，易被網狀內皮系統清除［1-6］，極大降低納米顆粒在腫瘤組織和腫瘤部位的有效富集。

為了解決納米粒子體內循環時間短的問題，其表面修飾親水性配體的策略應運而生。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）因其良好的水化能力和一定程度的生物惰性被認為是改善納米藥物藥代動力學特性的“金標準”試劑，其在納米體系中作為首選載體得到了研究者的普遍關注［7-9］。研究表明，PEG 修飾的納米顆粒不僅表現出優異的穩定性，還具有良好的蛋白抗性和較長的血液循環時間等性能。然而，PEG 易受氧化損傷，在反復注射后容易產生抗PEG特異性抗體，使得PEG化納米藥物在體內被快速清除，因此嚴重限制了PEG化納米藥物的臨床應用［10-12］。

兩性離子因其超強的親水性和抗污性能，被作為PEG 的替代品而受到廣泛關注［13-17］。與PEG 相比，兩性離子通過離子溶劑化作用實現了比PEG更強的水合作用，不僅減少了在血液循環中與血清或血小板等生物介質的非特異性吸附，抵抗細菌或哺乳動物細胞黏附，逃脫了機體的免疫反應，并且長期使用不會產生免疫抗性［18-22］。Wang 等［23］開發了一種基于樹枝狀低聚賴氨酸的兩性離子大分子，用于蛋白質的包裹與遞送，兩性離子表面化修飾大幅度改善了蛋白質藥物的血液循環時間。Yin等［24］報道了一種低氧敏感的兩性離子聚乙烯亞胺納米系統用于光動力（photodynamic therapy，PDT）治療及紫杉醇的遞送，基于表面甜菜堿兩性離子功能化修飾，有效延長納米粒子的血液循環時間，進而增加其在腫瘤中的富集，高效抑制腫瘤生長和轉移。此外，Zhao等［25］合成了基于可降解超支化聚碳酸酯的超小兩性離子納米膠束用于紫杉醇的遞送，表面甜菜堿兩性離子功能化修飾延長了納米藥物的血液循環時間，并增加在腫瘤部位的富集，顯著提高了乳腺癌的治療效果。

然而，超支化兩性離子聚合物的合成過程比較復雜，且結構表征難度較大。本研究開發了一種簡易便捷的實驗方案，可直接通過開環聚合和Michael加成后聚合修飾，簡化可降解兩性離子聚碳酸酯的合成過程。通過自組裝形成的兩性離子納米膠束可降低納米藥物的非特異蛋白吸附并延長體內循環時間。

1 材料和方法

1.1 材料

雙（雙三甲基硅基）胺鋅（97%，Aldrich 公司，美國），紫杉醇（paclitaxel，PTX，98%，上海安耐吉試劑公司）；甲氧基聚乙二醇（PEG，Mn=5 000，Fluka 公司，美國）經甲苯共沸蒸餾除水后使用；己內酯（εcaprolactone，ε-CL，98%，Fluka公司，美國）經氫化鈣（CaH2）干燥減壓蒸餾后使用；異丙醇經常壓蒸餾取中間段餾分。丙烯酸酯環碳酸酯單體（acryloyl cyclic carbonate，AC）、巰基化羧基甜菜堿（thiolatedcarboxybetaine，TCB）和巰基化寡聚乙二醇［oligo（ethylene glycol），OEG］根據前期研究文獻合成［25-26］。

