改良球囊損傷聯合高脂飲食建立兔腹主動脈粥樣硬化模型

華 芮，李 宸，雍 輝，林清霞，董 舟，呂 展，李春堅

南京醫科大學第一附屬醫院心內科，江蘇 南京 210029

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以脂質代謝障礙為基礎、血管內壁脂質沉積為特征的慢性、進行性動脈血管病變，嚴重危害人類生命健康［1-3］。AS斑塊破裂，可繼發血栓形成，從而造成組織嚴重缺血、缺氧、甚至壞死［4-5］。建立動物模型，進一步研究AS的發病機制，對預防心血管事件有重要意義。

兔是建立AS 模型常用的動物之一。目前研究多采用球囊損傷聯合高脂飲食建立兔腹主動脈粥樣硬化模型，這在一定程度上避免了單純高脂飲食帶來的耗時長、動物多臟器脂質沉積等缺陷，但仍存在建模時間長、動物死亡率高、模型不穩定等問題［6］。本研究采用一種改良的球囊損傷方式、聯合4 周高脂飲食建立兔腹主動脈粥樣硬化模型，探討其與經典手術方式在模型成功率、穩定性和斑塊發展速度等方面的差異。

分化簇（cluster of differentiation，CD）47，也稱為整合素相關蛋白，是廣泛表達于細胞膜表面的抑制性受體，在免疫系統的自我識別中起關鍵作用［7］。CD47與巨噬細胞上的信號調節蛋白α（signal regulatory protein alpha，SIRPα）跨膜蛋白結合，向巨噬細胞傳遞吞噬抑制信號［8］。研究報道CD47在小鼠和人類AS斑塊的內皮和平滑肌中的表達顯著上調［9-10］。然而，CD47是否在早期AS斑塊中表達并損害吞噬清除作用尚缺乏研究。本研究將利用建立的兔腹主動脈早期粥樣硬化模型，驗證CD47 在AS 早期斑塊中的表達，為AS的發病機制和治療研究提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

MaverickTM2.0 mm×15.0 mm 球囊（Boston Scientific 公司，美國），QuantumTM3.5 mm×15.0 mm 球囊（Boston Scientific 公司，美國），PILOT 50 導絲（Abbott Vascular 公司，美國）；壓力泵（Merit 公司，美國），血管內超聲（intravascular ultrasound，IVUS）儀（Volcano公司，美國）；蘇木素染色液（武漢賽維爾生物公司），伊紅染色液（武漢塞維爾生物公司）；CD47抗體（北京博奧森生物公司），CD68 抗體（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；丙泊酚乳狀注射液（北京費森尤斯卡比公司）；利多卡因注射液（重慶天圣藥業有限公司）；青霉素（石家莊華北制藥股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物與飼養

3 月齡健康雄性新西蘭白兔20 只，體重2.0～2.5 kg，由南京市萊芙養殖場提供［許可證編號：SCXK（蘇）2019-0005，合格證號：202238952］。所有動物單籠飼養，自由飲水，保持12 h晝夜節律，恒定溫度和濕度，本研究方案經過南京醫科大學實驗動物福利倫理委員會審查批準（編號：IACUC-2207041）。手術組15只，根據造模方式又分為經典手術組和改良手術組，麻醉、切皮、分離股動脈，經股動脈隨機行經典球囊損傷或改良球囊損傷，術后縫合創口，予高脂飲食4 周。假手術組5 只，同樣麻醉、切皮、分離股動脈加縫合，但不行球囊損傷，術后予普通飲食4周。20只兔術前對應飼料適應性喂養1周。高脂飼料配制：1%膽固醇、8%豬油、7.5%蛋黃粉和83.5%普通飼料。

