Zn 脅迫下玉蟬花的耐性和富集轉運

于雪澤，郭王子杰，宋 紅

（東北林業大學園林學院, 黑龍江 哈爾濱 150040）

隨著重工業的大力發展，土壤重金屬污染也日益嚴重。我國《全國土壤污染狀況調查公報》[1]顯示，全國土壤超標率達到16.1%，鋅點位超標率為0.9%，耕地土壤環境質量堪憂，工礦業廢棄地土壤環境問題突出。鋅(Zinc，Zn)作為植物生長發育過程必需的微量元素之一，在生長激素、碳酸酐酶、葉綠素、RNA 聚合酶等物質合成的過程中發揮著重要作用[2]，少量存在時可以促進植物生長，一旦大量積累就會產生毒害。研究發現，植物可以通過滲透調節物質以及啟動抗氧化酶系統來適應逆境[3]。八仙花[4](Hydrangea macrophylla)在1 200 mg·kg-1七 水硫酸鋅脅迫處理下，通過上調超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性，有效地清除活性氧來緩解過量Zn 對植物體的傷害，以應對Zn 脅迫。植物具有監測環境潛在污染物并富集吸收的能力，目前，植物修復技術是被認為最有效、最安全、最有發展前景的重金屬土壤污染的修復治理方法，而觀賞植物因美觀性較強、居民接受度較高，更具有植物修復的潛力[5]。

玉蟬花(Iris ensata)又名紫花鳶尾、東北鳶尾，是多年生草本植物，以黑龍江、遼寧和吉林東三省為主要分布地區，耐寒性強?；ㄉ钭仙?，色彩典雅，雍容華貴，是極好的園林景觀應用花卉植物，具有廣闊的應用前景。目前對于玉蟬花的研究大多是種質資源保存利用、切花保鮮、水晶花制作和組織擴繁體系等。在重金屬抗性方面，劉歡等[6]、薄偉等[7]豐富了玉蟬在銅鎘、鉛脅迫下的研究。但玉蟬在Zn 脅迫下的研究鮮有報道。為此，本研究采用基質栽培法，探究玉蟬花在Zn 脅迫下的生理生化變化和富集特征，為玉蟬花在不同含量Zn 污染的土壤上栽培提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試材料為玉蟬花種子，采集于東北林業大學校園內。

試驗使用的基質為草炭土和珍珠巖(V ∶ V = 4 ∶ 1)，土壤pH 5.2，全氮含量0.664%，有效磷含量56.4 mg·kg-1，速 效 鉀 含 量101 mg·kg-1，鋅 含 量390.9 mg·kg-1，鎳含量11.2 mg·kg-1。供試金屬離子以分析純的ZnSO4·7H2O 添加；設置5 個Zn 處理濃度(0、200、500、1 000、2 000 mg·kg-1，相應編號為CK、Zn200、Zn500、Zn1000、Zn2000)，以去離子水溶液為對照，每個處理設5 個重復。容器為塑料花盆(上直徑33 cm，下直徑28.5 cm，高21 cm)，含1 kg 培育基質(CK 為無污染基質)，底部套塑料袋防止溶液流出。按照濃度配制重金屬溶液，噴入培育基質中，拌勻，平衡50 d后備用。

1.2 指標測定及方法

試驗于2022 年3 月－9 月在東北林業大學園林學院試驗溫室和園林學院實驗室內進行。選取籽粒飽滿、無病蟲害的玉蟬種子在40 ℃溫水下浸泡24 h 后，用0.5%的高錳酸鉀溶液消毒10 min，去離子水沖洗3 遍，吸干水分，放置在鋪有去離子水浸濕的濾紙的培養皿中，置于光照培養箱中。待種子露白后，播種至穴盤培養40 d，選取長勢一致、生長健壯的幼苗帶土坨移栽至平衡后的土壤中，定期澆水使土壤的田間持水量保持在60%～70%。脅迫40 d后，測定各指標。