1.2 方法

1.2.1 聚合物的合成

稱取AC（0.50 g，2.5 mmol）和異丙醇（3.8 mg，0.063 mmol）置于Schlenk 瓶，加入6 mL 無水二氯甲烷（dichloromethane，DCM）充分溶解原料，然后滴加催化量雙（雙三甲基硅基）胺鋅，密閉攪拌反應12 h后，滴加冰醋酸終止反應，反應液置于冰乙醚中沉淀、過濾并真空干燥后得到聚丙烯酸酯碳酸酯（polyacrylate carbonate，PAC），收率為85%。產物經高分辨核磁共振譜儀（ECX 400，Bruker 公司，德國）測定核磁氫譜圖（400 MHz，CDCl3）。接著，將PAC（0.10g，0.012 5 mmol）溶于N，N-二甲基甲酰胺（N，Ndimethylformamide，DMF），TCB（0.23 g，1.0 mmol）溶于甲醇，向上述混合體系中加入催化量三乙胺，50 ℃反應過夜。反應結束后，將反應液置于甲醇中透析8 h后濃縮至3 mL，濃縮液置于冰乙醚中沉淀、離心分離并真空干燥后得到聚合物PAC（TCB）（收率為70%）。按照PAC的聚合方法，先后投入AC和ε-CL 單體，通過開環聚合得到PAC-PCL 嵌段聚合物（收率為83%）；同時以PEG 為大分子引發劑，成功得到PEG-PCL 嵌段聚合物（收率為85%）。按照PAC（TCB）Michael 加成后聚合修飾方案，成功得到寡聚乙二醇修飾的聚合物PAC（OEG）和甜菜堿兩性離子修飾的聚合物PAC（TCB）-PCL。所有聚合物化學結構經核磁共振氫譜驗證。使用凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）來測定聚合物的分子量與分子量分布。

1.2.2 聚合物膠束的表征與穩定性測試

PAC（TCB）納米膠束的制備采用溶劑置換法。將PAC（TCB）聚合物充分溶解在DMF/MeOH的混合試劑（體積比1∶1）中，超聲條件下，將1 mL去離子水逐滴加入100 mL聚合物溶液中，然后經過去離子水透析10 h后得到PAC（TCB）膠束。PAC（OEG）、PAC（TCB）-PCL 和PEG-PCL 納米膠束采用與PAC（TCB）相同的制備方法得到。所有納米膠束利用動態光散射（dynamic light scattering，DLS）儀（安東帕公司，奧地利）測量納米顆粒大小。納米膠束的蛋白穩定性實驗通過向納米膠束溶液中加入10%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA），再利用DLS以觀測24 h后的納米膠束粒徑變化。

1.2.3 細胞毒性測試、溶血實驗

采用MTT 法，以人宮頸癌細胞（HeLa）為模型，測試聚合物PAC（TCB）和PEG-PCL的細胞毒性。將HeLa細胞接種于96孔板（細胞密度為1.0×104個/孔），置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養過夜，加入不同濃度的PAC（TCB）、PEG-PCL 溶液，繼續培養48 h后，每孔加入MTT試劑，繼續培養4 h，最終利用酶標儀進行紫外吸光度檢測。

紅細胞破裂法評價兩性離子PAC（TCB）膠束的溶血毒性。將新鮮小鼠血液離心并收集紅細胞，經PBS 洗滌5 次后，用無菌的0.9%生理鹽水將0.2 mL的紅細胞稀釋至4 mL（5%血細胞比容）。接著，將不同濃度的納米膠束溶液加入到100 mL 稀釋好的紅細胞溶液中，37 ℃4 h 后，離心并收集上清液，用紫外分光光度計檢測吸光度（λ=542 nm）。蒸餾水、0.9%的生理鹽水孵育稀釋的紅細胞懸浮液分別作為陽性對照和陰性對照。溶血百分比計算公式如下：

溶血率（%）=（Dsample-DNegative）/（DPositive-DNegative）×100%（其中Dsample為納米膠束孵育后上清液的紫外吸光度值，DNegative為0.9%生理鹽水孵育后上清液的紫外吸光度值，DPositive為蒸餾水孵育后上清液的紫外吸光度值）。

1.2.4 細胞攝取實驗

HeLa 細胞以1.0×105個/孔的密度鋪于24 孔板中，置于含5%CO2、恒溫37 ℃細胞培養箱中培養過夜，每孔加入Cy5 標記的納米膠束溶液（4 mg/mL，50 mL），繼續孵育1 h和6 h，通過熒光顯微鏡觀察細胞對納米粒子的內吞行為。同時，采用流式細胞儀定量分析細胞對不同納米膠束的內吞能力。

1.2.5 體內長循環實驗

采用體重220～400 g ICR 雄鼠為模型，按照18 mg/kg 的劑量尾靜脈注射納米膠束溶液，在不同時間點（0.2、0.5、1、2、4、8、26 h）通過眼眶取血收集血樣。加入裂解液（1% Triton X-100）和有機試劑DMF，放入37 ℃搖床內過夜。離心并收集上清液，酶標儀檢測熒光強度（掃描范圍649～680 nm）。

