基于納米技術的液體活檢對CTCs捕獲與檢測的進展與突破

李甘 于妍妍 顧純林 楊淵

惡性腫瘤是威脅人類健康和導致死亡的主要原因之一。原發腫瘤的治療已經取得了穩定進展,然而,原發部位腫瘤細胞可能會經淋巴道,血管或體腔等途徑到達其他部位繼續生長,發生轉移,從而導致約90%的惡性腫瘤患者死亡。研究發現,在腫瘤轉移的早期,在腫瘤患者的外周血中已經檢測到循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs),因而可將其作為液體活檢標志物,對腫瘤的早期診斷、術后監測以及評估腫瘤患者預后情況具有重要意義[1]。循環腫瘤細胞(CTCs)有助于轉移的形成,因此是廣泛研究的主題[2],它作為轉移過程中的功能性生物標志物,已用于科學研究和臨床應用[3]。液體活檢區別于傳統活檢(手術活檢和穿刺活檢),它可以對分子或細胞進行無創和動態分析,因此具有很大的診斷、預后、監測疾病進展和治療的潛力,并且也可以了解疾病藥物開發治療靶點的機制和鑒定[4-5]。大多數液體活檢方法包括從體液或外周血中富集靶標,然后對分離的目標進行表征和分析。CTCs的當前分離和富集主要基于兩種方法：一種是基于CTCs的物理特征性質(如尺寸[6],可變形性[7]),一種是基于免疫親和力的富集,通常需要借助于分子探針,如抗體[8],肽段[9]和適體[10],隨后通過熒光可視化,電化學和等離子體傳感等方法分離檢測CTCs,然后可以通過免疫染色,逆轉錄—聚合酶鏈反應(RT-PCR)和測序等方法分析其分子生物標志物(如蛋白質,DNA和RNA)[11,12]?，F已開發各種納米材料,納米結構和分子探針用于CTCs的富集和分析,并已成功應用于臨床,顯示了基于納米技術的液體活檢在早期診斷,動態監測,治療反應評估和預后方面具有的極其重要意義[13]。下面討論了基于納米技術的液體活檢對循環腫瘤細胞捕獲與檢測的進展和突破。

2 基于納米技術的液體活檢的進展和突破

2.1 基于納米結構的分離與捕獲 納米結構由于它們的納米尺寸大小及其形貌結構類似于生物靶標,能夠通過增加生物材料接觸界面來增強捕獲效率?；贑TCs與血液中其他血細胞之間物理性質的差異,納米多孔結構已廣泛用于CTCs的分離[14]。有學者開發了一種用于捕獲CTCs的抗體功能化的電紡TiO2納米纖維(TiNF)基質[15],與以前用于CTCs富集的垂直取向硅納米柱不同[16],TiNF水平包裝,更好的模仿嵌入支架中的納米結構的水平方向,從而改善了細胞與納米結構之間的親和力,利用抗EpCAM包被的TiNF底物,對結直腸癌和胃癌患者的外周血樣進行了CTCs捕獲研究,結果顯示從3個病例中的2個樣品中捕獲到了CTCs,每0.5毫升結直腸癌患者的血液樣本中有0 ～ 2個CTCs,每0.5毫升胃癌患者血樣中有3～19個CTCs,這些結果證明了該平臺對CTCs捕獲的高靈敏度。

Hong等[17]在研究中提出了一種使用多功能磁性納米線(NWs)檢測CTCs的新策略,即使在癌癥的早期階段,它也能顯著提高從患者血液中分離CTCs的靈敏度和特異性。用抗體混合物修飾并且摻雜大量磁性納米顆粒(MNPs),旨在同時對捕獲的細胞進行識別,分離和“肉眼”原位比色檢測,該方法的獨特之處在于NWs具有類似鉛筆的形態,能夠消除血液中其他細胞元素(紅細胞和白細胞和血小板)的空間位阻,可以增加與CTCs接觸的頻率。此外,細長的幾何形狀不僅通過在細胞周圍纏繞NWs來確保細胞與NWs最大程度的附著,而且還提供用于靶向配體的多價結合位點,平均長度為16 mm,直徑為200 nm的NWs足以通過生物素-鏈霉素相互作用來容納多種類型的抗體,實際上,上皮癌標志物與典型的間充質標志物如EpCAM,EGFR,細胞表面糖蛋白(TROP-2),波形蛋白和鈣黏附蛋白的組合能夠鑒定出具有表型變異的CTCs群體,這會避免EpCAM陰性表達的CTCs的遺漏,從這個角度來看,他們所提出的使用多功能磁性納米線富集CTCs的策略是完全合理的。