1.2.2 球囊損傷術構建兔腹主動脈粥樣硬化模型

經耳緣靜脈注射丙泊酚（6 mg/kg）麻醉，麻醉成功表現為呼吸深慢、四肢癱軟、角膜反射遲緩。將兔仰臥位固定于手術臺上，雙側股三角區局部備皮、消毒，利多卡因局部麻醉，在股動脈搏動明顯處切口，沿動脈走行方向切開皮膚、逐層分離筋膜肌肉，暴露右股動脈。游離右股動脈4～5 cm，近心端用絲線套取游離備用，遠心端用絲線結扎。近心端用動脈夾夾閉，用眼科剪在遠心端剪一“V”形切口。

經典手術方式：將3.5 mm×15.0 mm球囊導管沿導絲送入腹主動脈內，送入過程中松開動脈夾，球囊進入深度約15 cm。將球囊加壓至12～14 大氣壓（1 215.6～1 418.2 kPa），回拉球囊導管10 cm，然后球囊減壓至0 kPa，再次送至原位置，如此反復3次，損傷腹主動脈內皮。撤出球囊導管，迅速以動脈夾夾閉股動脈，結扎股動脈近心端，松開動脈夾，縫合消毒。

改良手術方式：將2.0 mm×15.0 mm球囊導管沿導絲送入股動脈內約2 cm，以4個大氣壓（405.2 kPa）擴張球囊，阻斷血流，固定球囊，松開動脈夾，繼續送入導絲25～30 cm，動脈夾夾閉近心端，撤出球囊。將3.5 mm×15.0 mm 球囊導管沿導絲送入腹主動脈內，送入過程中松開動脈夾，球囊進入深度為25～30 cm。將球囊加壓至20個大氣壓（2 026.0 kPa），反復前后拉動球囊30～40次，逐步回撤10 cm，損傷腹主動脈內皮。撤出球囊導管，迅速以動脈夾夾閉股動脈，結扎股動脈近心端，松開動脈夾，縫合消毒。

術后常規護理，予青霉素2 500 U/kg肌注，連續3 d。

1.2.3 IVUS檢查

術后各組對應飲食喂養4 周，麻醉后暴露切開左側股三角區，穿刺左股動脈，沿導絲送入IVUS 探頭，在超聲引導下將探頭送至降主動脈左腎動脈開口以上水平，采用機器自動控制系統，緩慢勻速回拉超聲導管至髂總動脈分叉處，全程記錄超聲圖像，保存供脫機分析。

1.2.4 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色

各組兔完成IVUS檢測后，沿耳緣靜脈注入過量丙泊酚處死兩組實驗兔，開腹，動脈夾夾閉膈肌下近心端腹主動脈，結扎兩側腎動脈。從降主動脈與腎動脈開口間向下切取約8 cm腹主動脈，取出腹主動脈。切取左腎動脈開口以下約8 cm的腹主動脈，于肝素水中沖洗后，4%多聚甲醛固定24 h。標尺測量切取動脈，每段1 cm，順序編號后進行石蠟包埋，每層4 μm逐層切片。部分切片HE 染色后，拍攝圖像，取粥樣硬化斑塊最大切面，Image J 分析計算粥樣硬化斑塊最大內膜厚度、平均內膜厚度、內膜中膜面積比及血管狹窄比例（斑塊面積/管腔總面積）。

1.2.5 免疫組化檢測

免疫組化檢測假手術組和改良手術組血管中巨噬細胞相關蛋白CD68 及抗吞噬蛋白CD47 的蛋白表達水平。上述石蠟切片進行脫蠟、水化和蒸餾水沖洗。山羊血清封閉1 h后，切片分別與CD68一抗（1∶50）、CD47 一抗（1∶400）在4 ℃孵育過夜。室溫下與二抗孵育1 h，用二氨基聯苯胺染色，蒸餾水阻斷反應，封片后在顯微鏡下觀察拍攝。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況

正常飲食假手術組無死亡，手術組當日麻醉死亡1只，動脈夾層破裂死亡1只（改良手術組），高脂飼養過程中絕食重度營養不良死亡1 只（經典手術組），剩余12 只（經典手術組與改良手術組各6 只）均完成4周的高脂飲食喂養，每組均有1只出現輕度趾甲潰爛。各組體重變化見表1，經典手術組與改良手術組體重變化比較，差異無統計學意義（圖1）。