1.3 統計學方法

數據分析使用GraphPad Prism軟件進行，數據使用均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用Student-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩性離子聚碳酸酯PAC（TCB）的合成

以AC 為單體，異丙醇為引發劑，在雙（雙三甲基硅基）胺鋅的催化下，發生開環聚合反應得到了分布較窄的PAC 聚合物（聚合物分散指數為1.3）；TCB 分子通過Michael 加成反應修飾到聚合物PAC的雙鍵側鏈上，得到聚合物PAC（TCB）（圖1）。核磁氫譜結果顯示（圖2A），根據異丙醇端甲基（δ 1.1）和側鏈上雙鍵（δ 6.3）的峰面積積分比得到PAC 分子量為8 000；PAC（TCB）聚合物側鏈上的雙鍵完全消失（圖2B），表明TCB 成功接枝到聚合物PAC 上，通過計算得到聚合物PAC（TCB）的分子量為22 000。此外，PAC-PCL、PAC（TCB）-PCL和PEG-PCL聚合物同樣通過開環聚合和Michael 加成后聚合修飾成功合成，分子量分別為8 200、11 500和11 300，聚合物分散指數分別為1.34，1.40和1.21。

圖1 PAC（TCB）聚合物的合成路線Figure 1 Synthetical route of PAC（TCB）polymer

圖2 PAC聚合物（A）和PAC（TCB）聚合物（B）的核磁共振氫譜圖Figure 2 1H-NMR spectra of PAC polymer（A）and PAC（TCB）polymer（B）

2.2 膠束的表征與穩定性

膠束溶液采用溶劑交換法制備得到。PAC（TCB）和PAC（OEG）膠束的水合粒徑分別約為160 nm 和250 nm（圖3A），兩性離子型納米膠束粒徑略小于PEG 類，這是因為兩性離子基團的水合能力比PEG更強。為了觀察膠束與蛋白的相互作用力，分別向PAC（TCB）、PAC（OEG）、PEG-PCL 和PAC（TCB）-PCL 膠束溶液中加入10%的BSA 水溶液，加入BSA溶液后的PAC（TCB）和PEG-PCL膠束大小均無明顯變化，顯示較好的膠體穩定性；然而其余兩組膠束的粒徑發生很大變化（圖3B）。與PAC（TCB）-PCL膠束相比，PAC（TCB）與蛋白相互作用效果更弱，可能是由于多個疏水嵌段PCL 增加了疏水組分與蛋白之間的非特異性相互作用。此外，與PAC（OEG）和PEG-PCL膠束溶液相比，PAC（TCB）粒徑最為均一，說明其抗蛋白吸附能力最強，且TCB 表面親水能力強于OEG，納米膠束表面形成緊密的水合層可有效阻礙蛋白的非特異吸附?；诘鞍追€定性的考慮，選用PAC（TCB）和PEG-PCL 膠束作為研究對象，且通過DLS測定其表面電位分別為-4.6 mV和-1.2 mV。

圖3 DLS測定聚合物膠束粒徑分布和聚合物膠束的粒徑變化Figure 3 Size distribution of polymeric micelles and size changes of polymeric micelles determined by DLS

2.3 細胞毒性、溶血實驗分析

MTT 法評價納米膠束的細胞毒性，PAC（TCB）和PEG-PCL 膠束作用HeLa 細胞48 h 后，HeLa 細胞的存活率均在80%以上，說明PAC（TCB）與PEG-PCL 膠束濃度低于500 mg/mL 時，細胞毒性均較低，且兩組差異均無統計學意義（P＞0.05，圖4A）。為了研究PAC（TCB）納米膠束的溶血率，將不同濃度的納米膠束與紅細胞共孵育4 h，兩組差異有統計學意義（P＜0.05），但兩種膠束的溶血率均在5%以下（圖4B），表現出良好的生物相容性。

圖4 不同濃度的PAC（TCB）和PEG-PCL膠束在Hela細胞中的細胞毒性（A）和在小鼠血液中的溶血率（B）Figure 4 Cytotoxicity in Hela cells（A）and hemolysis percent in mouse blood（B）treated with PAC（TCB）and PEG-PCL micelles at various concentrations

