蒙藥三子散多指標成分的含量測定

許佳綺，劉妍妍，白云霞，劉宏，夏慧敏，張慧文*，王煥蕓*（.內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 000；.濮陽市安陽地區醫院藥學部，河南 安陽 455000；.內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古 包頭 0400）

中蒙藥復方制劑的成分復雜，且發揮作用的并非單一的化學成分，而是多種成分相互作用的結果。近年來，中蒙藥的質量評價已經從單一指標的檢測發展到基于多指標成分的綜合質量評價，伴隨著數據量的增加，需要借助更科學的化學計量學方法進行分析?；疑P聯度分析（grey relational analysis，GRA）是一種多因素統計分析的方法，此方法對數據要求較低，且計算量小，常用于中藥質量控制、譜效分析中。逼近理想解排序法（technique for order preference by similarity to ideal solution，TOPSIS）是一種綜合評價方法，通過將多個指標計算整合為一個綜合指標，把多維問題轉化為一維問題，降低了分析過程中不同類型指標對決策的干擾及實驗過程中人為因素產生的干擾，從而提高多目標決策分析的科學性和準確性[1]。TOPSIS方法與中藥指紋圖譜技術和多維分析技術的合理整合是一種綜合鑒別、客觀量化和精準評價中蒙藥質量[2-3]、藥效[4]、臨床應用[5]的有效方法，更能清晰、準確地揭示中蒙藥復雜系統的真實本原。

三子散現收載于2020年版《中國藥典》一部，為蒙古族傳統方劑之一，由訶子、梔子、川楝子三味藥材等量配比混合而成[6]?，F行的三子散含量測定僅以單指標測定有效成分沒食子酸[7]、川楝素[8]、還原糖[9]的含量為主，本課題組前期對三子散進行研究[10-12]，發現其入血成分為酚酸類、鞣質類、環烯醚萜類等化學成分?；诖?，為了更系統地評價三子散質量，本試驗在前期HPLC指紋圖譜研究的基礎上，納入了更多能反映蒙藥三子散整體質量屬性、與藥效關聯性較強的化合物作為復方含量測定指標，即酚酸類（沒食子酸、咖啡酸）、環烯醚萜類（京尼平苷）、鞣質類（訶子次酸、石榴皮鞣素、安石榴苷、柯里拉京、訶子鞣酸、1，2，3，4，6-O-沒食子酰葡萄糖、訶子林鞣酸、鞣花酸）、單萜苷類（jasminoside B）。采用HPLC技術建立上述12種成分的含量測定方法，結合GRA-TOPSIS法建立15批三子散的質量評價模型，以期為不同批次、不同產地中蒙藥材的質量評價提供更加全面、科學的參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030C 3D型高效液相色譜儀（日本株式會社島津制作所），PX225DZH型十萬分之一天平（奧豪斯儀器有限公司），JJ224BC型萬分之一電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），WK-1000A型小型高速粉碎機（濰坊市北方制藥設備制造有限公司），PF3XXXXM1型一體化超純水系統（英國ELGA公司）等。

1.2 試藥

對照品沒食子酸（批號：D2016091，純度：99%）、京尼平苷（批號：J2027132，純度≥98%）、咖啡酸（批號：I2002097，純度：98%）、鞣花酸（批號：K1813148，純度：96%）（阿拉丁試劑有限公司）；石榴皮鞣素（批號：M23J11S119104，純度≥98%）、訶子次酸（批號：M30GB150105，純度≥95%）、柯里拉京（批號：P25A11S122217，純度≥98%）、安石榴苷（批號：Y11S11Y124050，純度≥98%）、訶子鞣酸（批號：M29GB143373，純度≥98%）、1，2，3，4，6-O-沒食子酰葡萄糖（批號：P16M11F113433，純度≥99%）、訶子林鞣酸（批號：P24J9F53640，純度≥98%）（上海源葉生物科技有限公司）；jasminoside B（批號：P16A9F58571，純度≥98%，北京譜析科技有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純，甲酸、磷酸為分析純，水為超純水。

訶子、梔子、川楝子單味藥飲片各15批，經內蒙古醫科大學生藥教研室張慧文博士鑒定，訶子為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.的干燥成熟果實，梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實，川楝子為楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc.的干燥成熟果實，均符合2020年版《中國藥典》一部標準。將各批次訶子、梔子、川楝子單味藥飲片使用粉碎機粉碎成粗粉，過40目篩，取三味藥材等比等量混勻，隨機取樣組合，即得15批三子散樣品（編號S1～S15），各單味藥飲片來源信息詳見表1。

表1 15批三子散中各單味藥飲片來源Tab 1 Source of each single medicine piece in 15 batches of Sanzi powder