2.2 納米生物界面提高特異性和靈敏度 特異性和靈敏度是生物檢測的兩個主要問題,特別是用于檢測復雜生物樣品中的目標物時,例如,從血液中的數十億正常血細胞中鑒定CTCs[18]。此外,還要有足夠的靈敏度能夠捕獲液體活檢的微小變化,這對于癌癥進展和治療反應的早期診斷和監測至關重要?，F已經應用各種探針(如抗體,肽段,適體等)來改善生物檢測的特異性。同時,也已開發出許多納米材料,如納米粒和氧化石墨烯及納米線和納米纖維等納米結構,以提高CTCs的捕獲能力[19]。如Peng等[9]對MNPs進行了改進,他們用重新設計的肽段修飾了MNPs,這些肽段對CTCs上的標記膜蛋白具有高度親和力(如EpCAM和Her-2),肽功能化的MNPs對CTCs具有很高的捕獲效率,對乳腺癌,前列腺癌和肝癌的CTCs的捕獲率達到90%以上,對Her-2陽性CTCs的捕獲率達到68%,該實驗結果顯示修飾了高親和力肽段的MNPs可以提高檢測靈敏度。這些免疫物質與新型納米材料和納米結構相結合,顯著改善了檢測CTCs的效率,已經取得了很多臨床應用,例如本課題組在四氧化三鐵磁性納米粒子(Fe3O4)表面逐步修飾二氧化硅(SiO2)及明膠(Gel)層,并進一步與上皮細胞黏附分子適體(EpCAM Apt)連接,制得了一種能夠特異性捕獲痕量 CTCs 的免疫磁珠。利用單壁碳納米管(SWCNT)的類過氧化物酶活性以及非特異性DNA 序列對該活性的影響,構建了一種納米比色探針,實現了對CTCs 的光學測定。進一步將該比色探針應用于對 CTCs 的定量檢測,可行性分析結果表明,MCF-7 細胞與免疫磁珠反應后的上清液中存在被置換下來的 mDNA,因而加入SWCNT 比色探針后,652 nm 處的吸光度明顯增加,且不同濃度的人乳腺癌細胞(MCF-7) 引起的吸光度增加的程度也不同。因此,根據細胞加入前后所引起的 SWCNT 比色探針在652 nm 處的吸光度值的變化(△A),可以實現對 CTCs 的定量分析。在最佳條件下,該比色探針在 652 nm 處的吸光度值增加值(△A)與 MCF-7 細胞在 10～500/mL內有較強的靈敏度,呈現良好的線性關系[20]。見圖1。

圖1 A. Fe3O4-SiO2-Gel/P1/mRNA的制備B. SWCNTs對CTCs的捕獲與檢測

2.3 納米探針提高檢測能力 基于免疫原性的捕獲是分離CTCs的最常見策略之一。這些標志物包括癌癥特異性蛋白,如在各種上皮癌中高表達的上皮細胞黏附分子(EpCAM),在肺癌,膠質瘤,胃癌中高表達的表皮生長因子受體(EGFR),乳腺癌中高表達的表皮生長因子受體-2(Her-2)以及在前列腺癌中高度表達的重要診斷和預后標志物前列腺特異性膜抗原(PSMA)和前列腺特異性抗原(PSA)[18,21-22]?？贵w、肽段和適體廣泛用于涂覆各種納米材料和納米結構,是最常見的捕獲檢測CTCs的探針[23-24]。例如,Bai等[25]報道的一種從頭設計的EpCAM識別肽,與抗體相比,它具有更好的穩定性和更高的EpCAM親和力,他們使用靶向EpCAM的肽段功能化MNPs來捕獲CTCs,并達到90%以上的捕獲率。幾年后,該組又報道了一種對Her-2具有高度親和力的肽,并使用這種肽功能化MNPs,捕獲乳腺癌中的CTCs,捕獲效率達到68.56%～79.26%[9]。

由于癌癥的異質性,生物標志物的表達會發生變化。例如,上皮—間質轉化(EMT)導致上皮標志物的減少或丟失以及液體活檢標記物中間質標志物的增加[26]。針對單一生物標志物的技術可能導致有的CTCs不能被有效捕獲,在這方面,針對不同生物標記物的多種探針的組合提供了相對較好的策略,因此提高了檢測能力[27-28]。除了基于免疫特異性分離CTCs的傳統方法外,還開發了一些新的捕獲方法,例如,Mirkin的小組開發了一種NanoFlare系統,將球形金納米粒子功能化,其中密集排列的單鏈DNA單層(ssDNA),能夠靶向細胞內mRNA,并且ssDNA與Cy5標記的短鏈DNA補體雜交,熒光由于其相互接近而發生猝滅現象[29],當與靶mRNA結合后,補體被置換,從而熒光得以恢復,NanoFlare系統與流式細胞儀分析相結合,可以應用于乳腺癌CTCs的檢測和分子分析[30]。