形態指標和生物量的測定：采用完全收獲法，隨機選取各處理的幼苗使用卷尺測量株高(從根莖處至最長的葉片葉尖的距離)、根長(從根莖處至最長的根根尖處的距離)、葉寬(最長葉的寬度)，使用LI-3000A 葉面積儀測量葉面積(最長葉的葉面積)；將采集的植物分為地上部分和地下部分，置于70 ℃烘箱中烘干至恒重后，用分析天平測量干質量。烘干后的植物粉碎過篩，參考孫延東等[8]的方法，采用HNO3-HClO4法進行消解后使用電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-OES)測定植物體內鋅含量。參考黃曉辰[9]、王雨琦[10]、唐敏等[11]的方法，采用差速離心法進行Zn 亞細胞組分測定。

隨機選取幼苗新鮮葉片，測定生理生化指標。采用乙醇提取法[12]測定葉綠素含量，參照陳愛葵等[13]方法測定相對電導率，硫代巴比妥酸顯色法[12]測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，氮藍四唑法[12]測定SOD 活性。POD、CAT 活性采用蘇州夢犀生物醫藥科技有限公司試劑盒測定。在晴天上午09:00－11:00 采 用LI-6400XT 光 合 儀(LI-COR，美國)測定葉片的凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、氣孔導度(stomatal conductance，Gs)、胞間CO2濃 度(intercellular CO2concentration，Ci)、蒸 騰 速 率(transpiration rate，Tr)，以光合儀內置照明為可變光源，設 置 光 強1 000 μmol·(m2·s)-1，儀 器 流 速500 μmol·s-1，外接二氧化碳緩沖瓶，二氧化碳濃度與外界保持一致(450～500 μmol·mol-1)，溫度為28 ℃。

1.3 數據分析

采用SPSS 25.0 軟件進行數據處理和分析，對不同濃度脅迫處理進行單因素方差分析，并用Duncan法對數據進行多重比較。采用Origin 2021 繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 Zn 脅迫對玉蟬花生長的影響

2.1.1 Zn 脅迫對玉蟬花生物量和根冠比的影響

隨著脅迫濃度增加，玉蟬花的地下部分、地上部分生物量均呈現逐漸減少的趨勢(表1)，各處理與CK 間差異顯著(P＜ 0.05)，在Zn2000處理下生物量最低，地下、地上生物量分別僅為CK 的7.74%、8.62%；而根冠比整體呈現先升高后降低的趨勢，在Zn1000時最大，與CK 和其他3 個處理組之間差異顯著(P＜ 0.05)。

表1 Zn 脅迫對玉蟬花生長的影響Table 1 The effects of Zn stress on the growth of Iris ensata

2.1.2 Zn 脅迫對玉蟬花株高和根長的影響

Zn 濃度越高，玉蟬花生長受到的抑制作用越大，植株越矮小(表1)。與CK 相比，Zn200、Zn500、Zn1000、Zn2000的株高分別減少了26.13%、34.05%、66.46%、65.24%；隨著Zn 濃度增加，根長呈先減少后增加再減少的趨勢，在Zn200、Zn1000、Zn2000時較CK 分別減少了6.21%、40.08%、69.60%，而在Zn500時增加了12.90%。

2.1.3 Zn 脅迫對玉蟬花葉寬、葉面積的影響

玉蟬花葉片隨著脅迫濃度的升高逐漸變窄(表1)，在Zn200、Zn500時均比CK 減少了21.92%，兩組葉片寬度相同；而在Zn1000、Zn2000葉寬降幅增大，與CK相比分別顯著降低了49.32%和68.49% (P＜ 0.05)；葉面積也隨著脅迫濃度升高呈逐漸變小的趨勢，與CK相比，Zn200、Zn500、Zn1000、Zn2000分別降低了22.26%、23.77%、44.81%、65.07%，各處理與CK 間呈現顯著差異(P＜ 0.05)，Zn200與Zn500間差異不顯著(P＞ 0.05) 。