圖1 各組兔造模前后體重差值Figure 1 Weight changes of rabbits in each group before and after modeling

表1 各組兔造模前后體重Table 1 The weight of rabbits in each group before and after modeling（kg，±s）

表1 各組兔造模前后體重Table 1 The weight of rabbits in each group before and after modeling（kg，±s）

2.2 兔腹主動脈IVUS結果

各組兔腹主動脈IVUS 圖像見圖2。假手術組：內膜無增厚，血流通暢，管腔無狹窄；經典手術組：內膜稍增厚模糊，未見管腔明顯狹窄與斑塊形成；改良手術組：內膜明顯增厚，斑塊突出于腔內，呈偏心性分布，與管腔分界清晰，回聲強度均勻，為內膜增厚回聲，與內彈性膜形成的高回聲層間分界不清晰，強度低于血管外膜，沒有鈣化回聲，為脂質斑塊。

圖2 術后高脂飲食4周各組兔腹主動脈IVUS影像Figure 2 IVUS images of abdominal aortas in rabbits of each group after a high-cholesterol diet for 4 weeks

2.3 兔腹主動脈內膜增生情況

各組兔腹主動脈HE 染色和巨噬細胞標志物CD68表達情況見圖3。假手術組：管腔單層內皮細胞扁平連續，未見增厚，平滑肌細胞整齊有序，細胞核藍染，胞漿呈紅色，各層細胞及彈力膜結構清晰，無脂質沉積。未見棕黃色蛋白，無巨噬細胞沉積。經典手術組：管腔少部分內膜輕度增厚，增厚內膜中多層平滑肌細胞排列紊亂，可見小空泡，少量棕黃色沉積，巨噬細胞少量浸潤，內彈力膜尚清晰。改良手術組：血管縱切面內膜普遍全程不均勻偏心增厚，向管腔凸出，形成斑塊。部分內膜斷裂，增厚內膜各層細胞紊亂堆疊，胞漿嗜酸紅染的平滑肌細胞減少，代之以大量胞漿淡染和充滿脂質空泡的泡沫細胞，大量巨噬細胞浸潤，各層結構界限模糊，管腔明顯狹窄。

圖3 術后高脂飲食4周各組兔的腹主動脈HE染色及CD68蛋白免疫組化染色Figure 3 The HE staining and CD68 immunohistochemical staining of abdominal aortas in rabbits of each group after a high-cholesterol diet for 4 weeks

與假手術組比，手術組內膜增厚程度及管腔狹窄比例差異有統計學意義（P<0.05）。改良手術組內膜最大厚度、平均內膜厚度、內膜中膜面積比、管腔狹窄比例均大于經典手術組（P<0.05，表2）。

表2 各組免腹主動脈內膜增生程度Table 2 The degree of abdominal aorta intima hyperplasia in rabbits of each group（±s）

表2 各組免腹主動脈內膜增生程度Table 2 The degree of abdominal aorta intima hyperplasia in rabbits of each group（±s）

Compared with the sham group，*P<0.05；compared with the classical intervention group，#P<0.05.

2.4 早期斑塊中CD47的表達

各組腹主動脈HE染色及斑塊中的抗吞噬蛋白CD47 的免疫組化檢測結果見圖4。假手術組的腹主動脈內膜未見棕黃色染色，提示CD47 低表達或不表達；經典手術組可見少量棕黃色染色團塊聚集于增生內膜內，提示斑塊內CD47低表達；改良手術組可見棕黃色染色團塊聚集于泡沫細胞內，顆粒狀彌散性表達于細胞外基質。平滑肌層細胞核藍染，胞質透明，無棕色沉積，各層界限分明，提示斑塊內CD47高表達，且局限于增生的內膜。與假手術組和經典手術組比，CD47在改良手術組的表達差異有統計學意義。

圖4 各組兔腹主動脈CD47蛋白免疫組化染色Figure 4 The CD47 immunohistochemical staining of abdominal aortas in rabbits of each group