2.4 基于納米結構的檢測與分析：MNPs是用于檢測CTCs的最早和最經典的納米材料之一。最具代表性的例子是CellSearch系統,它是迄今為止美國食品和藥物管理局(FDA)批準用于評估轉移性乳腺癌和結腸直腸癌患者的診斷和預后效果的惟一系統。由于納米顆粒的尺寸小,因此慢的磁響應和高損失率已成為MNPs的問題。為了解決這些問題,Wen等[31]通過逐層(LBL)組裝方法構建的磁性納米球(MNs)能夠有效控制納米球的大小和磁響應,在聚苯乙烯/丙烯酰胺共聚物納米球(Pst-Aam-COOH)的表面上組裝五層疏水性納米γ-Fe2O3以獲得快速磁響應,并且在外層引入二氧化硅以增加穩定性并減少納米球的聚集,使用乳腺癌細胞SK-BR-3作為模型系統摻入健康人血液中,用抗EpCAM功能化的MNs與CTCs孵育5 min,結果產生高于94%的捕獲效率,且分離的CTCs存活率保持在(90.5±1.2)%,并可對CTCs進行再培養,PCR和免疫細胞化學技術(ICC)分析后證明了該方法的良好再現性和可靠性,最后LBL-MNs成功將患有結腸癌,肝癌,肺癌或乳腺癌的患者與健康個體區分開來,顯示該材料可用于分析臨床樣品。MNPs還可涂覆其他材料,例如碳納米材料,以增強其穩定性和生物相容性,以防止磁芯氧化和降解,從而保持高磁性。例如,使用石墨涂層的MNPs微陣列檢測CTCs,穩定且生物相容性良好的石墨涂覆的MNPs,是從像全血這樣的復雜系統中富集CTCs的良好工具[32]。MNPs也可用細胞膜包被,以減少血液中雜質如正常血細胞的非特異性結合,從而改善分離方法和技術的特異性。例如,用工程白細胞膜(通過溫和有效的化學裝飾EpCAM抗體)涂覆Fe3O4磁性納米團簇(MNCs)[33],用于從血液中富集CTCs,白細胞膜功能化的MNCs由于其與白細胞的同源性,而在遇到白細胞時會被排斥[34],因此白細胞的非特異性吸附顯著降低,結果90%的CTCs可以在15 min內從全血中捕獲。

除了MNPs之外,其他納米材料如石墨烯/氧化石墨烯(GO)[35],金納米粒子[36]和硅納米線[37]也被用于生物檢測。眾所周知,納米結構材料通過在納米尺度的形貌上提供增加的界面來改善細胞附著,以便細胞黏附[38]。這些納米結構的材料,當用免疫原性物質功能化時,可以作為生物檢測的理想支架。有學者使用3D納米結構聚二甲基硅氧烷(PDMS)底物,利用特異性識別EGFR的適體捕獲CTCs,與玻璃載玻片或普通PDMS相比,CTCs捕獲靈敏度提高了2倍[39]。由于其納米紋理形態和易于修飾的化學性質,GO在CTCs的鑒定中獲得了很多關注。Yoon等[40]開發了涂有EpCAM抗體功能化GO納米片的圖案化金表面,并將其用于鑒定來自轉移性乳腺癌,轉移性胰腺癌和早期肺癌的血液中的CTCs,GO納米片通過靜電吸引吸附在圖案化的金表面上,隨后通過親和素和生物素相互作用,用生物素化的EpCAM抗體功能化,能夠以高靈敏度捕獲低濃度的CTCs,結果顯示了GO材料在液體活檢中的潛力。