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Ultimate LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～5 min，1%→5%B；5～10 min，5%→13%B；10～24 min，13%→23%B；24～56 min，23%→35%B；56～78 min，35%→47%B；78～90 min，47%→85%B；90～100 min，85%→90%B；100～105 min，90%→100%B）；柱溫為30℃；流速為1.0 mL·min－1；檢測波長為254 nm；進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品儲備液 精密稱取對照品訶子次酸、沒食子酸、石榴皮鞣素、安石榴苷、jasminoside B、咖啡酸、柯里拉京、京尼平苷、訶子鞣酸、1，2，3，4，6-O-沒食子酰葡萄糖、訶子林鞣酸、鞣花酸適量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解并定容，混勻，制備成質量濃度分別為470、250、94、1030、1320、154、540、1800、2870、450、2610、550 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取三子散樣品1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，搖勻，稱量，超聲提取30 min，放至室溫后再次稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，4℃條件避光保存，0.45 μm濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 缺味陰性樣品溶液 以1.2 g為處方總量，分別配制不含訶子或梔子或川楝子的缺味陰性樣品處方，并按“2.2.2”項下方法處理，即得各缺味陰性樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 取混合對照品、供試品、缺味陰性樣品、空白溶液適量，進樣測定，記錄色譜圖，結果見圖1。供試品溶液中12種成分的色譜峰分離度良好，理論板數較高；供試品溶液與對照品溶液在相同保留時間處有對應色譜峰，供試品溶液及各缺味陰性樣品溶液中其他成分色譜峰對12種成分測定均無干擾，空白溶液于相同保留時間處無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 三子散HPLC圖Fig 1 HPLC of Sanzi powder

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品儲備液適量，置于不同量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得一系列濃度對照品溶液，進樣測定，記錄各色譜峰峰面積值（其中，安石榴苷峰面積為安石榴苷A與安石榴苷B峰面積之和）。以對照品溶液質量濃度（μg·mL－1）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表2，12種成分在各自質量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

表2 12種成分的回歸方程及線性范圍Tab 2 Linear regression equation and linear range of 12 components

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”混合對照品溶液適量，連續進樣測定6次，結果12種成分峰面積的RSD均在0.11%～0.46%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取三子散樣品（S14），按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積并根據外標法計算12種待測成分的含量，結果12種成分含量的RSD在0.80%～2.8%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取同一份三子散樣品（S14），按“2.2.2”項下方法制備，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24、48 h進樣測定，計算得到12種成分峰面積的RSD在1.2%～2.8%（n＝7），表明供試品溶液于室溫下放置48 h內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收試驗 精密稱取各成分已知含量的三子散樣品約0.50 g，平行稱定9份，分別精密加入相當于該樣品中各待測成分含量0.8、1.0、1.2倍量的單一成分對照品溶液，每個質量濃度平行操作3份，按“2.2.2”項下方法制備，進樣測定，計算12種成分的平均加樣回收率及RSD。結果顯示12種成分的平均回收率為96.72%～104.07%，RSD為1.4%～2.6%（n＝3），表明本方法的準確度良好。

2.4 樣品含量測定

取15批三子散樣品（S1～S15），按“2.2.2”項下方法制備，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，記錄峰面積，以外標法計算12種待測成分的含量，每份樣品平行操作3次，取平均值，結果見表3。15批三子散樣品中訶子次酸、沒食子酸、石榴皮鞣素、安石榴苷、jasminoside B、咖啡酸、柯里拉京、京尼平苷、訶子鞣酸、1，2，3，4，6-O-沒食子酰葡萄糖、訶子林鞣酸、鞣花酸的平均含量分別為2.977～7.763、0.8465～2.487、0.2872～1.208、3.897～11.68、2.356～16.46、0.7995～1.444、2.492～4.870、13.28～21.39、14.50～26.46、1.766～4.165、3.406～27.50、3.064～7.078 mg·g－1。

表3 12種成分的含量測定結果(mg·g－1，n＝6)Tab 3 Content of 12 components (mg·g－1，n＝6)

2.5 化學模式識別分析

2.5.1 TOPSIS分析[13-14]設有m個評價對象，n個評價指標（m＝1，2，……i；n＝1，2，……j），本試驗中m＝15，n＝12，將其檢測數據構成矩陣V，由于樣品中各測量成分含量不一，需要按照公式（1）將矩陣V進行歸一化處理，得到矩陣Z。

注：zij表示第i個評價對象在第j個指標上的取值。

根據歸一化矩陣結構選出最優方案和最劣方案，最優方案Z＋為n個評價指標對應樣品的最大值最優方案；Z－為n個評價指標對應樣品的最小值，具體見公式（2）、（3）。

按照公式（4）、（5）計算各評價對象與最優方案和最劣方案之間的距離。

按照公式（6）計算各評價對象與最優方案的相對接近程度（Ci），0＜Ci＜1

按照大小將各評價對象排序，Ci值越大，說明評價對象綜合質量越好，結果見表4。

表4 15批次三子散GRA與TOPSIS分析結果Tab 4 GRA and TOPSIS analysis of 15 batches of Sanzi powder