2.2 Zn 脅迫對玉蟬花光合作用的影響

2.2.1 Zn 脅迫對玉蟬花光合氣體交換參數的影響

Pn與Tr和Gs隨著脅迫濃度的升高均表現出相似的下降趨勢，并且在最高濃度處理時數值達到最低(圖1)。在Zn2000時，玉蟬花幼苗的Pn、Tr、Gs均顯著低于對照(P＜ 0.05)，分別降低了89.85%、78.97%、77.04%；然而，Ci隨Zn 濃度的升高呈現逐漸增大的趨勢，各處理間均差異顯著，分別比CK 增加了1.15、1.25、1.32、1.37 倍。

圖1 Zn 脅迫對玉蟬葉片光合氣體交換參數的影響Figure 1 The effects of Zn stress on photosynthetic gas exchange parameters in the leaves of Iris ensata

2.2.2 Zn 脅迫對玉蟬花葉綠素含量的影響

各處理組的葉綠素a 含量均低于CK，并隨著處理濃度的升高表現為逐漸減少的趨勢(表2)。Zn200、Zn500與CK 相比降幅不大，差異不顯著(P＞0.05)，兩者葉綠素a 含量分別為CK 的98.95%、90.53%；高濃度時降幅增大，Zn1000、Zn2000處理組含量分別為CK 的65.26%、62.11%，與CK 相比顯著下降(P＜0.05)。葉綠素b 含量表現為先小幅度增加后降低，在Zn200時含量最高，但并未與CK 組有顯著差異；Zn2000時含量最低，較CK 下降了35.29%。隨著脅迫增強，總葉綠素含量呈現逐漸降低的趨勢，在最高脅迫濃度時有最小值；Zn200與CK 間差異不大(P＞0.05)，僅降低了0.78%；Zn500、Zn1000、Zn2000與CK相比分別下降了9.30%、29.46%、36.43%。葉綠素a/b 隨著脅迫濃度的升高表現出不同程度的降低。Zn1000較CK 下降了20.71%，降低幅度最大，與CK有顯著差異(P＜ 0.05)，Zn200、Zn500、Zn2000與CK 相比降幅較小，差異不顯著(P＞ 0.05)。

表2 Zn 脅迫對玉蟬花葉綠素含量的影響Table 2 The effects of Zn stress on the chlorophyll content of Iris ensata

2.3 Zn 脅迫對玉蟬花丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響

隨著處理濃度的增加，玉蟬體內MDA 含量總體呈遞增趨勢(圖2)。Zn200較CK 顯著增加了32.66%(P＜ 0.05)；Zn500、Zn1000、Zn2000與CK 差異顯著(P＜0.05)，分別為CK 的1.69、1.81、2.28 倍。

圖2 Zn 脅迫對玉蟬花丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響Figure 2 The effects of Zn stress on the malondialdehyde content and antioxidant enzyme activities of Iris ensata

隨著脅迫濃度的增加，各處理的SOD 活性與CK 相比均有不同程度的升高(圖2)，差異顯著(P＜0.05)。在最大濃度Zn2000達到最大值，是CK 的1.44倍。Zn200、Zn500、Zn1000之間差異不顯著(P＞ 0.05)，與CK 相比分別增長了21.01%、18.93%、28.59%。

隨著Zn 濃度的升高，玉蟬葉的POD 活性呈現先升高后降低的變化趨勢(圖2)，在Zn1000處理下最大，為0.09 U·g-1。Zn500和Zn2000處理間差異不顯著(P＞ 0.05)，其余處理組之間差異顯著(P＜ 0.05)，所有處理組分別是CK 的1.85、2.35、4.75、2.31 倍。

CAT 的變化趨勢與SOD 和POD 明顯不同(圖2)。在Zn2000時CAT 活性最低，在Zn1000時活性最高，Zn500和Zn1000分別高于CK 16.64%和20.29%，Zn200和Zn2000分別低于CK 17.76%和26.97%；各處理組與CK 差異不顯著(P＞ 0.05)。