2.4 細胞攝取

熒光顯微鏡和流式細胞儀評價細胞對納米膠束的攝取能力。PAC（TCB）處理后的細胞熒光強度較PEG-PCL 組強（圖5A），表明腫瘤細胞HeLa 對兩性離子修飾的納米膠束具有較強的內吞作用。流式細胞儀定量結果顯示腫瘤細胞HeLa 對PAC（TCB）膠束的攝取能力明顯強于PEG-PCL（圖5B），這一趨勢與熒光顯微鏡的觀察結果一致。由于兩性離子表面密集的正電荷與細胞膜表面的負電荷相互作用可顯著促進腫瘤細胞的攝取能力，所以兩性離子對腫瘤細胞的穿透力比PEG強。

圖5 Cy5標記的PAC（TCB）和PEG-PCL膠束在Hela細胞內的攝取Figure 5 Cellular uptake of Cy5-labled PAC（TCB）and PEG-PCL micelles in Hela cells

2.5 藥代動力學實驗

為了探索膠束的體內循環特性，研究了PAC（TCB）和PEG-PCL 膠束在大鼠體內的藥代動力學行為。如圖6 所示，PAC（TCB）組、PEG-PCL 組第1 次尾靜脈注射的代謝半衰期分別為12.97、9.18 h，這是由于PAC（TCB）較PEG-PCL 有更強的抗蛋白吸附作用。PAC（TCB）組經過2、3次注射后膠束的血液循環時間依然較長（半衰期分別為8.58、6.51 h），而PEGPCL組血液中膠束的含量明顯下降（半衰期分別為4.03、2.09 h），這是由于PEG 的抗蛋白吸附能力較弱，血液中蛋白誘導的非特異吸附作用降低了PEG 化膠束的穩定性，導致PEG 化膠束被快速清除。本研究表明PAC（TCB）膠束在多次應用后依舊保持優越的體內代謝穩定性，可作為PEG 的替代品，彌補PEG 在臨床應用中的不足。

圖6 PAC（TCB）膠束（A）和PEG-PCL膠束（B）的血液循環曲線Figure 6 Blood circulation profiles of PAC（TCB）（A）and PEG-PCL（B）micelles

3 討論

傳統的納米藥物存在穩定性差、血液循環時間短和免疫原性等問題，因此擁有良好穩定性的納米載體在藥物遞送過程中具有重要意義，本研究通過開環聚合反應和Michael加成后聚合修飾，合成得到可生物降解的羧酸甜菜堿型兩性離子聚碳酸酯共聚物PAC（TCB），采用溶劑交換法制備得到穩定性良好的160 nm膠束。

納米膠束的穩定性是血液長循環的關鍵因素。研究報道，稀釋后結構穩定的納米膠束較粒徑變化大的膠束血液循環時間更長［25］。本研究設計的膠束在加入BSA 溶液稀釋后，粒徑無明顯變化，證實了PAC（TCB）膠束的結構穩定性。

除了穩定的結構，強親水性和抗污性能也是血液長循環的關鍵因素。PEG 修飾的納米藥物由于良好的水化能力和生物惰性，表現出血液長循環能力［7-9］，然而其反復注射后易產生抗體效應及易形成“蛋白冠”被清除等，嚴重限制了PEG化納米藥物的臨床應用［10-12］。既往研究表明兩性離子不僅能夠延長循環時間，而且長期使用不會產生免疫抗性［18-22］。體內藥代動力學試驗證實本研究設計的PAC（TCB）納米載體經多次注射后仍有著顯著的低免疫原性，延長了血液循環時間。

納米藥物能否被腫瘤細胞高效攝取，是腫瘤治療的重點之一。細胞內吞和毒性實驗結果表明，腫瘤細胞攝取PAC（TCB）膠束的效率高，其生物相容性好；高濃度的PAC（TCB）納米膠束的溶血率依然低于5%，細胞存活率高于83%，具有良好的生物相容性，可作為體內藥物遞送的優良載體。綜上，本研究結果表明PAC（TCB）納米載體具有高穩定性和體內長循環性，且多次注射后不會產生抗體效應，在藥物遞送方面具有巨大的潛力。