2.5 光敏與熱敏納米平臺探索CTCs的檢測與診斷 光敏納米顆粒是癌癥治療和診斷的常見材料之一。這些響應型納米粒子已經進行了廣泛的研究,能夠產生患病細胞的獨特視覺圖像。 一些研究人員開發了多種成像探針,這些探針采用熒光技術、表面增強拉曼散射(SERS)等技術[41]進一步達到檢測的目的。但是,CTCs 診斷需要特殊的技術才能為診斷干預提供準確的結果。因此,許多研究小組使用了納米復合材料,當用于CTCs時,它們能夠產生清晰的結果。這種基于納米的方法被稱為“金納米火炬”,它可以通過基于基因特征的上皮標記,靶向上皮-間質轉化(Vimentin 和纖連蛋白)以及 E-鈣粘蛋白。具體方案是利用金納米顆粒(AuNPs)提供一個用于熒光激發的外場來增強熒光,然后制備合適的金屬熒光探針,通過與CTCs特征性的競爭結合,從而釋放熒光團來診斷CTCs[42]。另用預先雜交的核苷酸標記上熒光分子,如果目標序列與探針序列互補,則可以啟動熒光標記的DNA序列,以讀出CTCs中的目標 DNA。這種基于納米平臺的熒光探針可用于有效檢測CTCs中的 mRNA。另一方面,采用近紅外激發成像的上轉換納米顆粒(UCNP)也已用于基于光敏的 CTCs 診斷?？紤]到這一原理,Fang 等[43]使用 UCNPs 對CTCs進行成像,他們利用靶向 PTK-7 的適體連接的 NaYF4(Yb：Er)UCNPs 靶向癌細胞,以證明熒光強度與血樣中摻入的 PTK-7 陽性 CCRF-CEM 細胞數量之間存在線性關系。其成功地結合了超順磁性 Fe3O4納米粒子的磁性富集,從而觀察到10 mL血樣中摻入的10個細胞[43]。最終用顯微鏡將捕獲的細胞可視化,以觀察捕獲的細胞的性質?；赟ERS的CTCs 檢測和分析技術也因其特異性而取得了重大進展。例如,由涂銀的金納米棒(NR)與四種類型的拉曼響應分子結合制成了四色SERS納米粒子。每個納米顆粒都與靶向 IGF-1,抗EpCAM,抗CD 44和抗角蛋白18(乳腺癌生物標記物)的特異性抗體相連。在SERS探針混合物存在的情況下,用共聚焦拉曼顯微鏡觀察同一細胞上的四個標記,每個報告基因的特征性 SERS 峰都可見。在此,這些信號為多色生物成像和CTCs 的檢測提供了出色的多路應用性[44]。上述研究總結了各種用于檢測 CTCs的光敏納米材料,這些技術的優勢使它們更有可能轉化為臨床用途。

另外,研究者們已經開發出對溫度敏感的納米材料來提供另一種檢測思路。在許多情況下,已經開發出了幾種針對 CTCs 的開發平臺,因此,溫度敏感性在癌癥研究中的相關性已成功應用于 CTCs 的靶向和診斷。最近開發的熱敏 NanoVelcro CTCs 純化平臺可用于純化非小細胞肺癌(NSCLC)受試者的CTCs[45]。隨后通過調節流速,表面化學成分和加熱-冷卻循環來優化此技術的實際使用。使用生理學上可受的刺激溫度可確保操作參數對CTCs的破壞很小,從而確保了CTCs的高活力,且其細胞形態和分子完整性不受干擾。此外,他們成功地證明了通過該技術純化的腫瘤細胞的培養擴增和突變分析。還值得注意的是,他們同時采用 NanoVelcro 系統的溫度敏感性和下游突變分析來觀察NSCLC患者的病情發展,強調其在NSCLC治療中的轉化價值。Retegui 等[46]設計了另一種新穎的對溫度敏感的納米診斷策略,他們生產了一種基于雙模式明膠的材料, 該材料對溫度敏感,并利用熱響應性釋放納米材料以用于診斷。他們采用了機械策略來實現單細胞回收,但是其策略的最重要方面是使用溫度敏感性來進行 CTCs 的總體回收。通過逐層沉積來制造材料涂層,其中生物素和鏈霉親和素的特征性結合為該釋放技術提供了框架。用明膠和生物素分子修飾血漿活化的PDMS表面,其中使用鏈霉親和素修飾使納米涂層結構更加穩定。明膠形成獨特的分子間α-螺旋結構,該結構在明膠分子與水分子之間具有可逆的氫鍵。該技術在納米涂層內引發了一定程度的響應性。溫度>37℃可使納米涂層從表面迅速塌陷,并已成功用于鑒定 EGFR 和 PIK3CA 癌基因突變的 CTCs。為確保有效性,微流控芯片通過納米涂層功能化,并暴露于摻有CTCs的外周血中,此過程的捕獲效率約為 96%[46]。熱響應平臺已被證明是有效的技術之一,但仍需要大量研究來微調此策略,以幫助CTCs 檢測平臺的優化構建。由于這些響應平臺已在人類受試者中證明了高度的安全性,因此如果對使用熱響應納米材料的 CTCs 診斷進行更多的研究,將是安全且明智的做法。

3 結論

鑒于血液中CTCs的精確計數可以為轉移性癌癥的進展提供有價值的臨床見解,迫切需要實現高度靈敏和可靠的CTC檢測的技術。如本綜述所總結的,納米技術在液體活檢中占有重要地位,近幾十年來取得了很大進展。參與生物檢測的納米技術已經從單個納米材料或納米結構演變為集成的納米平臺和設備,能夠以高靈敏度和特異性實現CTCs的多功能和高通量分析。

盡管新興的CTCs檢測方法正在以指數的速度在發展,但仍然需要廣泛的臨床驗證,由于CTCs的捕獲與檢測對癌癥診斷和預后具有深遠的潛在影響,科學界正期待著一個用于CTCs的納米無創平臺,該平臺將在未來幾年內被接受用于臨床,最終實現對患者的早期診斷,預后評估以及個體化治療。