3 玉蟬花對Zn 的富集轉運研究

3.1 玉蟬花對Zn 的富集轉運

隨著Zn 脅迫濃度的升高，玉蟬花地上、地下部分富集量均呈逐漸增大的趨勢，在最高脅迫濃度時最大(表3)。但玉蟬不同部位對Zn 的富集效果存在差異，地下部分富集量明顯高于地上部分富集量，前者的富集量是后者的1.37 倍～8.43 倍。在Zn 處理下，轉運系數的范圍為0.12～0.73，隨著濃度增加呈逐漸上升趨勢，在2 000 mg·kg-1時達最大。

表3 Zn 脅迫下玉蟬花中Zn 的富集轉運Table 3 Concentration and translocation of Zn in Iris ensata under Zn stress

3.2 玉蟬花體內Zn 亞細胞分布

不同濃度Zn 脅迫下，玉蟬花的地上部分亞細胞組分中Zn 含量不同。Zn200和Zn2000表現出FCW(細胞壁組分) ＞ FS (可溶性組分) ＞ FCO (細胞器組分)，即Zn 在低濃度和高濃度時主要存在于玉蟬花地上部分的細胞壁和可溶性物質中，在2 000 mg·kg-1時兩者存在的Zn 含量占比分別達到75.54%和20.12%(表4)。Zn 在細胞器中含量較少，在200 mg·kg-1處理時未在細胞器中檢測到，但在500、1 000 mg·kg-1時占比較多，分別達到10.81%、6.25%；而地下部分Zn 的亞細胞分布表現為：在Zn200低濃度處理時，玉蟬花鋅亞細胞分布表現與地上部分相同，即FCW ＞FS ＞ FCO，細 胞 壁 中Zn 含 量 大 于 可 溶 性 物 質 中Zn 含量，占比分別為46.34%和44.51%，還有9.15%Zn 存在于細胞器組分中；隨著脅迫的增強，在500 mg·kg-1及以上濃度時則表現為FS ＞ FCW ＞ FCO，即絕大部分的Zn 都被貯存于可溶性組分中，為46.11%～52.21%；其次是細胞壁部分，所占比例33.01%～41.02%。只有極少部分存在于細胞器組分中，僅有6.77%～19.77%。

表4 Zn 脅迫下玉蟬花亞細胞組分中Zn 濃度Table 4 Zinc concentrations in the subcellular components of Iris ensata under zinc stress μg·mL-1

4 討論

Zn 是植物生長發育的必需微量元素，但其含量超過閾值時會抑制植物光合作用、呼吸作用、細胞分裂等必須的生理活動，導致植物生長受損，受到毒害[14]。在本研究中，大多數生長指標(株高、葉寬、葉面積)和各生物量(地上、地下)顯著低于CK(P＜ 0.05)，玉蟬幼苗的生長發育在不同濃度的Zn 脅迫下均受到明顯抑制。在Zn2000最高濃度脅迫下，植株高度僅為CK 的35%；葉片卷曲，失綠明顯。這說明重金屬濃度越高，植物受到的毒害越強。