3 討論

兔與人類的血脂代謝極為相似，是最早用于建立AS模型的動物之一［11］。單純高脂飲食造模，造模周期長、慢性并發癥較多、模型成功率受個體間差異影響大，實際應用受限［12-14］?，F多采用球囊損傷聯合高脂飲食，一定程度上縮短了造模時間，但周期仍長達12～16周，且動物死亡率高，模型穩定性不足［15-16］。本研究在傳統內皮損傷法的基礎上進行改良。經典球囊損傷多采用3.5 mm×15.0 mm 球囊導管8～14 個大氣壓（810.4～1 418.2 kPa）擴張后回拉3 次造成內皮損傷［17］。在本研究的球囊損傷模型中，首先采用直徑2.0 mm的球囊進入股動脈，4個大氣壓（405.2 kPa）擴張后阻斷血流，將導絲沿球囊送入腹主動脈25～30 cm后更換為直徑3.5 mm的球囊，減少了術中出血。內皮損傷階段應用20 個大氣壓（2 026.0 kPa）擴張球囊，反復前后拉動球囊30～40次，逐步回撤，造成廣泛的腹主動脈內皮損傷，且未對兔的術中、術后生存率產生影響。所有手術模型兔均有不同程度的內膜增生，兩種手術方案造模成功率均為100%。

陳家元等［18］建立的高脂飲食聯合球囊損傷兔腹主動脈模型中，采用經典手術方式，術后4周腹主動脈處于脂紋階段，出現輕度內膜增生，8周后出現了造影可見的內膜增生和血管狹窄。本研究改良手術方式后，4周即可在IVUS下觀察到顯著的內膜增生和血管狹窄，且體重改變與經典手術組的差異無統計學意義，提示改良手術方式可加速AS斑塊進展。此外，免疫組化結果顯示兩種手術方式均有細胞內脂質沉積，巨噬細胞浸潤，而無明顯鈣化、脂質核心或壞死核心，說明斑塊均為早期軟斑塊，而改良手術組的內膜厚度和斑塊體積較經典手術組顯著增加，造成明顯血管狹窄，提示改良后的造模方法周期更短、更穩定，可靠性高。

AS 的特點是慢性持續炎癥反應和壞死細胞堆積［19］。在AS早期，巨噬細胞吞噬在損傷內膜下積聚的低密度脂蛋白，形成泡沫細胞并發生細胞死亡。凋亡細胞清除缺陷導致巨噬細胞進一步聚集，與積累的死亡細胞及脂質碎片形成壞死核心，誘發持續炎癥反應，加速AS進展，形成晚期AS［20］。本研究中可見巨噬細胞在手術組的斑塊內浸潤，改良手術組中巨噬細胞浸潤顯著高于經典手術組，且多在內膜深層堆積。CD47 作為阻斷巨噬細胞吞噬信號的膜蛋白，因在惡性腫瘤細胞表面過表達，促進腫瘤免疫逃逸而被廣泛關注［21］。Kojima 等［22］在小鼠主動脈和人類頸動脈粥樣硬化晚期斑塊中也發現了CD47的過度表達，并且在小鼠AS 高脂飲食早期應用抗CD47抗體可以顯著減少斑塊內凋亡細胞數目，縮小斑塊體積，促進斑塊穩定。本研究首次揭示了兔腹主動脈AS 發展早期出現了只局限于增生內膜中的CD47過表達，且CD47在斑塊內不同成分中普遍過表達，提示巨噬細胞清除缺陷在AS早期發揮了重要作用。在IVUS可診斷的早期斑塊中，抑制CD47可能成為早期抑制AS發展的新策略。

綜上，本研究一方面改良了手術方式，加速了斑塊進展，4周即形成了IVUS可診斷的明顯增生內膜，狹窄程度較一致，適用于AS斑塊的快速誘導和早期斑塊機制的研究。另一方面，本研究首次揭示了在兔腹主動脈AS中，抗吞噬分子CD47在斑塊早期即有顯著過表達，該時期抑制CD47，有可能增加壞死細胞清除，為延緩AS進展提供了新的潛在策略。