2.5.2 GRA[15]基于15批次三子散12種成分的含量，建立灰色模式識別數據集，由于其量綱不統一，對原始數據進行規格化處理。設有m個樣品，每個樣本有n項評價指標，組成評價單元序列{Xik}（i＝1，2…，m；k＝1，2，…，n），本試驗按照公式（7）對不同批次三子散數據進行規格化處理。

其中，Yik為規格化處理后的數據，Xik為原始數據，Xk為m個樣品第k個指標的均值。

采用GRA進行評價時，需要考慮最優參考序列和最差參考序列。最優參考序列為{Xsk}（k＝1，2，…，n）是m個樣品對應指標的最大值；最差參考序列為{Xtk}（k＝1，2，…，n），是m個樣品對應指標的最小值。

最優參考序列關聯系數見公式（8）：

式中，Δmin＝min|Yik－Ysk|，Δmax＝max|Yik－Ysk|，Yik為各個成分對應的Yik的最大值，ρ為分辨系數，通常取值0.5。

最差參考序列關聯系數見公式（9）：

式中，Δmin＝min|Yik－Ysk|，Δmax＝max|Yik－Ysk|，Ytk為各個成分對應的Yik的最小值，ρ為分辨系數，通常取值0.5。

最優參考序列關聯度見公式（10）：

最差參考序列關聯度見公式（11）：

相關關聯度見公式（12）：

計算各樣品的相對關聯度，并且按ri大小排序，排序結果見表4。

由表4所示，GRA和TOPSIS分析結果基本一致，根據TOPSIS分析所得Ci值以及排序可知，排在前8位的是S12、S15、S3、S6、S1、S4、S14、S10，GRA分析所得ri值以及排序可知，排在前8位的是S15、S6、S3、S10、S14、S12、S1、S4。兩種分析結果均表明，Ci值及ri值排名均靠后的樣品是S13、S11、S7，表明這3批樣品的綜合質量相對較差。

3 討論

3.1 含量測定指標的選擇

蒙藥三子散由訶子、梔子、川楝子三味藥材等量配比混合而成。研究表明酚酸類沒食子酸、莽草酸，鞣質類訶子酸、鞣花酸、黃酮類、三萜類等是訶子的主要活性成分[16]。梔子的化學成分包括環烯醚萜類京尼平苷、梔子苷，單萜苷類jasminoside B，有機酸類咖啡酸等多種化合物，其中環烯醚萜是梔子主要的生物活性成分[17]。川楝子中含有多種類型的化合物，包括三萜、木脂素、黃酮及其他類成分[18]，三萜類化合物是其發揮藥效主要的活性成分，但三萜類化學成分紫外吸收較弱或存在末端吸收，因此在本試驗條件下訶子和梔子中的化學成分對其干擾大，難以對其準確定量，同時，考慮到方中三味藥材均含有黃酮類成分，成分專屬性不強。在課題組前期三子散HPLC 指紋圖譜研究的基礎上，結合化學模式識別分析結果[12]，選定訶子中沒食子酸、訶子次酸、石榴皮鞣素、安石榴苷、柯里拉京、訶子鞣酸、1，2，3，4，6-O-沒食子酰葡萄糖、訶子林鞣酸、鞣花酸，梔子中京尼平苷、jasminoside B、咖啡酸這12 種含量較高的成分作為三子散含量測定的指標成分。

3.2 結果評價

從15批三子散樣品中12種待測成分的含量測定結果來看，各成分含量均存在一定的批間差異，分析其原因可能是中蒙藥含量易受藥材產地、生長環境、采收期等影響，導致其內在質量產生了很大差異。15批三子散中訶子鞣酸、京尼平苷含量較高，jasminoside B、訶子林鞣酸含量差距較大，GRA和TOPSIS分析結果基本一致，根據TOPSIS分析所得Ci值和GRA分析所得ri值可知，樣品編號為S1、S3、S4、S6、S10、S12、S14、S15在所有樣品中排名前8，這為區分不同批號的產品提供了一種有效的方法。

綜上所述，本研究采用HPLC法同時測定三子散中12種活性成分的含量，并嘗試將GRA分析法與 TOPSIS 數學模型結合對不同批次三子散含量檢測數據進行綜合評價。該方法準確、簡便，具有多重質量控制效果，可以為三子散在生產、儲存及檢驗等過程中的質量控制提供方法和依據，為進一步完善三子散的質量標準提供參考。