光合作用是植物體重要的生理生化過程，它的強弱對植物正常生長、產量及抗逆性都具有十分重要的影響，因而光合作用可以作為判斷植物生長和抗逆性大小的指標。在本研究中， Tr與Pn和Gs顯著降低，而Ci呈現逐漸升高的趨勢，說明玉蟬光合速率的降低是非氣孔限制的因素[15-16]。這與甘龍等[17]在苘麻(Abutilon theophrasti)的研究結果相似。研究中受高濃度脅迫的玉蟬花葉片萎黃嚴重，是Zn 過量的明顯癥狀之一。這可能是由于相似的離子半徑，Zn2+取代了Fe2+、Mg2+，與葉綠體蛋白質上的巰基結合，破壞葉綠素的結構和功能，導致葉綠素分解加快，含量降低[14]。葉綠素a 含量與總葉綠素含量都隨著處理濃度的增加表現出明顯下降趨勢，這與易心鈺等[18]在蓖麻上(Ricinus communis)的研究結果一致。與葉綠素總量相比，葉綠素a/b 值是衡量葉片感受重金屬的相對敏感的一個生理指標[19]。本研究中，葉綠素a 含量最先遭到破壞，下降速率最大。盡管葉綠素b 的含量在低濃度時小幅增高，但在濃度大于Zn200時還是與葉綠素a/b 值一樣呈持續下降趨勢。產生這種現象的原因可能是葉綠素b 起著重要的吸收和傳遞光能的作用，在逆境中的植物會相應提高葉綠素b 含量以避免光抑制，可能是植物應對Zn 脅迫的一種自身保護機制[20]。受到重金屬毒害的植物體積累了大量的活性氧自由基，加劇膜脂質過氧化程度，同時形成MDA。植物體內的MDA 含量在一定程度上體現了細胞的受傷害程度，含量越高，植物受到的傷害越顯著[21]。研究中MDA 含量隨著Zn 濃度增大而升高，且不同濃度的脅迫均與CK 組有顯著差異。表明玉蟬花細胞膜脂質過氧化加重，活性氧自由基積累過量，細胞膜透性增加，植物體受損嚴重。這與余國源等[22]對傘房決明(Cassia corymbosa)的研究結果一致。植物體內存在抗氧化酶系統，當受到逆境脅迫時植物通過SOD、POD、CAT 在內的抗氧化酶系統協同作用來清除逆境脅迫造成的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，從而降低對植物體的傷害[7]。SOD 可以抑制羥基自由基等有毒物質的形成，將超氧陰離子自由基歧化為H2O2和O2；POD、CAT 又能進一步將SOD 的歧化產物H2O2，轉化為對植物無害的H2O 和O2[23]。本研究中，隨著脅迫濃度的增加，各處理組的SOD 活性均顯著高于CK，在Zn2000時達到最大。這與Pb 脅迫下金絲草(Pogonatherum crinitum)[24]根系抗氧化酶活性“先升后降”的結果有所不同，這是因為發揮作用的酶類型可能是Cu, Zn-SOD 酶，Zn 作為輔助因子促使SOD 合成，使得SOD 酶活性持續升高來緩解活性氧自由基對質膜系統的過氧化作用，這與Wang 和Jin[25]對玉米(Zea mays)的研究結果相似。POD 活性呈現先增后減的趨勢，在Zn200、Zn500、Zn1000時含量持續升高，在Zn2000時大幅度下降，說明Zn 在一定濃度范圍時，被激活后的POD 活性上升，可以清除組織中存在的少量H2O2。當Zn 濃度增大，細胞膜受傷程度加重，抗氧化酶系統受損，不能被及時清除的H2O2等有害物質大量積累，導致POD 活性急劇下降。當脅迫發生時，植物會提高自身抗性來抵御不利的環境，但當逆境壓力超過植物的耐受極限時，機體防御機制也會遭到破壞，這與謝勇和王友紹[26]的研究結果相似。CAT 與POD 有著類似的功能，共同承擔著清除活性氧、保護細胞膜結構的作用，使植物體維持正常的膜滲透[27]。但在本研究中CAT 的變化趨勢與POD 不同。當玉蟬遭受低濃度脅迫時，CAT 并未第一時間被激活，此時植物體內CAT 含量低于CK。但隨著濃度增加，開始呈先上升后下降的趨勢，Zn1000時活性最強，最高濃度脅迫CAT 活性低于最低濃度脅迫時的活性。說明當脅迫超出植物體的耐受限度時，抗氧化酶系統不足以抵御外界環境的壓力，迫使酶活性降低。此研究結果與王琳等[23]對菖蒲(Acorus calamus)的研究結果類似。此外在本研究中，POD 與CAT 在參與H2O2的轉化過程中有一定的差別，CAT 與POD相比，激活較慢。

在本研究中，玉蟬花對重金屬Zn 的富集量隨著脅迫濃度的增加而增大，并在最高濃度處理時達到吸收頂峰。根作為最先接觸到重金屬離子的器官，也是貯存重金屬的重要場所，在不同濃度的Zn 脅迫下玉蟬地下部分的富集量始終高于地上部分。這是由于根系細胞壁由果膠、纖維素、半纖維素、細胞壁蛋白等多種組分組成，其中果膠和半纖維素被認為是細胞壁結合重金屬的主要組分。去甲酯后的果膠帶有大量的羧基負電荷，對二價、三價的金屬離子親和力大大增強，可以吸附過量的Zn2+從而避免進入細胞內部，減輕對玉蟬的傷害[28]。半纖維素的成分和結構決定了它不僅可以發揮加固細胞壁的功能，同時也是植物細胞壁固定金屬離子的重要結合位點[29]。陳世寶等[30]發現，去除半纖維素后,不同植物的細胞壁對鋅的吸附能力大大降低，吸附量顯著下降。植物根系通過果膠和半纖維素對重金屬的吸附，將絕大多數金屬離子積累在根中，有效阻緩了Zn2+向地上部分和環境遷移，弱化了鋅對植物的毒害。Zn 是必需的微量元素，植物體內正常的Zn 含量為20～150 mg·kg-1[31]。本研究中玉蟬花富集的Zn 的含量遠高于正常條件下的Zn 含量，說明除了根系細胞壁的固持作用減少了Zn 向上轉運之外，植物體內應有著相應的解毒機制。結合亞細胞分布來看，細胞壁和可溶性組分是玉蟬花貯存重金屬的重要場所。絕大部分的Zn 都貯存于可溶性組分中，這可能是因為植物為了緩解重金屬毒害，將重金屬離子在液泡內進行區隔化來降低細胞中重金屬離子的水平，加強對Zn 的耐性。目前研究發現，液泡是積累包括鋅、鎘在內的許多重金屬的場所[32]。除液泡的區隔化作用之外，植物絡合素(phytochelatin synthase, PCs)和金屬硫蛋白(metallothioneins, MTs)也可以緩解重金屬的毒害[33]，這可能是玉蟬花主要的耐性機制。本研究中，玉蟬轉運系數隨著重金屬濃度的增加而逐漸增大，最大值為0.733。說明玉蟬花對Zn 的轉運能力不強，大多數還是限制在根部，但其運輸機制未遭到破壞，并沒有限制對Zn 的向上運輸。Baker 等[34]認為，能富集超過10 000 mg·kg-1的Zn 含量且地上部分重金屬含量 ＞ 地下部分(轉運系數 ＞ 1)的植物就稱為Zn 超富集植物。在Zn 濃度為2 000 mg·kg-1的土壤中，玉蟬總富集含量高達15 844.44 mg·kg-1，但地下部分富集量大于地上部分，分別為9 154.85 和6 689.59 mg·kg-1。所以玉蟬花不是Zn 超富集植物，但具有一定的富集能力。

5 結論

隨著土壤中Zn 濃度的升高，玉蟬花受到的傷害逐漸加重：在形態上，植株表現為株高變矮、根長縮短、葉片變窄且失綠卷曲，生物量也隨之減??；玉蟬花能通過上調超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性來應對Zn 脅迫，但過量重金屬進入植物體內細胞膜造成傷害，丙二醛含量升高，植株體內一系列生理生化反應發生變化，總葉綠素含量降低、光合速率減慢，導致植物生長物質能量減少，抑制了玉蟬花生長；在富集和轉運上，玉蟬花體內Zn 含量呈上升趨勢，但地下部分的重金屬含量始終高于地上部分，可見玉蟬花對Zn 的轉運能力不強，不屬于超富集植物。從亞細胞分布來看，地上部分細胞壁結合了大部分Zn，地下部分的Zn 主要積累在細胞壁和可溶性組分中。綜上所述，可為進一步提高玉蟬花耐Zn 能力研究奠定基礎，從而擴大玉蟬花在不同污染區的園林應用范圍。